瓜蔞皮注射液治療高同型半胱氨酸頸動脈粥樣硬化的效果及機制研究

甄慶強，朱冬霞，劉永昌，孫 巖

頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis, CAS）是指頸動脈內膜下脂質沉積導致動脈管壁增厚、管腔狹窄、血管彈性減退的血管疾病[1]。CAS 是導致缺血性腦卒中的病因之一，也是影響患者卒中后認知功能的因素[2]。來自中國臺灣省的10 年隨訪研究表明，CAS 病變程度可以預測患者的認知能力[3]。降脂、穩定斑塊、血管緊張素受體拮抗劑等藥物是目前治療CAS 的一線藥物[4-5]，但治療效果和藥物依從性不盡如人意。本課題組前期研究發現，中藥瓜蔞皮提取物可降低同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）誘導的動脈粥樣硬化模型大鼠的血清Hcy 水平，抑制動脈平滑肌細胞增殖速度[6]，但瓜蔞皮提取物對高Hcy 頸動脈粥樣硬化的治療效果尚不明確。本研究擬通過觀察他汀類藥物聯合瓜蔞皮注射液治療高Hcy 頸動脈粥樣硬化的效果，利用網絡藥理學和生物信息學思路挖掘瓜蔞皮注射液治療CAS 的潛在機制，并設計動物實驗加以驗證，為CAS 的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床研究

1.1.1 研究對象 選取2019 年1 月—2021 年1 月于濟南市人民醫院住院治療的高Hcy 頸動脈粥樣硬化患者120 例。納入標準：1）符合頸動脈粥樣硬化診斷標準，頸動脈狹窄率≤50%[7-8]；2）Hcy 水平>10 μmol/L[9]；3）能配合本研究并完成隨訪者。排除標準：1）服用葉酸、維生素B6 及維生素B12 等降低血清Hcy 水平的藥物；2）頸動脈粥樣硬化伴重度狹窄需要手術干預或近3 個月內接受頸動脈手術者；3）嚴重肝腎功能不全者；4）合并急性心腦血管意外或惡性腫瘤者。本研究已獲醫院倫理委員會批準（批準號：濟醫倫批SWYX:No.2019-002）。采用隨機數字表法將本組患者分為觀察組和對照組，每組60例。兩組患者年齡、性別、體質量指數（BMI）、病程、合并糖尿病、合并冠心病、合并高血壓人數、使用他汀類藥物類別及他汀藥物劑量比較差異無統計學意義（P>0.05，表1）。

表1 兩組患者基線資料比較

1.1.2 治療方案 對照組患者給予基礎治療：應用他汀類藥物穩定斑塊；應用抗血小板聚集藥物抑制血小板聚集。觀察組在基礎治療基礎上，給予瓜蔞皮注射液（國藥準字Z20027540）治療，8 mL 加入5%葡萄糖注射液250 mL 中靜脈滴注，1 次/d，治療周期為3 周。

1.1.3 觀察指標 1）檢測兩組患者治療前后總膽固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、Hcy 水平；2）采用雙側頸動脈各測量3 次取平均值的方法，使用彩色多普勒超聲儀測量頸總動脈頸動脈內膜中層厚度（intima mesosphere thickness, IMT）。

1.2 實驗研究

1.2.1 瓜蔞皮干預CAS 的靶點篩選 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺檢索瓜蔞皮的有效成分，參照既往文獻，將符合藥物口服生物利用度和藥物相似度類藥比的成分納入研究[10]。登錄高通量基因表達數據庫（gene expression omnibus, GEO），下載包含CAS 基因數據的數據集GSE100927，利用R 軟件limma 數據包[11]對數據進行分析，獲得差異表達基因。將瓜蔞皮作用靶點與CAS 差異表達基因取交集，獲取瓜蔞皮干預CAS 的靶點。

1.2.2 瓜蔞皮干預CAS“藥物-靶點-疾病”網絡構建和關鍵靶點篩選 使用Cytoscape 3.9.2 軟件繪制瓜蔞皮干預CAS 的“藥物-靶點-疾病”的網絡。使用STRING 平臺[12]和Cytoscape 3.9.2 軟件繪制瓜蔞皮干預CAS 靶點的蛋白-蛋白相互作用（proteinprotein interaction, PPI）網絡，以cytoHubba 插件[13]中節點度值（degree）為標準，篩選瓜蔞皮干預CAS 的關鍵靶點，進行信號通路富集分析。

1.3 動物實驗

1.3.1 實驗動物 30 只6 周齡無特殊病原體（specific pathogen free, SPF）級SD 雄性大鼠，體質量200～220 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[合格證號：370726231100053607，生產許可證號：SCXK（魯）20220006]。實驗大鼠飼養于SPF 級動物房（室溫23～25 ℃、相對濕度7%），自由飲水、攝食。

