PI3K/AKT/mTOR信號通路在肝癌中的作用機制研究進展

戴依哲，李婭楠，尚潤澤

1.海軍軍醫大學第三附屬醫院 肝外四科，上海 200433；2.華僑大學附屬海峽醫院 普通外科，福建 泉州 362000；3.南京大學醫學院附屬金陵醫院 麻醉科，江蘇 南京 210023

原發性肝癌包括肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA），是世界范圍內第3大腫瘤致死病因[1]。由于多數肝癌患者首次確診時已是中晚期，無法行根治性手術切除，因此預后常較差。當前針對進展期肝癌的藥物治療主要包括分子靶向治療、免疫治療以及靶向聯合免疫治療等。近年來，隨著對肝癌發生發展機制研究的不斷深入，人們發現了包括TP53、CTNNB1、ARID1A/2、AXIN1、TSC1/2、PIK3CA在內的肝癌常見的突變基因以及MET、MAPK、Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR等異常激活的關鍵信號通路[2]，這些發現為肝癌的靶向治療提供了更多可能。PI3K/AKT/mTOR信號通路在細胞的增殖、分化、生存和代謝等多項生命活動中發揮重要的調控作用，也是包括肝癌在內的多種腫瘤中最常被激活的信號通路之一[3]。本文就PI3K/AKT/mTOR信號通路在肝癌發生、發展中的作用機制以及相關分子靶向藥物的最新研究進展做一綜述。

1 PI3K/AKT/mTOR信號通路的構成

1.1 PI3K/AKT的構成

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K），可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種亞型，其中對Ⅰ型的研究最為廣泛。Ⅰ型PI3K由p110和p85組成，分為ⅠA、ⅠB兩種亞型。目前研究主要集中在由p85α/β/γ調節亞基及其p110α/β/δ/γ催化亞基組成的具有雙重活性的ⅠA型PI3K[4]。PI3K可通過兩種途徑激活：一是通過胞外多種配體與細胞表面PTK受體結合而激活，二是通過Ras蛋白與催化亞基結合而激活（圖1）。

圖1 肝癌狀態下PI3K/AKT/mTOR通路的構成及相關靶向藥物作用位點

蛋白激酶B（protein kinase B，AKT），可分為AKT1、AKT2和AKT3三種亞型，均由3個結構域組成。N端是PH結構域；中間是中央激酶結構域CAT，該結構域具有AKT活化所必需的三磷酸腺苷結合位點；C端是具有調節疏水基序列的延伸域，內有另一個必需位點，在PI3K的激活下可轉變為磷酸化的AKT再進一步激活后續位點（圖1）。

1.2 mTOR的構成

人類的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物（mammalian target of rapamycin，mTOR）由1號染色體短臂（1p36.2）編碼，分子量289 kDa，是PI3K蛋白激酶家族的成員[5]。mTOR廣泛參與了細胞生長和代謝的多種信號通路[6]，它能夠整合來自三大營養物質和細胞外信號的輸入；mTOR激活后會引起多個下游靶點的磷酸化。mTOR信號級聯的激活需要形成三元復合體mTORC1（mTOR復合體-1）和mTORC2（mTOR復合體-2），二者發揮不同的功能[7-8]（圖1）。

mTORC1是由mTOR、Raptor和mLST8組成的復合體。其中mTOR是復合體的催化亞基，Raptor是mTOR調節相關蛋白，起募集mTORC1底物的作用，還負責識別部分mTORC1底物。三元復合體通過S6激酶/核糖體蛋白S6（RPS6）和真核翻譯起始因子-4E結合蛋白-1（eIF4EBP1）級聯調節蛋白質合成、葡萄糖和脂質代謝以及細胞自噬，并在腫瘤發生中發揮關鍵作用[9]。

mTORC2 則是由mTOR、mLST8、Rictor和mSIN1 組成的復合體。同樣，mTOR在復合體中起催化亞基作用，而Rictor是對雷帕霉素不敏感的mTOR伴侶蛋白，可以調節AKT、血清/糖皮質激素調節激酶（SGK）和蛋白激酶C等AGC家族蛋白成員。mSIN1通過其N端嵌入到Rictor中，然后圍繞mLST8折疊。mSIN1中間保守區域對于mTORC2的底物招募十分重要，而mSIN1的C端PH結構域是mTORC2在膜上定位所必需的（圖1）。

