海南紅樹林底泥海洋放線菌的抗菌及抗群體感應活性篩選

莫 杰, 錢生輝, 錢嘉興, 繆 莉

(揚州大學環境科學與工程學院, 揚州 225127)

抗生素的廣泛使用導致環境中抗生素殘留。在抗生素的長期選擇壓力下,病原菌易產生耐藥性,使用抗生素治療細菌感染的效果也會漸漸減弱。研究發現,病原菌會以各種途徑分泌化學信號分子來檢測菌群密度和調控細菌的多種生理機能,如抗生素的合成[1]、發光、毒性因子的釋放[2]、胞外多糖的合成和分泌、細菌的聚集、生物膜的形成以及質粒的轉移等,從而適應周圍環境變化,這種信息交流系統稱為細菌群體感應系統[3]。在不影響細菌正常生命活動的前提下,可以對這種細菌之間的信息交流起阻斷作用,干擾或抑制細菌群體感應現象的物質稱為群體感應抑制劑[4]。如果能找到合適的群體感應抑制劑,就能在不殺死細菌的情況下降低細菌的致病性,減少耐藥性的產生。

海洋放線菌是天然活性物質的重要來源。海洋環境復雜多變,高壓、高鹽和其他極端環境使海洋放線菌的物種更加豐富,更容易分離和篩選新的放線菌[5]。由于海洋沉積環境的特殊性,海洋放線菌具有特殊的生理特性和功能,可產生許多結構新穎、功能獨特的活性物質[6],為開發海洋藥物提供了豐富的先導化合物資源。因此,海洋放線菌的生物活性及天然活性物質研究一直受到關注。僅2013—2018年報道的海洋放線菌來源的天然產物約有470個,且半數為新化合物[7]。余海[8]從兩株海洋放線菌中分離獲得30個化合物,其中就有15個新型化合物。所以,新穎次級代謝產物的發現和新藥開發也是目前海洋放線菌資源研究最大的驅動力[9]。

紅樹林生態系統是分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落,是陸地與海洋過渡帶[10]。特殊的生態環境、周期性的海水侵襲、河口有機質的沉積和落葉的腐敗作用使其富含有機質和腐殖質,蘊含了極其豐富的微生物資源[11],具有多種生物學活性。因此,從紅樹林底泥中亦可能找到很多具有抗群體感應活性和抗菌活性的菌株。本文以紫色色桿菌為抗群體感應活性測試的指示菌,以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等5株耐藥菌為抗菌活性測試的指示菌,對實驗室保存的從海南紅樹林底泥樣品中分離到的放線菌進行抗菌和抗群體感應活性篩選,以期篩選出具有較強抗群體感應活性但抗菌活性相對較弱的菌株,并對活性菌株的代謝產物進行初步的化學分析,為抗群體感應活性物質的開發提供優良菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與指示菌

本實驗所有待篩選的海洋放線菌均分離自海南紅樹林保護區的紅樹林底泥樣品。指示菌紫色色桿菌(ChromobactieriumviolaceumATCC 12472)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和3株金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 43300,S.aureusATCC 33591,S.aureusATCC 25923)為實驗室保存菌種。

1.1.2 培養基

高氏一號培養基(1.0 L):可溶性淀粉20.0 g、硝酸鉀1.0 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.5 g、七水合硫酸鎂0.5 g、七水合硫酸鐵0.01 g、海鹽33.0 g,pH 7.4～7.6。

Luria-Bertani(LB)培養基(1.0 L):胰蛋白胨10.0 g、酵母5.0 g、氯化鈉10.0 g, pH 7.0～7.2。

所有固體培養基添加15～20 g的瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 放線菌發酵培養及代謝物提取

洪都拉斯是位于中美洲的一個低中等收入國家。2004年的人均國民收入為1030美元。同年，總人口710萬的46%的居民居住在城市。洪都拉斯的兩個主要中心城市，一個是首都特古西加爾巴，另一個是國家工業化程度最高的城市圣佩德羅蘇拉，合計約150萬人。這兩個城市對新鮮果蔬的需求，基本推動了新鮮果蔬供應鏈的變化。它們都有多數超市賣場和食品服務，這些都對新鮮果蔬有定期的特定要求。此外，一些農副食品企業也正在向位于兩個主要中心城市中間和周圍低人口城鎮轉移。

將分離得到的菌株接種到50 mL高氏一號液體培養基中,放入恒溫搖床,30 ℃、140 r/min培養3 d。吸取10 mL培養好的菌液接種到200 mL高氏一號培養基中, 30 ℃、140 r/min繼續培養7 d。將培養好的菌液用8層紗布過濾,濾液用乙酸乙酯萃取兩遍,取上清液進行蒸發濃縮,用甲醇將濃縮蒸發的粗提物轉移到1.5 mL的指形管中,吹干稱重。根據粗提物的質量加入一定量乙酸乙酯配制成50 mg/mL的粗提物樣品液,用于活性測試。

