鵝糞便中副干酪乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌的分離及鑒定

高炳南，岳學青，王秋菊，曹雨涵，任雨龍，孫愉，魏笑，張昊

黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163311

我國是養殖大國，2019 年生豬出欄量6.85 億頭，肉牛出欄量0.45 億頭，家禽146.4 萬只，共生產肉制品7 759.5 萬噸［1］。養殖過程中抗生素的大量使用及濫用成為人們關注的重要食品安全問題之一。為了盡快減少使用獸用抗生素，2017 年6 月22日，我國農業部發布了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017—2020年）》，以促進抗生素藥物逐步退出市場［2］。因此，安全的抗生素替代品成為畜牧業研究的重點。益生菌具有促進消化、改善養殖環境、抗菌作用、增強動物免疫力和促進生長發育的功能，且不產生耐藥性，給藥簡單，可自我繁殖，用量較少［3］，有望成為抗生素替代品。我國2014年2 月1 日起實施的《飼料添加劑品種目錄（2013）》中，微生物菌種共有46種［4］。

副干酪乳酸桿菌是革蘭陽性細菌，兼性厭氧、無運動、無芽孢的桿菌或長桿菌，具有較好的耐酸、耐膽鹽能力，且可為腸道提供屏障作用［5］。副干酪乳酸桿菌可產生有機酸、細菌素和苯乳酸等，可有效減少致病微生物的侵襲，不僅具有良好的抗氧化能力，還可減少TNF-α、IL-6、IFN-g、IL-12 等促炎細胞因子的分泌，從而緩解腸道炎性反應［6］。OSMAN 等［7］用副干酪乳酸桿菌飼喂高脂白鼠，結果表明，副干酪乳酸桿菌通過促進谷胱甘肽過氧化物酶及過氧化氫酶等產生，加快脂肪代謝，可作為抗血脂異常藥的替代品。

枯草芽孢桿菌是一類需氧革蘭陽性菌，呈圓柱狀，無莢膜，可運動，可形成芽孢?？莶菅挎邨U菌繁殖時需要消耗大量氧氣，可促進腸道內厭氧菌生長，如雙歧桿菌、乳酸桿菌；且可抑制大腸埃希菌、沙門菌和葡萄球菌等致病菌的生長［8］。CHEN等［9］利用枯草芽孢桿菌亞種（Bacillus subtilisvar.nattoN21，BAC）和釀酒酵母Y10（Saccharomyces cerevisiaeY10，SAC）對液體飼料發酵（fermented liquid feed，FLF）后，飼喂朗德鵝，可提高其生長速度和采食量，調節腸道生態，降低血膽固醇濃度，改善器官和胸肌的抗氧化狀態。WANG 等［10］通過飼喂錳和枯草芽孢桿菌可改善46 周齡成鵝的生產性能、蛋品質、抗氧化能力和腸道菌群的構建。上述結果表明，枯草芽孢桿菌可促進動物的生長。本研究旨在從北方白鵝體內分離獲得副干酪乳酸桿菌亞種（Lactobacillus paracasei subsp）和枯草芽孢桿菌KA9（Bacillus subtilisKA9），并評估其生長和耐酸耐膽鹽特性及抗生素耐受性，以期為鵝源微生態制劑提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1樣品 采集于黑龍江省某種鵝場，選擇30 只52周齡雄性北方白鵝，采食后30 min，于白鵝泄殖腔外掛糞便采集盒，收集無污染的新鮮糞便，置冰袋冷凍保存。

1.2培養基 MRS培養基（貨號：HB0384）、甘露醇卵黃多黏菌素培養基（貨號：HB0248）、LB 培養基（貨號：HB0128）和NA 培養基（貨號：HB0109）均購自青島海博生物技術有限公司。

1.3抗生素 β 內酰胺類（阿莫西林、氨芐西林、亞胺培南、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南、哌拉西林）、四環素類（四環素）、喹諾酮類（左氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星）、氨基糖苷類（阿米卡星、鏈霉素、慶大霉素）、氯霉素類（氯霉素）抗生素藥片均購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.4菌株的分離 無菌條件下取糞便1 g，于9 mL生理鹽水中，混勻，制備為混合液，取100 μL，用生理鹽水進行10-5、10-6和10-7稀釋。各稀釋度分別取100μL，分別采用MRS 和甘露醇卵黃多黏菌素培養基培養，于37 ℃恒溫培養箱內培養48 h；挑選奶白色光滑（副干酪乳酸桿菌）及黃色（枯草芽孢桿菌）菌落，分別接種至MRS 和甘露醇卵黃多黏菌素平板，繼續培養48 h，獲得純化菌株，用30%甘油保存。將副干酪乳酸桿菌及枯草芽孢桿菌純化菌株分別用LB 培養基和NA 培養基培養，經革蘭染色進行初篩；通過牛津杯法檢測初篩菌株對E.coli的抑菌特性，選擇抑菌效果最好的副干酪乳酸桿菌及枯草芽孢桿菌，分別編號為S00834-8 和IS00439-2，用于后續試驗。

