偽狂犬病病毒gH糖蛋白在哺乳動物細胞中的表達及其免疫原性

喻曉航，劉一寧，丁彥彬，羅燁，方琪，鄭金，余興龍

1.湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙 410128；

2.湖南兀邦生物科技有限公司，湖南長沙 410128

偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動物以發熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性傳染病。在PRV 的諸多感染宿主中，以豬的感染率和發病率最高，病毒可潛伏于三叉神經節或骶神經節造成潛伏感染，使病豬長期帶毒，難以根除［1］。該病曾是嚴重威脅全球養豬業發展的主要傳染病之一，但在歐、美等國家20 世紀90 年代啟動根除計劃后，已無PR疫情。我國主要使用弱毒活疫苗對PR 進行防控，目前我國PR 的流行已不再嚴重，可進入凈化階段，而疫病凈化的后期，一般主張不再接種具有感染性的活疫苗，而應接種滅活苗或基因工程亞單位疫苗。

PRV屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）皰疹病毒α-亞科成員，為雙股DNA病毒，基因組大小約150 000 bp，至少含有75 個開放閱讀框［2］。在PRV 已鑒定的11種糖蛋白中，gB、gD、gH、gL 和gK 是病毒復制所必需的糖蛋白［3］，目前已知的PRV 保護性抗原有gB、gC和gD［4-6］，大多數PRV 亞單位疫苗的研發以這3 種抗原為主［7-9］，但至今尚無可供應用的基因工程亞單位疫苗，因此仍需繼續研究。gH 是病毒感染細胞所必需的糖蛋白［10］，其保守性較好［11］，在病毒入侵細胞后與gL形成二聚體促進膜融合［12］。PRV在缺失gH后，難以在細胞上產生有效的感染［13］。因此，gH也可能存在誘導動物免疫保護應答并作為亞單位疫苗的潛質，而至今尚無gH的免疫保護性研究。為此，本研究利用哺乳動物細胞表達gH 抗原，制備PRV-gH 重組亞單位疫苗，并評估新型疫苗的免疫保護效果。

1 材料與方法

1.1質粒、細胞及病毒 pIRES-neo3 真核表達載體、懸浮馴化的HEK-293F細胞和PRV-XiangA 毒株［14］均由湖南農業大學分子生物與免疫學實驗室保存；大腸埃希菌Top10 感受態（G6015）細胞購自上海昂羽生物技術有限公司。

1.2實驗動物 SPF 級ICR 小鼠16 只，雌性，4 周齡，體質量18 ～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：430727220100703443。本實驗以科研為目的對小鼠進行養殖和使用，并按照中華人民共和國《實驗動物管理條例》進行動物實驗。

1.3主要試劑SteadyPure病毒DNA／RNA 提取試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；引物和高保真I5-MIX 購自北京擎科生物科技有限公司；去內毒素質粒大提試劑盒（DP117）購自天根生化科技（北京）有限公司；Ni Focurose 6FF（TED）介質購自武漢匯研生物科技股份有限公司；HRP 標記的山羊抗鼠IgG（ab6789）和山羊抗豬IgG（ab6911）均購自英國Abcam 公司；TMB 底物和終止液均購自美國KPL 公司；轉染試劑PEI MAX（24765-1）購自美國Polysciences 公司；OPM-293 CD05 無血清培養基購自上海奧浦邁生物科技股份有限公司；SuperSignal West Pico PLUS ECL顯色液購自美國Thermo Fisher公司；DMEM購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012）購自上海碧云天生物技術有限公司；MontaniedTmISA 201 VG購自法國Seppic公司。

1.4gH基因的擴增及重組表達質粒的構建 根據跨膜區預測網站（https：／／dtu.biolib.com／DeepTMHMM）預測結果，去除gH（GenBank：KF711986.1）氨基酸序列的跨膜區（C-端42 aa），并設計克隆引物。引物序列如下：gH-fp：5′-GGAATTCGCCACCATGCCCGCGTCGTCCGTGCG-3′（陰影部分為Kozak序列，下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點），gH-rp：5′-CGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCACGGGCGCGAGCCGCGTCG-3′（陰影部分為His-標簽，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。用DNA 提取試劑盒提取PRV-XiangA 毒株基因組，以其為模板，利用上述引物擴增gH基因序列。使用高保真MIX，反應條件為：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性15 s，61 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環；72 ℃再延伸5 min。按常規方法將PCR 產物克隆于pIRES-neo3載體EcoRⅠ和BamHⅠ之間，構建重組表達質粒pIRES-gH，并送北京擎科生物科技有限公司測序驗證。將測序驗證正確的重組表達質粒轉化至大腸埃希菌Top10 感受態細胞中，接種于200 mL 氨芐青霉素抗性（終濃度為100 μg／mL）的LB 培養基中放大培養，37 ℃搖菌培養12 h。用無內毒素試劑盒提取質粒并測定濃度，于-20 ℃保存備用。

