谷氨酰胺酶1抑制劑對四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化的影響

王曉，張聰聰，張燕紅，洪詩瑤，杜杰

1.山西醫科大學第一醫院核醫學科，山西太原 030001；

2.首都醫科大學附屬北京安貞醫院北京市心肺血管疾病研究所血管生物學研究室，北京 100029

肝纖維化是肝臟對各種慢性刺激損傷的修復反應，同時也是發展成肝硬化甚至肝癌的必經途徑［1-2］。肝纖維化主要由肝臟微環境改變引起細胞外基質的合成及降解失衡導致，具有漸進性及一定的可逆性，在適當階段加以治療和干預，可有效阻止甚至逆轉肝纖維化進程［3］。因此明確調控肝纖維化發生的分子機制，有助于尋找新的干預靶點。

介導谷氨酰胺代謝的谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）主要有2 種活性形式：一種是由谷氨酰胺酶1（GLS1）編碼的腎型谷氨酰胺酶（kidney-type glutaminase，KGA），正常情況下主要在腎臟表達；另一種是由GLS2 編碼的肝臟型谷氨酰胺酶（liver-type glutaminase，LGA），兩者在不同組織中分解谷氨酰胺產生谷氨酸并釋放氨用于尿素合成［4-5］。研究顯示，在正常肝組織中不表達GLS1，但在肝纖維化患者肝臟組織中GLS1 蛋白表達水平和活性顯著增加，而且主要在活化的肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）中表達［6-7］。GLS1表達水平與肝硬化程度呈正比。體外使用GLS1 抑制劑可顯著抑制HSCs 增殖及活化［7］。在膽堿缺乏加1%甲硫氨酸飲食誘導的非酒精性肝硬化小鼠模型中使用siRNA 法抑制GLS1 活性，可顯著減輕肝纖維化程度［8］。為進一步驗證GLS1 作為肝纖維化干預靶點的臨床轉化潛能，本研究探討了GLS1特異性抑制劑BPTES［bis-2-（5-phenylacetamido-1，3，4-thiadiazol-2-yl）ethyl sulfide］處理對四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導的小鼠肝臟纖維化模型肝纖維化相關表型的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF 級雄性C57BL／6J 小鼠，30 只，8 ～10 周齡，體質量20 ～25 g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2021-0010。本實驗均以科研為目的進行小鼠養殖和使用，且按照《北京市實驗動物福利倫理審查指南》相關規定進行（35892-2018）。

1.2主要試劑及儀器 CCl4、橄欖油購自美國Sigma公司；天狼猩紅染色液購自北京索萊寶科技有限公司；內源性過氧化物酶阻斷劑、羊血清封閉液、酶標山羊抗兔IgG 聚合物、DAB 顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗GLS1 單克隆抗體購自美國Abcam 公司；BPTES 購自美國Abmole 公司；Trizol總RNA 提取試劑購自美國Invitrogen 公司；mRNA 反轉錄試劑盒購自美國Promega 公司；2×SYBR Green qPCR Mix 購自日本TaKaRa 公司；Bio-RAD CFX Connect PCR儀購自美國Bio-RAD公司。

1.3肝纖維化動物模型的制備 參考文獻［9］方法進行。將小鼠隨機分為對照、模型、處理組，每組10只。對照組給予200μL 橄欖油，模型和處理組給予200 μL 10% CCl4（CCl4∶橄欖油= 1∶9），均經腹腔注射，每周2 次，共4 周，構建肝纖維化模型。BPTES處理組在建?；A上按照10 mg／kg 劑量經小鼠腹腔注射BPTES，每周2 次，末次注射48 h 后，處死小鼠，采用心臟灌流方式去除血液，收集肝臟組織，部分用甲醛溶液固定用于制備組織切片進行病理學分析，部分凍存于液氮中用于后續RNA提取。

1.4肝臟組織天狼猩紅染色 將肝臟組織石蠟切片脫蠟至水后，1×PBS緩沖液洗滌3次，滴加天狼猩紅染色液覆蓋組織，室溫孵育30 min；75%乙醇洗滌2次，無水乙醇10 min；二甲苯透明5 min；中性樹膠封片。用尼康ECLIPSE 90i顯微鏡采集圖像，采用NISElement軟件對陽性染色面積的比例進行統計分析。

