人白細胞介素-26慢病毒表達質粒與基因敲除質粒的構建及其在HEK293T細胞中的活性驗證

周海金，吳珊，劉麗媛，蔣丹，許濤，藍華滔，舒緯童，徐廣賢，

1.廣東醫科大學醫學技術學院醫學檢驗系，廣東東莞 523000；

2.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏銀川 750004

白細胞介素（interleukin，IL）-26 又稱AK155，最早在皰疹病毒感染的人類T 細胞過表達產物中發現［1］。其在染色體上定位于12q15，位于IL-22和干擾素γ（interferon γ，IFNγ）基因之間，包含5 個外顯子；IL-26基因全長516 bp，編碼171 個氨基酸，相對分子質量為19 842.7，與IL-10 有24.7%的同源氨基酸序列，47.0%的相似性，是IL-10 細胞因子家族成員［2］。

作為一種新興的細胞因子，IL-26 因其獨特的氨基酸組成和空間結構，具有常規和非常規細胞因子的特征［3］。一方面，IL-26 通過結合相應的受體復合物（IL-20R1、IL-10R2 形成的異二聚體）參與下游信號轉導，使STAT效應蛋白（STATI和STAT3）磷酸化，誘導下游靶基因（IL-10、IL-8、CD54等）的轉錄，從而啟動一系列生理反應［4-5］。盡管IL-10R2 廣泛表達于各類細胞中，但IL-20R1卻僅限于上皮細胞［6］，在免疫細胞中并不存在IL-20R1受體，但研究表明，IL-26仍可調控免疫細胞發揮功能［7］。另一方面，IL-26具有非常規陽離子和兩親性的特性，能直接作為抗菌肽與病原微生物表面的陰離子物質發生作用，進而殺死細胞外細菌［8］，甚者與受損細胞釋放到細胞外的DNA或病原體DNA形成復合物，實現免疫防御作用［9］。

目前，對于IL-26在疾病包括感染性疾病和自身免疫性疾病等方面的作用已有部分研究［10］，但其作用機制仍不明確。自噬（autophagy）是真核細胞存在的一種高度保守的代謝過程，是細胞內的一種“自食（self-eating）”現象［11］。作為細胞內的主要降解途徑，該過程將胞內物質運輸到溶酶體內降解。已有研究表明［8］，IL-26 通過IFN基因的細胞質DNA 受體刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）誘導自噬，進一步促進吞噬溶酶體的融合，從而降低細菌的生存能力。

自噬在結核分枝桿菌胞內存活及其固有免疫中起重要作用［12］，本課題組前期研究發現，結核病患者血清中IL-26 濃度較健康者顯著降低，而結核患者外周血單核細胞IL-26mRNA 水平較健康者反而升高。這與此前GUERRA-LASO 等［13］發現結核分枝桿菌感染的單核細胞中IL-26mRNA 和血清中IL-26 水平均顯著降低的結果有所出入，也表明IL-26 在結核病中的作用機制不很明確。為了探究IL-26 通過調控細胞信號通路對細胞自噬的作用及其機制，本研究旨在構建人IL-26基因的過表達及敲除載體，并初步預測分析其結構、功能和亞細胞定位，為后續具體研究IL-26 蛋白的功能和機制奠定實驗和理論基礎。

1 材料與方法

1.1質粒及細胞株 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和lentiCRISPRv2 質粒購自美國Addgene 公司；人胚胎腎細胞（HEK293T）購自美國ATCC 細胞庫；大腸埃希菌DH5α 感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2主要試劑 限制性核酸內切酶BsmBⅠ購自美國NEB 公司；限制性核酸內切酶EcoRⅠ和NotⅠ、T4連接酶及退火緩沖液均購自北京寶日醫生物技術公司；質粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；質粒轉染試劑PEI（polyethylenimine linear）購自上海翌圣生物科技公司；Trizol總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；SYBR Green PCR Kit 熒光定量試劑盒購自德國QIAGEN 公司；全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE 上樣緩沖液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、4%多聚甲醛和BSA 購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人IL-26 多克隆抗體購自美國SAB 公司；鼠源抗β-actin單克隆抗體、HRP 標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG購自美國CST公司；Alexa Flour 594標記的羊抗兔lgG購自美國Proteintech公司。

1.3引物設計及合成 根據GenBank中登錄的人IL-26基因（NM_018402.2）中編碼區（sequence coding for aminoacids in protein，CDS）及pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 的多克隆位點，選擇合適的酶切位點，利用SnapGene 4.24 軟件設計2 對引物，見表1。其中，內側上游引物在其5′端引入EcoRⅠ酶切位點和保護堿基CCG，內側下游引物5′端引入NotⅠ酶切位點和保護堿基AAGGAAAAAA。引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