1.5目的蛋白的誘導表達及鑒定 從液氮中取出已懸浮馴化的HEK-293F 細胞，按常規方法復蘇，經3 次傳代，細胞狀態良好時進行轉染。參照洪坡等［15］轉染與表達PDGFR-β／Fc 蛋白的最佳條件，將重組表達質粒pIRES-gH轉染至HEK-293F 細胞中，并懸浮培養5 d。取細胞表達上清，進行Western blot 鑒定：樣品經12% SDS-PAGE 后轉移至PVDF 膜（280 mA，40 min），用5% BSA 配制的封閉液4 ℃封閉過夜；加入豬血清［16］（PRV中和效價為1∶256，長沙市某規模豬場提供，1∶100 稀釋），37 ℃孵育2 h；加入HRP 標記的山羊抗豬IgG（1∶12 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；ECL顯色液顯色。

1.6重組蛋白的純化 收集培養5 d 的100 mL 細胞上清，參照羅燁等［17］親和層析方法純化蛋白，并進行12%SDS-PAGE鑒定。其中純化介質為Ni Focurose 6FF（TED）；平衡液為Bingding Buffer（20 mmol／L Tris-HCl，20 mmol／L NaCl，pH 8.0）；洗脫液為不同咪唑濃度（100、200、500 mmol／L）的Bingding Buffer。BCA蛋白定量試劑盒測定純化的gH蛋白濃度。

1.7動物分組及免疫 將gH 抗原與ISA 201 VG 佐劑按1∶1混合后充分乳化制備成亞單位疫苗，疫苗中gH抗原含量為10μg／mL。將16只ICR小鼠隨機分為2組：實驗組和對照組，每組8只，實驗組小鼠經大腿外側肌肉注射100μL gH亞單位疫苗，對照組免疫等量佐劑。初次免疫后5 和8 周各加強免疫1 次，并分別于初次免疫后4、7、10 周經眼球內眥靜脈采血，分離血清，于-20 ℃保存。

1.8免疫小鼠血清抗體的檢測

1.8.1特異性抗體 采用間接ELISA法，按常規方法進行［17］。其中gH 抗原包被量為200 ng／孔；待檢血清按1∶100稀釋；HRP標記的山羊抗鼠IgG（ab6789）按1∶12 000稀釋。一抗和二抗的孵育時間均為30 min，底物孵育時間為15 min，酶標儀測定終點滴定的吸光度值（A450）。

1.8.2中和抗體 取初次免疫后10 周的血清樣本，于56 ℃熱滅活30 min，設3 組平行對照，由于小鼠血清量少，從8 倍開始稀釋，稀釋后的血清按常規方法進行中和試驗［16］。

1.9小鼠攻毒保護試驗 第3 次采血2 d 后，使用PRV-XiangA 毒株（1.5×104TCID50）對小鼠進行滴鼻攻毒，每日觀察小鼠發病及死亡情況，小鼠一旦發病，會在24 h內死亡。小鼠從發病到死亡一般經歷4個階段：①鼻部紅腫，飲欲食欲增加；②鼻部瘙癢并撓出血，精神興奮；③瘙癢面積擴大至面部，被毛凌亂；④精神沉郁并瀕臨死亡。

1.10統計學分析 使用GraphPad Prism 8 軟件two-way ANOVA對實驗數據進行統計學分析，數據采用均值± 標準差（±s）表示，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1PRVgH基因擴增產物及重組質粒的鑒定gH基因PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 976 bp的特異片段，大小與預期一致，見圖1。重組表達質粒pIRES-gH經測序鑒定，與目的序列一致。

圖1 PRV gH基因PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR amplification products of PRV gH gene

2.2表達產物的鑒定 Western blot 分析顯示，在相對分子質量約75 000 處可見gH 蛋白特異性表達條帶，而gH 的氨基酸序列相對分子質量只有68 000，表明PRV gH 蛋白成功在哺乳動物細胞中表達并進行了糖基化修飾，且與PRV陽性血清反應信號較強，反應原性良好。見圖2。

圖2 表達產物的Western blot鑒定Fig.2 Western blotting of expression product

2.3純化產物的鑒定 12%SDS-PAGE 分析顯示，收集的細胞上清純化后，在相對分子質量約75 000 處可見明顯的gH 蛋白特異性條帶，見圖3。經BCA 蛋白定量試劑盒測定，100 mL培養上清中含625μg gH蛋白。