1.5肝臟組織免疫組織化學染色 將肝臟組織石蠟切片脫蠟至水，1×PBS緩沖液洗滌3次，加入抗原修復液煮沸10 min；待切片變涼，1 × PBS 緩沖液洗滌3 次，加入內源性過氧化物酶阻斷劑處理20 min；1×PBS緩沖液洗滌3次，加入羊血清封閉液處理30 min；加入兔抗GLS1 單克隆抗體（1∶400 稀釋）覆蓋組織后，置4 ℃過夜；室溫平衡30 min；1×PBS緩沖液洗滌3次，加入酶標山羊抗兔IgG聚合物，20 ℃孵育30 min；1×PBS 緩沖液洗滌3 次，DAB 顯色，蘇木素染核，二甲苯透明，中性樹膠封片。用尼康ECLIPSE 90i顯微鏡采集圖像，采用NIS-Element 軟件對陽性染色面積的比例進行統計分析。

1.6纖維化相關基因表達水平檢測 采用qRT-PCR法檢測肌動蛋白2（actin alpha 2，Acta2）、Ⅰ型膠原α1（collagen typeⅠalpha1，Col1α1）及GLS1基因mRNA表達水平。用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA，Nanodrop2000檢測RNA濃度后，取5μg，反轉錄合成cDNA，以其為模板，利用引物（GLS上游引物序列：5′-CTACAGGATTGCGAACATCTGAT-3′，下游引物序列：5′-ACACCATCTGACGTT GTCTGA-3′；Col1α1上游引物序列：5′-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3′，下游引物序列：5′-CCACGTCTCACCATTGGGG-3′；Acta2上游引物序列：5′-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3′，下游引物序列：5′-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3′；GAPDH上游引物序列：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。引物由北京諾賽基因有限公司合成）進行qRT-PCR檢測。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃15 s，60 ℃45 s，共45 個循環。以GAPDH為內參，基因表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

1.7統計學分析 應用GraphPad Prism 7.00 軟件對實驗數據進行統計學分析。計量數據以均值±標準差（±s）表示，率以百分比表示。符合正態分布的兩組間比較采用非配對t檢驗，非正態分布的兩組間比較采用非參數檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CCl4誘導小鼠肝纖維化模型的建立 腹腔注射橄欖油或CCl44周后，大體觀察可見對照組小鼠肝臟組織表面光滑，質地軟，而模型組小鼠肝臟組織體積較對照組稍增大，表面不光滑，呈顆粒狀，質地稍韌。對照和模型組小鼠肝臟質量與脛骨長度的比值分別為0.078±0.005 和0.095±0.003，模型組比對照組顯著增加（t= 2.979，P= 0.031）。天狼猩紅染色結果顯示，對照和模型組小鼠肝臟組織中陽性面積分別為（0.62±0.09）%和（2.41±0.22）%，模型組小鼠肝臟組織中膠原含量比對照組顯著增加（t= 7.661，P＜0.01），并從匯管區向四周放射延伸，部分形成大小不一的假小葉結構。見圖1。表明小鼠肝纖維化模型制備成功。

圖1 CCl4誘導小鼠肝纖維化模型的建立Fig.1 Establishmentofliverfibrosismodelinduced byCCl4 in mice

2.2肝纖維化模型組織中膠原相關基因的表達水平對照和模型組小鼠肝臟組織中Atca2基因相對表達量分別為0.0008±0.0001、0.0024±0.0003，Col1α1基因相對表達量分別為0.0036 ± 0.0005、0.0237 ±0.0028；與對照組相比，模型組Atca2和Col1α1基因相對表達量均顯著增加，差異有統計學意義（t分別為4.335和5.319，P均＜0.01）。

2.3肝纖維化模型組織中GLS1表達水平對照組和模型組小鼠肝臟組織中GLS1基因相對表達量分別為0.000 2 ± 0.000 01、0.000 34 ± 0.000 03，與對照組相比，模型組顯著增加，差異有統計學意義（t=5.319，P＜0.01）。免疫組織化學染色結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝臟組織中GLS1 蛋白的表達水平顯著增加，差異有統計學意義（t=9.725，P＜0.01），且主要表達在纖維化區域。見圖2。

圖2 免疫組織化學染色法檢測肝臟組織中GLS1蛋白的表達水平（×200）Fig.2 Detection of expression level of GLS1 protein in liver tissue by immunohistochemical staining（×200）

2.4BPTES 處理對肝纖維化的影響 BPTES 處理組小鼠肝臟組織體積較模型組稍減小。天狼猩紅染色結果顯示，模型和BPTES 處理組小鼠肝臟組織中陽性面積分別為（2.85 ± 0.21）%和（1.17 ± 0.09）%，BPTES 處理組小鼠肝臟組織中膠原含量比模型組顯著減少，差異有統計學意義（t=7.427，P＜0.01）。見圖3。模型和BPTES 處理組小鼠肝臟組織中Atca2基因相對表達量分別為0.008 9±0.000 9、0.004 9±0.000 5，Col1α1基因相對表達量分別為0.51±0.07、0.31±0.04；與模型組相比，BPTES 處理組小鼠肝臟組織中Atca2和Col1α1基因相對表達量均顯著降低，差異有統計學意義（t分別為3.713 和2.628，P均＜0.05）。