1.3.2 實驗試劑 兔多克隆抗體核因子（NF）-κB p65、兔多克隆抗體腫瘤壞死因子（TNF）-α、兔多克隆抗體基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、兔多克隆抗體血管細胞黏附因子-1(VCAM-1）購自北京博奧森生物技術有限公司（批號：AI00133231、AI10202348、AH27187919、AB12157553）；SABC 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：SA1142）；蛋白濃度測定試劑盒（美國AMERSHAM 公司，批號：RPN2232）；水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司，批號：R21454）。

1.3.3 實驗動物分組及造模方法 將30 只實驗大鼠隨機分為空白組、模型組和治療組，每組10 只，分籠飼養。參照代淵等[14]、靳宏光等[15]造模方法復制高同型半胱氨酸血癥動脈粥樣硬化大鼠模型：1.5%蛋氨酸水溶液按照10 mL/kg 體重灌胃，2 次/d；同時給予高糖高脂飼料（南京協同生物）喂養2 周后，按照3 mL/kg 體重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，游離并顯露腹主動脈，于主髂動脈分叉處穿刺，置入球囊，上行至腎動脈水平以上，調節壓力泵壓力至6～8個標準大氣壓，緩慢抽動球囊3 次，撤出球囊，用7-0無損傷尼龍線縫合穿刺點，檢查無出血后，逐層縫合關閉腹腔。術后即刻給予青霉素10 萬單位皮下注射、術后3 d 內每天給予青霉素10 萬單位預防感染。6 周后，模型組和治療組各隨機選1 只大鼠，自尾靜脈取血，檢測Hcy 水平，水合氯醛麻醉后取腹主動脈，石蠟包埋、切片、鏡下觀察。Hcy ＞15 μmol/L，主動脈內膜欠光滑，平滑肌排列紊亂、增生，視為造模成功（圖1）。根據人與動物的每公斤體重劑量折算系數，計算得到大鼠瓜蔞皮注射液給藥劑量為0.83 mL/kg，生理鹽水給藥劑量為10 mL/kg。以上述給藥劑量為標準，對照組和模型組大鼠每天自尾靜脈注射相應劑量的生理鹽水，治療組大鼠每天自尾靜脈注射相應劑量的瓜蔞皮注射液，1 次/d，連續給藥7 d。

圖1 大鼠主動脈HE 染色結果（×400）

1.3.4 指標檢測 1）取材：給藥7 d 后，麻醉3 組大鼠，將腹主動脈取出并均分為兩份，分別保存于4%多聚甲醛和液氮中；頸椎脫臼處死大鼠。2）免疫組化法檢測大鼠腹主動脈NF-κB p65、TNF-α、MMP-9 和VCAM-1 蛋白水平：采用Image J 軟件進行平均積分光密度（optical density, OD）值分析。3）蛋白免疫印跡（Western Blot）法測定大鼠腹主動脈中NF-κB p65、TNF-α、MMP-9、VCAM-1 蛋白水平，使用Image J 進行灰度值分析。

1.4 統計分析 采用SPSS 26.0 軟件對數據進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，前后比較采用配對t 檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較及前后比較采用非參數檢驗；計數資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗；P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床研究

2.1.1 兩組患者血脂水平比較 治療前，兩組患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平差異無統計學意義（P>0.05）。治療后，對照組患者TC 水平較治療前差異無統計學意義（P>0.05）；TG、LDL-C 和Hcy 水平較治療前下降，差異有統計學意義（P<0.05）；觀察組患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平較治療前下降，且低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05，表2）。

表2 兩組患者血脂水平比較

2.1.2 兩組患者IMT 比較 治療前，兩組患者IMT差異無統計學意義（P>0.05）。治療后，觀察組和對照組患者IMT 較治療前均下降，且觀察組患者IMT 水平低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05，表3）。

表3 兩組患者IMT 比較（mm）

2.2 實驗研究

2.2.1 瓜蔞皮干預CAS 的靶點篩選 獲得瓜蔞皮有效成分11 個，靶點422 個。獲得CAS 相關差異表達上調基因1248 個，差異表達下調基因887 個，繪制火山圖和熱圖進行可視化。將瓜蔞皮作用靶點與CAS 差異表達基因取交集，獲取瓜蔞皮干預CAS 的靶點61 個，其中差異表達上調基因38 個，差異表達下調基因23 個（表4，圖2）。