1.2.2 濾紙片法測定菌株粗提物活性

將保存的6株指示菌菌種接入LB液體培養基培養2 d。吸取200 μL指示菌菌液于LB固體培養基上,用棉簽均勻涂布。吸取5 μL粗提物樣品液滴加至濾紙片(6 mm)上,使濾紙片上的含樣量為250 μg。將風干后的濾紙片倒扣在涂有指示菌的培養基上。將培養皿封口后倒置于30 ℃恒溫培養箱中培養1 d,測量抑菌圈直徑,表征抗菌能力大小。以紫色色桿菌為指示菌時,產生的色素抑菌圈分為透明圈和模糊圈。透明圈表示代謝產物具有抗菌活性,模糊圈表示代謝產物不抑制菌體生長僅抑制紫色素產生,具有抗群體感應活性。

1.2.3 色素抑制法測定菌株粗提物活性

將保存的紫色色桿菌(C.violaceumATCC 12472)接入LB液體培養基中30 ℃、140 r/min振蕩培養2 d。將粗提物樣品液取出部分到1.5 mL的指形管中,吹干稱重,并加入一定量的DMSO使其濃度為50 mg/mL。在試管中加入LB培養基950 μL和紫色色桿菌菌液50 μL,再分別加入2 μL和4 μL的樣品,使其質量濃度為100 μg/mL和200 μg/mL,每個濃度做兩組平行。陰性對照中加入與樣品液等量的DMSO。將所有試管放入30 ℃、140 r/min搖床培養2 d后拍照記錄。將所有試管中的液體取出放入1.5 mL指形管中14 000 r/min離心15 min。倒出上清液,向指形管中加入200 μL的DMSO溶解紫色色素,充分溶解后繼續14 000 r/min離心15 min。依次吸取100 μL的溶解液的上清液加入到96孔板中,酶標儀測定波長570 nm處的吸光度OD值。數值大小與紫色色桿菌色素的產量成正比,利用以下公式計算粗提物對紫色色桿菌紫色素的產生是否有抑制作用。

1.2.4 薄層層析分析(TLC)

將菌株粗提物用適量甲醇溶解,裁選適當大小的HSGF254熒光薄層層析硅膠板,并用鉛筆在距薄層板上下兩端0.5 cm處輕輕劃一道橫線,選用內徑約為0.5 mm的毛細管,輕輕蘸取少量樣品溶液,點到HSGF254熒光薄層層析硅膠板下層橫線上,選用二氯甲烷-甲醇(體積比20∶1)體系作為展開劑,將展開劑倒入層析缸,密閉搖勻,將點好的薄層板放入層析缸中,當溶劑水平面上移到上端橫線時取出,用冷風吹干,涂抹濃硫酸香草醛顯色劑,烤干并拍照記錄。

按照生工SK1201-UNIQ-10 柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取放線菌的基因組DNA;采用細菌16S rDNA的通用引物7f (5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540r(1522) (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′),對提取到的放線菌基因組DNA進行PCR擴增,PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃ 變性35 s,55 ℃退火35 s,72 ℃ 延伸1 min 30 s,35個循環;72 ℃再延伸8 min。擴增所得到的16S rDNA片段經純度檢測后,交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序;將所得序列提交GenBank進行序列比對,根據比對結果,選擇相近的菌株采用Clustal和MegaX軟件繪制系統發育樹,并將菌種與EzBioCloud database中的標準菌株進行比對。

1.2.6 代謝產物初步分析及GC-MS分析

將粗提物用二氯甲烷/甲醇1∶1溶解后加樣到正相固相小柱(Supelclean LC-Si),待溶劑揮干后,依次以石油醚/乙酸乙酯(30∶1、15∶1、1∶1)、二氯甲烷/甲醇(20∶1、10∶1、1∶1)進行洗脫,每次3個柱體積,收集洗脫液,濃縮后進行活性測試和GC-MS分析。

氣相條件:采用DB-5MS弱極性色譜柱(規格30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣量1 μL,柱流速1 mL/min,起始溫度50 ℃,以7 ℃/min升到200 ℃,保持3 min,再以7 ℃/min升到280 ℃,保持15 min。