表1 IL-26表達質粒引物Tab.1 Primers for IL-26 expression plasmid

1.4sgRNA 設計及合成 利用NCBI 數據庫獲取IL-26的序列，IL-26基因位于12 號染色體上，具有5 個外顯子區。針對其1號外顯子和3號外顯子區序列，利用sgRNA 在線設計網站（http：／／crispor.tefor.net／）分別設計2 對靶向敲除IL-26基因序列sgRNA，并選擇評分最高的2 條sgRNA 序列，見圖1。其正義鏈模板的5′端引入CACC，反義鏈模板的5′端引入AAAC，使BsmBⅠ酶切后能形成黏性末端互補，見表2。

圖1 IL-26 sgRNA的設計Fig.1 Design of IL-26 sgRNAs

表2 IL-26 sgRNA引物Tab.2 Primers for IL-26 sgRNAs

1.5IL-26基因過表達質粒的構建

1.5.1目的基因的擴增 抽取健康人5 mL 新鮮外周血于EDTA 抗凝管中，密度梯度離心法分離人外周單個核細胞，Trizol 法提取細胞總RNA，以逆轉錄試劑盒中的隨機引物合成cDNA，以其為模板，巢式PCR擴增目的基因。外側引物擴增，反應條件：95 ℃3 min；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃40 s，共40 個循環；72 ℃5 min。PCR 產物稀釋500 倍，以此為模板進行內側引物擴增，反應條件：95 ℃3 min；95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃40 s，共35 個循環；72 ℃5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 產物，膠回收試劑盒對目的片段進行純化。

1.5.2過表達質粒的構建 將2μg質粒pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP 和純化的PCR 片段分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切4 h，膠回收純化。純化后的PCR 片段與線性質粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 按摩爾數10∶1 的體系16 ℃過夜連接，連接產物轉化大腸埃希菌DH5α 感受態細胞，接種于含150 μg／mL 氨芐青霉素的LB 固體培養基中，37 ℃過夜培養。次日挑取單菌落的一半用于菌落PCR 初步篩選，陽性菌挑另一半菌落過夜培養并小提質粒。提取的質粒經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定后，送通用生物（安徽）股份有限公司測序驗證。

1.5.3細胞轉染及熒光顯微鏡觀察 將狀態良好的HEK293T 細胞接種于12 孔板中，置于37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養過夜，待細胞密度達70%以上時，按照PEI 轉染試劑說明書操作轉染2 μg 過表達質粒，24 h后顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.5.4轉染細胞中IL-26mRNA 表達的檢測 采用qRT-PCR 法。質粒轉染效率達60% ～70%后，繼續培養24 h，收集細胞，Trizol 法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，以其為模板進行PCR 擴增。反應體系：cDNA 1 μL，上下游引物各1.4 μL，SYBR green Super Mix 10 μL，ROX 2 μL，DEPC Water 4.2 μL。反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個循環；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，熔解曲線形成。IL-26及GAPDH引物見表3。以正常HEK-293T 細胞為對照，每組設3 個復孔，重復3 次。根據擴增曲線得到相應的Ct值，采用2-ΔΔCt相對定量法計算相應的mRNA表達水平。

1.5.5轉染細胞中IL-26蛋白表達的檢測 采用Western blot 法。質粒轉染細胞48 h 后，收集細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，經12%SDS-PAGE 分離蛋白，轉移至PVDF 膜上。用5% BSA 室溫封閉1 h；TBST 洗滌3 次，每次5 min，加入兔抗人IL-26 多克隆抗體（1∶2 000 稀釋）和鼠源抗β-actin 單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃過夜孵育；TBST洗滌3次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（均1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗滌3 次，每次10 min，進行ECL 發光試劑反應并成像。試驗重復3 次，使用ImageJ分析灰度值。

1.6IL-26基因敲除質粒的構建

1.6.1sgRNA Oligo 退火 合成的sgRNA Oligo 序列退火成雙鏈DNA，退火體系：Oligo1（100 μmol／L）10μL，Oligo2（100μmol／L）10μL，5×Annealing buffer 10μL，ddH2O 20μL。退火條件：37 ℃30 min→95 ℃10 min→95 ℃以2 ℃／min 降至25 ℃，將退火后的產物用水按1∶100稀釋，-20 ℃保存備用。