圖2 瓜蔞皮干預CAS 的靶點篩選

表4 瓜蔞皮干預CAS 的靶點

2.2.2 瓜蔞皮干預CAS“藥物-靶點-疾病”網絡構建和關鍵靶點篩選 使用Cytoscape 3.9.2 軟件構建瓜蔞皮干預CAS“藥物-靶點-疾病”網絡和PPI 網絡進行可視化，以節點度值為條件篩選瓜蔞皮干預CAS 的關鍵靶點。富集分析結果表明，瓜蔞皮干預CAS 的關鍵靶點顯著富集在TNF 信號通路、NF-κB信號通路等通路上（圖3）。

圖3 瓜蔞皮干預CAS"藥物- 靶點- 疾病"網絡構建和關鍵靶點篩選

2.3 大鼠腹主動脈TNF-α、NF-κB p65、VCAM-1、MMP-9 表達量測定

2.3.1 免疫組化結果 模型組和治療組大鼠腹主動脈TNF-α、MMP-9 表達均高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）；治療組和空白組NF-κB p65、VCAM-1 表達差異無統計學意義（P>0.05）；與模型組相比，治療組TNF-α、NF-κB、VCAM-1、MMP-9 表達下降，差異有統計學意義（P<0.05，圖4）。

圖4 瓜蔞皮注射液對大鼠腹主動脈各指標蛋白表達的影響

2.3.2 Western Blot 法檢測結果 模型組和治療組腹主動脈TNF-α、MMP-9 蛋白表達量均高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）；治療組和空白組NF-κB p65、VCAM-1 表達差異無統計學意義（P>0.05）；與模型組相比，治療組TNF-α、NF-κB、VCAM-1、MMP-9 表達量下降，差異具有統計學意義（P<0.05，圖5）。

圖5 瓜蔞皮注射液對大鼠腹主動脈各指標蛋白表達的影響（Western Blot 法）

3 討論

瓜蔞皮是葫蘆科植物栝樓（雙邊栝樓）的果皮，其功效主要包括清化熱痰、寬胸散結等[16]?，F代藥理學研究發現，瓜蔞皮富含木犀草素等黃酮類化合物、蘇氨酸等氨基酸、β-谷甾醇等甾醇以及大量揮發油[17]，其提取液可通過抗動脈粥樣硬化、保護血管內皮細胞等途徑治療心血管疾病[18]。劉思妤等[19]研究發現，瓜蔞皮乙醇提取物能顯著減少人臍靜脈內皮細胞中細胞內活性氧、TNF-α 和白細胞介素-6等促炎癥細胞因子表達水平，發揮抗炎、抗氧化作用。楊震等[20]研究證實，瓜蔞皮可降低高血脂合并急性心肌缺血模型大鼠超氧化物歧化酶、脂質過氧化物、過氧化氫酶、總抗氧化能力和氧化型低密度脂蛋白水平，改善氧化應激狀態，保護心血管。

既往研究證實，高膽固醇血癥、高LDL-C 水平、高Hcy 水平與頸動脈粥樣硬化密切相關[21-23]。頸動脈內中膜厚度是CAS 嚴重程度的重要指標，Hcy水平與頸動脈內中膜厚度及斑塊形態和面積線性相關[23-25]。本研究結果表明，他汀類藥物可降低合并高Hcy 的CAS 患者TG、LDL-C、Hcy 水平。聯合應用瓜蔞皮提取物，可顯著降低CAS 伴高Hcy 血癥患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平，治療效果優于單用他汀類藥物。表明瓜蔞皮提取物可通過調節血脂和Hcy 水平等途徑改善CAS。同時，他汀類藥物聯合應用瓜蔞皮提取物可減小頸動脈內中膜厚度，延緩CAS 進展。

本研究通過生物信息學和網絡藥理學研究思路挖掘了瓜蔞皮干預CAS 的潛在機制，并設計實驗加以驗證。結果提示，瓜蔞皮干預CAS 的關鍵靶點顯著富集在TNF/NF-κB 信號通路上。炎性反應貫穿動脈粥樣硬化的發病過程。單核細胞等炎性相關細胞通過TNF-α、白細胞介素-6 等因子參與活性氧簇介導的細胞損傷，并向巨噬細胞轉化[26]；斑塊內的巨噬細胞吞噬脂質，當脂質累積過多超過巨噬細胞的處理能力時，巨噬細胞泡沫化，形成泡沫細胞[27]；斑塊內活化的炎癥細胞分泌基質金屬蛋白酶，降解細胞外基質和斑塊的纖維帽，降低斑塊的穩定性，增加其破裂的幾率[28-29]。TNF/NF-κB 信號通路是經典的炎癥反應通路。動物實驗驗證，動脈粥樣硬化模型大鼠腹主動脈組織TNF-α、NF-κB p65、VCAM-1、MMP-9 表達顯著上調，瓜蔞皮注射液可抑制上述指標的表達，提示其可以通過抑制TNF/NF-κB 信號通路的激活發揮抗動脈粥樣硬化的作用。