1.5菌株的鑒定 以文獻［11］中擴增細菌16S DNA V3區的引物為擴增引物，357f：5′-GC clamp-TACGGGAGGCAGCAG-3′，519r：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。煮沸法提取1.4項獲得的2株菌株DNA，以其為模板進行PCR擴增，擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S DNA 測序，將獲得的微生物DNA 序列與NCBI 基因庫進行比對，應用MEGA 7 軟件構建系統進化樹，DNAstar 11.0 軟件中MegAlign 程序進行同源性比較。

1.6益生菌生長特性的檢測

1.6.1時間特性 取S00834-8 和IS00439-2 菌株，按2.0%接種于100 mL LB液體培養基（pH 7.0）中，以未接種的LB液體培養基作為空白對照，37 ℃，150 r／min培養48 h，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36 和48 h 取培養液，用紫外可見分光光度計測定A600。

1.6.2溫度特性 取S00834-8 和IS00439-2 菌株，按2.0%接種于100 mL LB 液體培養基（pH 7.0）中，以未接種的LB 液體培養基作為空白對照，分別于34、36、37、38、40 ℃，150 r／min培養24 h，用紫外可見分光光度計測定A600。

1.6.3酸堿特性 取S00834-8 和IS00439-2 菌株，按2.0%接種于100 mL LB液體培養基中，培養基pH分別調節為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，以未接種的LB液體培養基作為空白對照，37 ℃，150 r／min培養24 h，用紫外可見分光光度計測定A600。

1.6.4耐酸耐膽鹽特性 取S00834-8 和IS00439-2菌株，按2.0%接種于100 mL 不同pH（2.0、2.5、3.0、3.5、7.0）及不同膽鹽濃度（0、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%）的LB液體培養基，以未接種的LB液體培養基作為空白對照組，均于37 ℃，150 r／min 培養24 h，用紫外可見分光光度計測定A600。

1.6.5抗生素耐受性 將NA 培養基經高壓滅菌后，倒入培養皿內，分別涂布100μL S00834-8和IS00439-2菌液（活菌數≥1 × 109cfu／mL），將1. 3 項中的抗生素藥片輕輕按壓至培養基上，37 ℃恒溫培細胞養箱培養24 h，測量抑菌圈直徑。按美國SCLA 抗微生物敏感性試驗執行標準M100 判定菌株的抗生素耐受性，見表1。

表1 菌株抗生素耐受性的判定標準Tab.1 Judgment criteria of antibiotic resistance of strains

1.7數據分析 應用Excel 2010 初步整理試驗數據，GraphPad Prim 8.0軟件繪圖。

2 結果

2.1益生菌的篩選及鑒定 分離獲得的菌株經革蘭染色檢測，呈短桿狀鏈狀排列，為副干酪乳酸桿菌；菌體長而細分散或成對出現，單體呈圓，為枯草芽孢桿菌。見圖1。牛津杯法檢測結果表明，抑菌圈直徑越大，其對E.coli抑制程度越強，2 個菌株均在濃度1×107cfu／mL 時的抑菌圈直徑最大，見圖2。

圖1 益生菌菌體形態的鏡下觀察（革蘭染色，×1 000）Fig.1 Microscopy of probiotics cell morphology（Gram staining，×1 000）

圖2 牛津杯法檢測益生菌對大腸埃希菌的抑菌特性Fig.2 Detection of antibacterial characteristics of probiotics against E.coli by oxford cup method

2.2菌株的鑒定 S00834-8和IS00439-2菌株DNA擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見1 750 bp的目的條帶，大小與預期一致，見圖3。測序結果表明，S00834-8 菌株與乳酸桿菌屬中副干酪乳酸桿菌亞種耐受性H（MG818769.1）的同源性為97.1%；IS00439-2 菌株與芽孢桿菌屬中枯草芽孢桿菌KA9（MT491101.1）的同源性為100%。見圖4、表2和表3。

圖3 S00834-8和IS00439-2菌株DNA PCR產物電泳圖Fig.3 Electrophoretic profile of DNA PCR products of strains S00834-8 and IS00439-2

圖4 S00834-8菌株（A）及IS00439-2菌株（B）的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains S00834-8（A）and IS00439-2（B）

表2 S00834-8菌株的同源性比較（%）Tab.2 Homology comparison of strains S00834-8（%）

表3 IS00439-2菌株的同源性比較（%）Tab.3 Homology comparison of strains and IS00439-2（%）

2.3益生菌生長特性

2.3.1時間特性 S00834-8 及IS00439-2 菌株分別于12 及8 h 達對數生長期，細胞濃度平穩，見圖5。因此，S00834-8和IS00439-2菌株分別至少培養12和8 h才能獲得最多活菌數。

圖5 S00834-8和IS00439-2菌株的生長曲線Fig.5 Growth curve of strains S00834-8 and IS00439-2

2.3.2溫度特性 S00834-8 菌株于34～40 ℃培養的A600分別為1.993、1.993、2.412、1.993、1.945，IS00439-2菌株的A600分別為1.390、1.771、1.409、1.389、1.343。S00834-8 及IS00439-2 菌株分別于37 和36 ℃的A600最大，因此，確定37和36 ℃分別為S00834-8及IS00439-2菌株的最適培養溫度。