1.6.2sgRNA-Cas9 質粒的構建 將2 μg lentiCRISPRv2 質粒用BsmBⅠ限制酶酶切線性化，膠回收產物，與稀釋的退火Oligo 引物按摩爾比1∶5 16 ℃過夜連接；連接產物轉化至大腸埃希菌DH5α 感受態細胞中，接種于含150 μg／mL 氨芐青霉素的LB 固體培養基中，37 ℃過夜培養；次日挑取單菌落的一半用于菌落PCR 初步篩選，陽性菌液送通用生物（安徽）股份有限公司測序，陽性菌挑另一半菌落過夜培養并小提質粒。在載體U6 啟動子附近設計引物，檢測引物序列Vector F：5′-AGGGACAGCAGAGATCCAGT-3′；Vector R：5′-ACGGCGACTACTGCACTTAT-3′。由于BsmBⅠ限制酶酶切掉了載體1 885 bp 片段，以重組載體作為模板的擴增產物大小為618 bp。

1.6.3sgRNA 敲除驗證 將狀態良好的HEK293T 細胞提前1天接種至12孔細胞板中，24 h后細胞密度達70%以上后，將構建好的敲除載體sgRNA1-1、sgRNA1-2、sgRNA3-1、sgRNA3-2 和lentiCRISPRv2（陰性對照）進行轉染。轉染48 h后收集細胞，BCA法測定總蛋白濃度，Western blot 法檢測sgRNAs 對IL-26 的敲除效果（具體方法參考1.5.5）。試驗重復3次。

1.7IL-26 蛋白的氨基酸序列分析及結構預測 從NCBI 數據庫獲取IL-26 的氨基酸序列，利用在線工具EXPASY、SWISS-MODEL、TMHMM、PSI-BLAST，SignalP 4.0 Server 等分析IL-26 的氨基酸構成、信號肽、跨膜結構以及蛋白的二、三級結構預測等。

1.8IL-26蛋白的亞細胞定位觀察 將1×105個狀態良好的HEK293T 細胞接種于含爬片的24 孔板中，第2天待細胞貼壁后，PEI 轉染1 μgIL-26過表達質粒。轉染24 h 后，將24 孔板置于水平離心機中，550 ×g離心30 min使細胞完全貼壁，棄上清，PBS洗滌3次，每次3 min，加入4%多聚甲醛，固定15 min；PBS 洗滌3 次，每次5 min，0.2% TritonX-100 的PBS 透化細胞膜10 min；PBS 洗滌3 次，加入免疫熒光封閉液，200 μL／孔，室溫封閉1 h；PBS 洗滌3 次，加入兔抗人IL-26多克隆抗體（1∶250稀釋），200μL／孔，4 ℃過夜孵育；PBS洗滌3次，每次5 min，加入Alexa Flour 594 標記的羊抗兔IgG（1∶100 稀釋），200 μL／孔，室溫避光孵育1 h；PBS 洗滌3 次，每次10 min，滴加200 μL DAPI 染液，室溫避光孵育15 min；PBS 洗滌4 次，每次10 min，用抗熒光淬滅劑封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察IL-26蛋白的定位情況。

1.9統計學分析 應用SPSS Statistics 26.0 軟件進行統計學分析，實驗數據均以均數± 標準差（±s）表示。組間比較用獨立樣本t檢驗，以α=0.05 為檢驗標準，P＜0.05 為差異有統計學意義。應用Graph-Pad Prism 8.02作圖。

2 結 果

2.1IL-26基因過表達質粒的鑒定

2.1.1IL-26基因擴增產物的鑒定 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，第1 次外側引物擴增出671 bp 的片段，第2 次內側引物擴增出516 bp 的條帶，大小均與預期一致。見圖2。

圖2 IL-26基因PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile of PCR products of IL-26 gene

2.1.2過表達質粒的菌落PCR、酶切及測序鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，菌落PCR 產物可見大小約500 bp的目的條帶，見圖3。陽性菌提取的質粒經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，可見7 367 bp 的載體條帶和516 bp 的目的基因條帶，見圖4。測序結果顯示，IL-26序列正確插入載體中，過表達質粒構建正確，見圖5。

圖3 過表達質粒的菌落PCR鑒定Fig.3 Colony PCR identification of overexpression plasmid

圖4 過表達質粒的雙酶切（EcoRⅠ／NotⅠ）鑒定Fig.4 Restriction map of overexpression plasmid（EcoRⅠ／NotⅠ）

圖5 IL-26過表達質粒部分測序結果Fig.5 Partial sequencing results of IL-26 overexpression plasmid