2 PI3K/AKT/mTOR通路在肝癌發生發展中的作用

2.1 促進細胞增殖，抑制細胞凋亡

PI3K/AKT/mTOR通路可能通過多種機制促進腫瘤的發生發展。首先，通路中的PI3K可激活AKT為磷酸化AKT，曾文濤等[10]研究顯示：磷酸化AKT在HCC中高表達并可進一步磷酸化激活Caspase-9、Bad、FOXO等蛋白促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。此外，磷酸化AKT還可以解除TSC1/2 和Rheb對mTOR的抑制作用，使mTOR與Raptor結合后組成mTORC1復合體，進一步磷酸化激活核糖體S6激酶，進而干預5’-TOP結構的mRNA翻譯，促進腫瘤細胞的增殖。同時磷酸化mTOR還可以與Rictor結合并通過形成mTORC2復合體磷酸化激活AKT，進一步促進細胞增殖。

c-Myc是多種腫瘤發生發展的重要調控基因，PI3K/AKT/mTOR通路在c-Myc誘導的肝癌中也發揮了重要作用。Xu等[11]在小鼠體內肝癌模型中發現mTORC2在c-Myc驅動的小鼠HCC中被激活，進而導致AKT1被磷酸化激活，從而促進肝癌發展，通過使用抑制劑同時抑制mTORC1/2的表達可以顯著抑制小鼠肝癌的生長。

2.2 抑制鐵死亡，促進肝癌發生

肝臟是人體中儲存鐵元素的器官，具有調節體內鐵含量的功能，然而過多的鐵在肝臟中沉積會導致一系列的問題。2012 年Dixon等[12]首次報道了一種新型的鐵離子依賴性的氧化死亡方式——鐵死亡。Yi等[13]的研究揭示了PI3K的激活突變或PTEN的失活能夠引起包括肝癌細胞在內的多種腫瘤細胞產生鐵死亡抵抗，而通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路能夠誘導腫瘤細胞鐵死亡，進一步的機制研究發現：通路中mTORC1的持續激活能夠通過上調固醇調節元件結合蛋白1（serpine mRNA binding protein 1，SERBP1）的表達引起癌細胞對鐵死亡產生抵抗。另一項研究發現PI3K/AKT/mTOR信號通路介導了MCF2L對肝癌鐵死亡的負調控作用[14]。

2.3 與乙肝病毒相互作用，促進肝癌發生

肝炎病毒感染是肝癌發生的重要危險因素之一，在感染HBV的患者之中，HBV與PI3K/AKT/mTOR信號通路復雜交互，共同參與了HBV相關肝癌的發生。Zhu等[15]的研究首次發現乙肝病毒HBx蛋白誘導的AFP表達能夠通過激活PI3K/mTOR信號傳導促進肝細胞的惡性轉化。此外，乙肝病毒Pre-S蛋白突變體可以通過內質網應激來激活VEGF-A/VEGFR-2/AKT/mTOR通路，進而促進肝細胞增殖以及后續的惡性轉化[16]。另外，Chen等[17]發現乙肝病毒感染相關的PDzk1蛋白可通過調節PI3K/AKT通路和脂肪酸代謝發揮致癌作用。

2.4 參與肝細胞癌的代謝重編程

在癌細胞中，糖酵解產生的大部分丙酮酸離開線粒體并在乳酸脫氫酶（LDH/LDHA）的催化下產生乳酸。Zhang等[18]的研究揭示mTORC1可以抑制NEAT1_2 的表達和paraspeckles小體的形成，并釋放RNA結合蛋白NONO和SFPQ，進而與剪接體內的U5 結合，激活mRNA剪接和關鍵糖酵解酶的表達，這一系列改變導致葡萄糖轉運增強和乳酸的產生，并促進體內、外肝癌細胞的生長。非編碼RNA與PI3K/AKT/mTOR通路的相互作用也影響著糖代謝重編程，Zhang等[19]研究發現miR-873可以通過靶向NDFIP1蛋白調節AKT/mTOR通路，從而引發糖代謝重編程。此外，PI3K/AKT/mTOR通路還能以多種機制促進腫瘤的脂質合成。SREBP-1是調節細胞脂質穩態的關鍵基因，它能夠調控多種參與脂肪酸合成、甘油三酯合成以及膽固醇合成相關的關鍵基因的表達[20]，而SREBP-1的成熟與激活主要受到PI3K/AKT/mTORC1的調控[21]。另外，有研究發現AKT還可以通過抑制GS3K和Insig2的表達間接上調SREBP-1的表達水平，從而促進腫瘤脂肪酸合成[22-23]。除了參與肝癌的糖、脂代謝重編程外，PI3K/AKT/mTOR同樣參與了支鏈氨基酸的代謝。Ericksen等[24]通過轉錄組、酶和代謝組學分析發現：在體內、外抑制支鏈氨基酸分解代謝酶（BCKDHA、ACADS和ACADSB）的活性會引起肝癌組織中支鏈氨基酸的蓄積，同時增強mTORC1活性和細胞增殖速率。除支鏈氨基酸外，在谷氨酰胺代謝過程中也發現了PI3K/AKT/mTOR通路的激活，Li等[25]報道了其在肝癌細胞中通過下調GOT2 的表達能夠重新編程谷氨酰胺代謝來支持細胞抗氧化系統，從而促進谷氨酰胺分解、核苷酸合成和谷胱甘肽合成，在此過程中PI3K/AKT/mTOR通路被激活，進而促進肝癌的進展。