2.3.3酸堿特性 S00834-8菌株在pH為5.5～8.0范圍內的A600分別為2.116、2.241、2.016、1.969、1.962和1.946，IS00439-2 菌株的A600分別為1.016、1.112、1.208、1.383、1.469和1.456。S00834-8及IS00439-2菌株分別于pH 6.0和7.5時A600最高，表明pH 6.0和7.5分別為S00834-8和IS00439-2菌株生長的最適pH。

2.3.4耐酸耐膽鹽特性 S00834-8及IS00439-2菌株pH 為3.5 時，菌濃度超過pH 7.0 時的半數，表明其具有良好的耐胃酸能力。S00834-8 及IS00439-2 菌株于1.5%、1.0%、0.5%、0.3%膽鹽中時，菌濃度均超過無膽鹽組菌濃度的一半，表明其具有良好的耐膽汁能力。見表4。

表4 益生菌對胃酸及膽鹽的耐受能力（A600）Tab.4 Resistance of probiotics to gastric acid and bile salt（A600）

2.3.5抗生素耐受性 S00834-8 菌株對β-內酰胺類抗生素中的哌拉西林中度敏感，其他藥物不敏感；對喹諾酮類抗生素中的左氟沙星敏感，諾氟沙星中度敏感，環丙沙星不敏感；對氨基糖苷類抗生素中的阿米卡星和慶大霉素中度敏感，鏈霉素敏感；對四環素類抗生素中的四環素中度敏感；對氯霉素類抗生素中的氯霉素敏感。 IS00439-2 菌株對β-內酰胺類抗生素中的哌拉西林敏感，頭孢呋辛中度敏感，其他藥物不敏感；對喹諾酮類抗生素中的左氟沙星中度敏感，諾氟沙星敏感，環丙沙星不敏感；對氨基糖苷類抗生素中的阿米卡星和慶大霉素不敏感，鏈霉素敏感；對四環素類抗生素中的四環素中度敏感；對氯霉素類抗生素中的氯霉素敏感。見表5。

表5 抗生素耐受性試驗結果Tab.5 Results of antibiotic resistance test

3 討論

副干酪乳酸桿菌亞種屬于乳桿菌屬中的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）群，是從干酪乳酸桿菌中分離出的一個新的亞種，主要應用于食品發酵、肉類儲藏和生物工程中［12］。副干酪乳酸桿菌不僅能夠產生有機酸、雙乙酰和過氧化氫，還能產生抑菌蛋白類活性物質細菌素。機體內副干酪乳酸桿菌亞種可促進產生IL-10、減少分泌IFNγ 和IL-4，并降低T 細胞數量，從而抑制免疫反應，減少炎性反應［12-15］?？莶菅挎邨U菌是一種飼用微生物添加劑，能夠提高飼料的適口性，改善胃腸道菌群區系，具有強大的抑菌性能，從而增強免疫力，激活腸道內的淋巴系統，促進免疫細胞的生成，且對動物無危害［16-18］?？莶菅挎邨U菌還可產生蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、脂肪酶和麥芽糖酶等蛋白質，從而促進動物腸道對飼料的消化吸收［19-20］。

微生物制劑需經由口腔進入消化道，并在經過胃液和膽汁后才能在腸道定植發揮作用。因此，S00834-8 和IS00439-2 菌株作為微生物制劑的候選菌株，需進行耐酸耐膽鹽測定。本研究結果表明，在pH 為3.5 和膽汁濃度為1.5%的條件下，S00834-8和IS00439-2 菌株仍保持較高的活菌數，表明其可定植在腸道發揮作用，這與其他相關研究的結果一致［21-22］。本研究結果顯示，在37 ℃，pH 為6.0的環境中培養12 h后，S00834-8菌株進入對數生長期，生長情況良好，與文獻［11］的研究結果一致。IS00439-2 菌株在8 h 達對數生長期，在36 ℃，pH 為7.5 的環境中生長情況良好，與文獻［23］的研究結果一致。

根據美國SCLA 抗微生物敏感性試驗執行標準M100進行菌株耐藥性判定，結果顯示，2株益生菌均對β 內酰胺類抗生素和青霉素類抗生素具有耐藥性，但S00834-8菌株對氨基糖苷類抗生素（阿米卡星）敏感，IS00439-2 菌株對該藥具有耐藥性。S00834-8菌株的檢測結果與尹珺伊等［24］對干酪乳酸桿菌抗生素耐受性的檢測結果相符，部分結果不同可能是由于菌種屬于同屬不同種，微生物自身攜帶的耐藥基因不同所導致的；IS00439-2 菌株的檢測結果與高娟娟等［25］對枯草芽孢桿菌抗生素耐受性檢測結果相符。

綜上所述，本研究從鵝糞便中分離獲得了副干酪乳酸桿菌亞種耐受型H S00834-8和枯草芽孢桿菌KA9 IS00439-2 益生菌，其對抗生素均具有不同程度的耐受性，有望與抗生素聯合應用于動物相關疾病的治療。