2.1.3轉染細胞的熒光顯微鏡觀察 過表達質粒轉染HEK293T 細胞48 h 后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，見圖6，表明轉染成功。

圖6 過表達質粒轉染細胞的熒光顯微鏡觀察Fig.6 Fluorescence microscopy of cells transfected with overexpression plasmid

2.1.4轉染細胞中IL-26mRNA的表達 RT-PCR結果顯示，過表達組IL-26基因mRNA相對表達量（656.789）較正常對照組（1.000）升高了656.789 倍，差異有統計學意義（t=17.976，P＜0.000 1）。

2.1.5轉染細胞中IL-26蛋白的表達 Western blot結果顯示，過表達組IL-26 蛋白的相對表達量（0.977）較正常對照組（0.494）增加了1.978 倍，差異有統計學意義（t=7.859，P＜0.001），見圖7。

圖7 過表達質粒轉染細胞的Western blot鑒定Fig.7 Western blot identification of cells transfected with overexpression plasmid

2.2IL-26基因敲除質粒的鑒定 單菌落PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約600 bp的特異性片段，見圖8；陽性菌液測序結果進一步表明sgRNA序列及其位置和方向均正確，4個基因敲除質粒均構建成功，見圖9。Western blott分析顯示，sgRNA1-1和sgRNA1-2 的敲除效果不佳，敲除倍數分別為0.930和0.980倍，其原因可能與敲除靶點的選擇或sgRNA的脫靶效應有關；而sgRNA3-1 和sgRNA3-2 有一定的敲除效果，敲除倍數分別為0.523 3和0.316 9倍，其中sgRNA3-2 的敲除效率差異有統計學意義（t=7.440，P＜0.001），敲除效果最好。見圖10和11。

圖8 IL-26基因敲除質粒的菌落PCR鑒定Fig.8 Colony PCR identification of IL-26 gene knockout plasmid

圖9 IL-26基因敲除質粒的測序結果Fig.9 Sequencing results of IL-26 gene knockout plasmid

圖10 基因敲除質粒轉染細胞的Western blot鑒定Fig.10 Western blot identification of cells transfected with gene knockout plasmid

圖11 灰度值分析Fig.11 Analysis of gray value

2.3IL-26 蛋白的氨基酸序列分析 ExPASy 在線軟件分析顯示，IL-26編碼171個氨基酸，預測分子量為19 842.7，預測理論等電點為10.00，正電荷殘基總數為31，負電荷殘基總數為12，原子組成為C、H、N、O、S，分子式為C898H1469N245O237S11，原子總數為2 860，其疏水指數為100.99，總平均親水性為-0.083。SignalP 4.0 Server軟件分析顯示，剪切位點評分（C-score）、信號肽區域評分（S-score）及C-score 和S-score 的幾何平均數（Y-score）評分均在閾值之上，標準值（D）為0.847，大于閾值0.450，推測IL-26蛋白存在信號肽，見圖12。經CBS 網站的在線軟件分析表明，前22 個氨基酸有明顯的跨膜功能，其N-端預測的跨膜螺旋是其信號肽結構，見圖13。

圖12 IL-26蛋白的信號肽預測Fig.12 Prediction of IL-26 protein signal peptide

圖13 IL-26蛋白的跨膜區預測Fig.13 Prediction of transmembrane region of IL-26 protein

2.4IL-26蛋白結構的預測 通過SOPMA 預測IL-26蛋白的二級結構顯示，α-螺旋（Hh）134個，占78.36%；β-轉角（Tt）7個，占4.09%；無規則卷曲（Cc）30個，占17.54%。見圖14。氨基酸相似域曲線分析結果表明，IL-26 蛋白主要為異亮氨酸、賴氨酸，其次為絲氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸和苯丙氨酸。通過在線工具Swiss-Model構建出IL-26蛋白的三維結構，見圖15。

圖14 IL-26蛋白的二級結構預測Fig.14 Prediction of secondary structure of IL-26 protein

圖15 IL-26蛋白的三級結構預測Fig.15 Prediction of tertiary structure of IL-26 protein

2.5IL-26蛋白的亞細胞定位 經PSI-BLAST在線分析IL-26 蛋白的亞細胞定位，預測結果表明，IL-26 主要存在于細胞質中（79.58%）。激光共聚焦結果進一步表明，IL-26存在于細胞質中，見圖16。

圖16 IL-26蛋白亞細胞定位的激光共聚焦顯微鏡觀察Fig.16 Laser confocal microscopy of subcellular localization of IL-26 protein