MS運行條件:運用EI離子源,離子源溫度為250 ℃,質量掃描范圍為50～650 amu。

2 結果與分析

2.1 活性初篩

運用濾紙片法對提取到的放線菌粗提物進行群體感應抑制活性和抗菌活性篩選,其中,陽性對照為0.25 mg的青霉素,粗提物質量為250 μg。共選取84株放線菌進行發酵及其代謝產物的活性初篩。結果(圖1)顯示,指示菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌ATCC 25923和紫色色桿菌具有較高的敏感性,各有20株以上的放線菌對這3株指示菌有抑制作用,其中,抑制圈直徑大于18 mm的高活性菌株數分別為8株、7株和1株。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌ATCC 43300和金黃色葡萄球菌ATCC 33591的抗性較強,僅有5株左右的放線菌對這3株指示菌表現出一定的抗菌活性。有43株放線菌至少對一株指示菌有抑制作用,占所有待測菌株的51.19%;有27株放線菌對兩株及兩株以上指示菌同時有抑制作用,占待測菌株的32.14%。其中,HN1-104、HN2-56、HN2-90對3株指示菌有抑制作用,HN1-121、HN2-57、HN2-103對4株指示菌有抑制作用,HN1-122對5株指示菌有抑制作用,HN1-65、HN1-138和HN1-146對6株指示菌都有抑制作用。在所有待測菌株中有8株放線菌具有抗群體感應活性(它們對紫色色桿菌產生的色素抑制圈為模糊圈),其中,HN2-56的抗群體感應活性最好,色素抑制圈直徑達20 mm。

1～6分別為紫色色桿菌(Chromobactierium violaceum ATCC 12472)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)和3株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 43300、S. aureus ATCC 33591、S. aureus ATCC 25923)。圖1 紅樹林底泥放線菌對不同指示菌的抑制Figure 1 Inhibition of actinomycetes from mangrove sediment against different indicator bacteria

2.2 活性復篩

從初篩的抗菌及抗群體感應實驗中選取至少對3株指示菌有抑制作用的10株放線菌進行紫色色桿菌色素抑制活性的復篩。結果顯示,當放線菌粗提物質量濃度為100 μg/mL時,HN2-56、HN1-104、HN2-57、HN2-103和HN1-122的色素抑制率均超過50%;當放線菌粗提物質量濃度為200 μg/mL時,HN2-56、HN1-122、HN2-57和HN2-103的色素抑制率均超過60%。大多數菌株的粗提物在高質量濃度時,色素抑制率比低質量濃度時有所提高。有些初篩高活性的菌株在復篩中對紫色色桿菌的色素抑制效果并不明顯,如菌株HN1-138雖然對6株指示菌都有抑制作用,但是其色素抑制率還不到10%(圖2)。

圖2 活性菌株對紫色色桿菌產色素的抑制Figure 2 Inhibition of selected strains against the pigment production by Chromobactierium violaceum

2.3 薄層層析(TLC)分析

為檢測菌株的化學多樣性,對復篩的10株菌株的粗提物進行TLC分析,溶劑體系為二氯甲烷-甲醇(體積比20∶1),結果如圖3所示。菌株HN2-56、HN1-104、HN1-146和HN1-65的粗提物在薄層板上的斑點數量較多,代謝產物較為豐富。

從左向右依次為菌株HN2-56、HN2-57、HN2-90、HN2-103、HN1-65、HN1-104、HN1-121、HN1-122、HN1-138、HN1-146。圖3 活性菌株的薄層層析(TLC)分析Figure 3 Thin layer chromatography (TLC) analysis of active strains

根據初篩、復篩以及TLC分析結果發現,菌株HN2-56代謝產物豐富、具有較高且穩定的抗群體感應活性和較弱的抗菌活性,是研究抗群體感應活性產物的良好菌株,因此,對其進行代謝產物初步分離鑒定以及菌株鑒定。

2.4 菌株HN2-56代謝產物初步分離及GC-MS分析

采用正相固相小柱對菌株HN2-56的粗提物進行初步分離,以石油醚/乙酸乙酯體系和二氯甲烷/甲醇體系按極性從低到高分步洗脫,收集各洗脫液,濃縮后測試各組分活性。根據活性測試結果對石油醚/乙酸乙酯1∶1洗脫所得到的活性組分進行GC-MS分析。結果顯示,活性組分中存在超過13個可能的化合物,其中,8個化合物已被報道具有不同的生物活性,包括殺蟲、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗流感、抗炎等活性(表1)?；钚越M分中占比較高的化合物是油酸酰胺(20.15%)、鄰苯二甲酸二丁酯(16.07%)和二乙基甲苯甲酰胺(11.7%)。采用濾紙片法,對其中8個化合物(化合物1、4、6、7、8、9、10和12)進行抗菌及抗群體感應活性測試,濾紙片上各化合物含量100 μg。結果顯示,化合物4(二乙基甲苯甲酰胺)和12(莪術烯醇)具有抗群體感應活性。在測試濃度下,二乙基甲苯甲酰胺對紫色色桿菌的色素抑制圈直徑為12.5 mm,莪術烯醇的活性較弱,其色素抑制圈直徑為7 mm。同時還測定了這8個化合物對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌(ATCC 43300、ATCC 25923)的抗菌活性,發現化合物6(鄰苯二甲酸二丁酯)和7(2,5-二叔丁基鄰苯醌)對3株指示菌均具有很強的抗菌活性。