圖3 BPTES處理對CCl4誘導的小鼠肝纖維化的影響Fig.3 Effect of BPTES treatment on liver fibrosis induced by CCl4 in mice

3 討論

肝纖維化是由各種致病因子引起肝內結締組織異常增生，導致肝內彌漫性細胞外基質過度沉積的病理過程，可發展為肝硬化、肝癌。明確其發病的分子機制有助于提供新的治療靶點。

HSCs 的激活是肝纖維化發展過程中的核心環節［10-11］。在靜息狀態下，HSCs 的主要功能為貯存和代謝維生素A、儲存脂滴與甘油三酯、分泌載脂蛋白A 等。當肝臟受到急性或慢性損傷時，HSCs 鄰近的肝細胞、內皮細胞、血小板以及免疫細胞等產生一系列細胞因子刺激HSCs 活化［12-13］?；罨腍SCs 內脂滴減少或消失，并表達具有收縮功能的α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），轉分化為具有較強增殖、遷移和分泌能力的肌成纖維細胞，合成更多細胞外基質沉積于肝組織間隙中，同時分泌抑制細胞外基質降解的基質金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）導致肝纖維化發生［14］。大量研究表明，抑制HSCs活化可延緩肝纖維化進程［15-17］。

本研究發現，CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型肝臟組織中GLS1 表達水平顯著增加，而且集中在肝纖維化區域，與既往在人肝硬化肝臟組織中研究發現的上調GLS1 主要定位在活化的HSCs 的結果一致，同時體外培養的人HSCs 在活化后表達GLS1 的水平顯著增加，用GLS1 抑制劑可顯著抑制HSCs 的增殖及分化［7］。后續有研究顯示，用siRNA的方式抑制非酒精性肝硬化模型中上調的GLS1，可顯著改善纖維化相關表型，提示GLS1 可作為肝纖維化治療的潛在靶點［8］。因此，本研究進一步使用GLS1 特異性抑制劑BPTES 在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中進行干預后檢測纖維化相關表型，結果顯示，抑制GLS1 可顯著減輕肝纖維化程度。

GLS1 作為抑制肝纖維化靶點的可能作用機制如下：①抑制HSCs 的增殖及活化。HSCs 轉分化為產生膠原的肌成纖維細胞的過程受谷氨酰胺代謝的調控。谷氨酰胺代謝的終產物α-酮戊二酸通過增強三羧酸循環的活性，從而滿足高增殖率的肌成纖維細胞用于生物合成所需ATP。抑制HSCs 的谷氨酰胺代謝活性可抑制線粒體氧化呼吸速率，以及細胞增殖、遷移和膠原合成［6］。②清除肝臟中累積的衰老細胞。有研究顯示，非酒精性肝硬化組織中富含衰老的肝細胞［18］。衰老的肝細胞可通過旁分泌細胞因子進一步促進HSCs向肌成纖維細胞的轉分化［19］，同時衰老細胞釋放的細胞因子IL-1β、IL-6、CXCL1 等大部分對各類炎性細胞具有招募和激活的作用［20-21］。浸潤在肝臟組織中的炎性細胞可與HSCs 通過旁分泌細胞因子的方式相互作用，加劇肝損傷及放大炎性反應，從而進一步促進肝纖維化進程［22-23］。有研究顯示，使用通過靶向激活半胱天冬酶的INK相關凋亡（INK-linked apoptosis through targeted activation caspase，INK-ATTAC）小鼠，誘導P16（p16Ink4a）陽性的衰老細胞死亡或者使用衰老細胞清除劑達沙替尼+槲皮素的組合，可顯著減輕肝硬化程度［19］。使用嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T cell）靶向誘導尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR）陽性的衰老細胞死亡，同樣可減輕肝纖維化程度［24］。最新研究表明，衰老細胞中GLS1表達上調，從而通過產生氨中和細胞內酸堿平衡來維持衰老細胞存活。使用GLS1 特異性抑制劑BPTES 處理時可誘導衰老細胞死亡。體內給予BPTES 可清除累積的衰老細胞，從而達到延長壽命的作用，表明GLS1 特異性抑制劑BPTES是新的衰老細胞清除劑［25］。

綜上所述，使用GLS1特異性抑制劑BPTES 可顯著減輕CCl4誘導的小鼠肝纖維化程度，為肝纖維化的治療提供了新思路。