3 討論

近年來，IL-26 在自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病中受到越來越多的關注［14］。BRILLAND 等［15］研究發現，系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血清IL-26水平顯著高于健康組，而且活動性SLE疾病患者IL-26水平也顯著高于非活動性SLE疾病患者，提示IL-26 水平變化可能作為一種SLE 患者活動性疾病識別的潛在生物標志物。NIU 等［16］發現，惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）患者胸腔積液IL-26 水平相比同源外周血（peripheral blood，PB）顯著升高，MPE 患者生存曲線預測結果表明，IL-26蛋白累積越多的患者，其生存率越低。ITOH等［17］研究發現，IL-26 與新鑒定的受體EphA3 相互作用，激活EGFR-TKI 旁路通路的AKT 和JNK 信號通路，抑制EGFR-TKI 誘導的內質網應激，進一步導致了三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的發展，揭示了TNBC 中EGFR-TKI 耐藥（吉非替尼）的新機制。既往研究表明，類風濕性關節炎［18］、銀屑?。?9］、克羅恩?。?0］、慢性HCV 感染［21］等疾病患者中均出現了IL-26因子上調，這些研究均表明IL-26是自身免疫疾病和慢性感染炎癥疾病的重要調節因子。

本研究采用分子克隆技術成功構建了IL-26基因真核過表達質粒，轉染HEK293T細胞后，IL-26mRNA和蛋白表達水平均明顯升高。同時利用CRIPSR／Cas9技術針對IL-261 號和3 號外顯子區各設計了2 條sgRNA，構建了IL-26基因敲除質粒。HEK293T 細胞源于人胚胎腎細胞［22］，自身能夠表達內源性IL-26蛋白，因此直接轉染293T 細胞進行敲除驗證。在敲除驗證過程中，Western blot鑒定IL-26蛋白敲除結果較順利，但采用RT-qPCR 檢測IL-26mRNA 變化水平時發現，敲除組和對照組差異不大?？紤]到CRISPR／Cas9 的敲除機理基于sgRNA 的靶向和Cas9 的剪切引起DNA 斷裂［23］，進而導致細胞的非同源重組修復的發生，僅僅是導致其mRNA 發生移碼突變，引起蛋白翻譯和功能發揮錯誤，其mRNA 水平存在變化不大的情況［24］。在構建的4個敲除質粒中，Exon1sgRNA1和Exon1sgRNA2 并未表現出敲除效果，而Exon3 sgRNA1 和Exon3sgRNA2 表現出較好的敲除效果，其中Exon3sgRNA2敲除效率最佳。敲除靶點的選擇或sgRNA 脫靶效應可能是導致無明顯敲除效果的原因。因此，本研究中人IL-26基因過表達和敲除質粒的成功構建，為后續IL-26的機制研究奠定了基礎。

同時，通過一系列生物信息學軟件分析表明，IL-26 蛋白由171 個氨基酸組成，分子量為19 842.7，理論等電點為10.00，正電荷殘基總數為31，負電荷殘基總數為12，IL-26 含有帶正電的氨基酸（賴氨酸或精氨酸），賦予IL-26不同尋常的物理化學性質，能夠直接結合病原微生物表面的陰離子物質，從而破壞細胞膜的完整性。IL-26 蛋白信號肽的預測和跨膜結構分析，互相佐證了IL-26蛋白的前22個氨基酸存在信號肽結構，且具有一定的跨膜功能，提示前端結構與IL-26 亞細胞定位密切相關，維持著IL-26 蛋白完整的空間結構。IL-26 蛋白的二級結構分析顯示，α-螺旋（Hh）134 個，占78.36%；β-轉角（Tt）7 個，占4.09%；無規則卷曲（Cc）30 個，占17.54%，同時三維建模揭示了分子結構6 個螺旋體和4 個保守的半胱氨酸殘基；分子結構表面上的靜電勢為全局正電，更重要的是，其螺旋結構表現出兩親性，具有親水表面和由帶正電殘基組成的親水表面，帶正電的氨基酸結構賦予了IL-26 結合DNA 特性［25］。結合間接免疫熒光結果顯示，IL-26 蛋白亞細胞定位于細胞質中，表明IL-26蛋白能直接參與細胞內的功能活動。

綜上所述，本研究成功構建和驗證了人IL-26基因真核過表達質粒和敲除質粒，并通過生物信息學分析了蛋白的特性，亞細胞定位研究表明其分布在細胞質中，為后續其作用機制的研究奠定了基礎。