表1 HN2-56的石油醚/乙酸乙酯1∶1組分的GC-MS峰特征分析Table 1 Characteristics of the peaks obtained by GC-MS analysis of the petroleum ether/ethyl acetate 1∶1 fraction of HN2-56

2.5 菌株HN2-56鑒定

菌株HN2-56在高氏一號培養基上生長情況良好(圖4),培養7 d后其菌落直徑在3～5 mm,氣生菌絲白色,基內菌絲淡黃色。提取菌株HN2-56的基因組DNA,擴增其16S rDNA并測序,將所得rDNA序列輸入GenBank數據庫,進行Blast分析。選取12株與HN2-56序列相似性在98%以上的不同菌株,運用MegaX軟件的Neighbor-Joining建立系統發育樹(圖5)。結果表明,HN2-56是一株鏈霉菌,與Streptomyceschumphonesisstrain KK1-2 (NR_126175.1)的序列在EzBioCloud database進行比對同源性為99.86%,對比文獻[20],HN2-56的培養特征也與該菌株十分相似,所以將HN2-56鑒定為StreptomyceschumphonesisHN2-56(ON430586)。

圖4 菌株HN2-56的菌落照片Figure 4 The colony picture of strain HN2-56

圖5 菌株HN2-56的系統發育樹 Figure 5 Phylogenetic tree of strain HN2-56

3 討論與結論

細菌耐藥性上升的原因與抗生素的濫用和有限的藥物靶點相關。因此,開發具有不同藥物靶點的新型抗生素已成為新藥研究的熱點。針對細菌的生物膜形成和群體感應效應的抗感染活性篩選亦是兩個重要的研究方向。作用于群體感應系統的化合物,不會對病原菌造成太大的生存壓力,不容易使病原菌產生耐藥性,可以與傳統抗生素一起協同治療細菌性感染。Arendse等[21]合成了5個新型咪唑衍生物,采用不同的生物信息學和體外實驗技術,測試了它們對紫色色桿菌的抗菌和抗群體感應活性,結果證實了化合物能夠有效地結合CviR并抑制群體感應效應。香芹酮是一種天然的單萜類物質,在60～70 μg/mL質量濃度下對紫色色桿菌有明顯抗群體感應作用,相同濃度下也能抑制80%以上的生物膜形成,電子顯微鏡下香芹酮處理顯示不僅生物膜密度減少,還破壞了生物膜基質[22]。Batohi等[23]發現檸檬醛及其衍生物對紫色色桿菌具有抗群體感應作用。研究發現,細菌生物膜的形成與群體感應效應密切相關[24]。本文僅研究了放線菌提取物對紫色色桿菌產色素的抗群體感應效應,并未深入研究其對細菌生物膜形成的影響,有待后續研究。

本文篩選得到的菌株HN2-56與Streptomyceschumphonensisstrain KK1-2(NR126175.1)[20]極為相似。Su等[25]報道菌株StreptomyceschumphonensisSCSIO15079能產生具有降血脂活性的芳香酸和亮氨酸衍生物。本研究通過GC-MS分析發現,HN2-56的活性組分中可能存在較高含量的油酸酰胺(抗氧化活性)、鄰苯二甲酸二丁酯(抗菌抗腫瘤活性)和二乙基甲苯甲酰胺(殺蟲活性)等活性化合物,為后續研究提供了參考。通過活性驗證試驗發現,二乙基甲苯甲酰胺具有一定的抗群體感應活性,鑒于其在活性部位的含量較高,推斷該化合物可能是菌株HN2-56中的一個抗群體感應活性成分。

本研究發酵并測試了84株海南紅樹林底泥放線菌對多株指示菌的抗菌和抗群體感應活性,其中,43株具有一定的活性,篩出率為51.19%。從活性菌株中挑選10株活性較好的菌株進行復篩發現,菌株HN2-56、HN1-104、HN1-122、HN2-103和HN1-146活性較為突出。綜合比較活性測試及化學分析結果顯示,菌株HN2-56代謝產物較為豐富,具有很好的群體感應抑制效應且抗菌活性較弱。對該菌的代謝產物進行初步分離,通過GC-MS分析,從其活性組分中鑒定出13個可能的化合物,經活性驗證發現二乙基甲苯甲酰胺和莪術烯醇具有抗群體感應活性。該菌在抗群體感應方面具有較高的研究價值,在后續實驗中將進一步研究其培養條件和活性代謝產物,為群體感應抑制劑的開發提供基礎。