圖3 純化產物的SDS-PAGE鑒定Fig.3 SDS-PAGE profile of purified product

2.4免疫小鼠血清抗體效價

2.4.1特異性抗體 對照組血清的A450為0.07，s為0.008，經計算，臨界值（+3s）為0.094。根據臨界值判斷，初次免疫后所有實驗組小鼠血清gH 抗體均為陽性，A450平均值達1.1；加強免疫后，實驗組小鼠血清gH 抗體水平顯著升高，7 和10 周平均A450分別為2.6 和2.75，顯著高于4 周（t分別為10.34 和10.38，P均＜0.000 1），7 與10 周比較，差異無統計學意義（t=1.037，P＞0.05）。

2.4.2中和抗體 初次免疫后10周，對照組小鼠血清中無中和抗體；而實驗組小鼠血清均產生中和抗體，效價在1∶12 ～1∶256之間，有3只小鼠效價為1∶48。

2.5小鼠攻毒保護試驗 對照組小鼠平均發病時間為53 h，并全部發病死亡；實驗組小鼠平均發病時間為63 h，死亡一半，免疫保護率為50%（4／8）。見圖4。

圖4 小鼠攻毒后生存曲線Fig.4 Survival curve of mice after challenge

3 討論

膜融合是囊膜病毒感染和進入細胞的關鍵，PRV 囊膜蛋白融合機制需要蛋白gB 和gH／gL 復合體的參與［12］，雖然gH／gL 復合物在皰疹病毒膜融合中的作用尚不明確，但已有研究表明，gH 囊膜蛋白對PRV 進入靶細胞是必需的［10］。在動物體內，gH 對于PRV穿透三叉神經的一級神經元以及向二級神經元的局部擴散和跨神經元轉移也是必不可少的，其支配著鼻腔黏膜的交感和副交感神經通路［18］，因此，gH誘導的免疫應答對控制以呼吸道傳播為主的PRV感染可能有特別作用。

在前人的研究中，主要使用桿狀病毒、腺病毒或哺乳動物表達系統表達了PRV 的gB、gD 和gC 抗原，并發現gB 與gD 為最優保護性抗原［4-9］，而至今尚無對gH 抗原免疫保護性的研究。本研究使用的ISA 201 VG水包油包水型（W／O／W）佐劑在不少獸用疫苗研究性試驗中被采用，該佐劑表現出較好的抗原遞呈能力，能快速引起免疫應答，產生高水平的抗體，并延長抗原在體內停留時間［19-21］。為了確保小鼠有足夠的gH抗體產生，本研究采用3次免疫，為了充分發揮佐劑使抗原停留體內時間較長的特性，1次免疫和2 次免疫間隔時間較長，為5 周，2 次免疫后，小鼠抗體水平較1次免疫后明顯升高，但3次免疫后抗體上升幅度不大。為了避免采血過量對小鼠免疫應答造成影響，同時參考前人免疫實驗結果，即動物免疫前期中和抗體效價較低［22-23］，本研究僅第3次采血量較多以進行中和抗體效價測定，結果顯示，所有經gH免疫的小鼠均產生了中和抗體。使用PRV-XiangA毒株攻毒后，小鼠只要發病就會死亡。最終，gH免疫組小鼠存活一半，保護率為50%，且死亡小鼠平均發病時間為63 h；而對照組小鼠平均發病時間更短（為53 h），且所有小鼠均死亡。

在ZHANG 等［5］的研究中，亞單位疫苗gB、gC 和gD免疫鼠中和抗體效價分別可達1∶8 ～1∶16、1∶4 ～1∶8 和1∶32 ～1∶64；在LI 等［24］的研究中，亞單位疫苗gB與gD免疫鼠中和抗體效價分別可達1∶32 ～1∶64 和1∶64 ～1∶128。而本研究中gH 免疫小鼠所產生的平均中和抗體效價為1∶64 ～1∶128，與前人研究中亞單位疫苗產生的中和抗體效價相近。同時，在上述研究中，gB、gD和gC疫苗保護效力分別可達100%、50% ～87.5%和50%，本實驗初步研究也達到了50%的保護率。本研究后續將優化抗原使用量、免疫程序以及篩選更合適的佐劑，以提高其免疫保護效果。

本研究使用哺乳動物表達系統表達的PRV-gH重組蛋白可誘導小鼠產生有效的特異性中和抗體，降低小鼠PRV 攻毒后的死亡率。這是首次對gH 抗原免疫保護性研究，同時也表明gH 蛋白具有作為PRV 亞單位疫苗的潛力。本研究為研制安全高效的PRV 亞單位疫苗提供了不同的候選抗原，為我國PR的防控與凈化提供了新的手段。