2.5 介導肝癌血管生成

腫瘤血管新生在肝癌的進展中發揮著重要的作用，近年來的研究發現PI3K/AKT/mTOR通路可以通過多種機制介導腫瘤新生血管的形成。例如，Li等[26]發現，肝癌細胞外泌體來源的長鏈非編碼RNA SNHG16可以通過激活PI3K/AKT/mTOR通路促進肝癌血管生成。Chen等[27]研究表明，在非酒精性脂肪肝相關的肝癌患者中，由于存在脂代謝紊亂以及低氧環境，引起HIF-2α的表達上調，并通過激活PI3K/AKT/mTOR通路促進腫瘤血管生成，而在阻斷該通路后腫瘤血管生成明顯減少。此外，有研究表明，低氧環境下MAPK通路與PI3K/AKT通路的共同激活也是導致腫瘤血管生成的原因之一[28]。除了經典的腫瘤血管新生外，血管擬態也是另外一種維持腫瘤高代謝特征的生物學行為，PI3K/AKT通路受到CD276（B7-H3）的調控，通過調節下游多種基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，參與血管擬態的發生[29]。

2.6 在肝癌耐藥中的作用

目前的肝癌治療指南建議將奧沙利鉑作為基礎的全身靜脈化療用于治療不適宜手術切除或局部治療的晚期和轉移性肝癌[30]。但是在治療過程中部分患者會出現奧沙利鉑耐藥。研究發現，奧沙利鉑處理后的不同肝癌細胞系中PI3K/AKT/mTOR通路均存在不同程度被激活，而PI3K抑制劑Gedatolisib（PKI-587）可以通過抑制DNA損傷修復途徑以及抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性使耐藥的肝癌細胞對奧沙利鉑重新致敏[31]。通過抑制PI3K/AKT通路可以減少因線粒體-溶酶體串擾造成的肝癌順鉑耐藥[32]。有研究表明，肝癌細胞中的巖藻糖基轉移酶家族（fucosyltransferases，FUTs）可以通過調控PI3K/AKT通路上調多重耐藥蛋白（multidrug resistance protein 1，MRP1）的表達，造成肝癌細胞對多重藥物的耐藥[33]。此外，PI3K/AKT/mTOR通路的激活在肝癌靶向藥物的耐藥中也發揮了重要的作用。研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路的激活是肝癌產生索拉非尼耐藥的一個關鍵機制，使用PI3K、mTOR雙重抑制劑BEZ235可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路介導的自噬提高肝細胞癌對索拉非尼的敏感性[34]。

2.7 參與肝癌的腫瘤微環境調控

肝癌的腫瘤微環境除了腫瘤細胞本身，還包括結構成分（如細胞外基質等）、基質細胞（如免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞等）和信號成分（趨化因子、細胞因子、激素和生長因子等），它們共同在肝癌的發生發展中發揮重要作用[35]。在正常肝組織中，細胞外基質主要是由肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）分化為成纖維細胞后分泌[36]。在肝細胞癌中HSC也作為腫瘤微環境成分之一調控腫瘤的增殖和惡性進展，Liu等[37]研究發現刺激胞外的基質硬度可以促進肝細胞癌的生長以及轉移，其機制是通過轉錄因子E2F3促進HSC分化為具有促瘤作用的成纖維細胞，并且可以通過FGFR1 調控下游PI3K/AKT及MEK/ERK通路?；|細胞成分中的腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophage，TAM）在腫瘤發生、轉移、血管生成和適應性免疫抑制中發揮關鍵作用，TAM可分為M1型和M2型，前者具有促炎和抗腫瘤的特點，而后者的功能與前者相反[38-39]。TREM蛋白是一個在髓系細胞中表達的免疫球蛋白細胞表面受體家族蛋白，在巨噬細胞中下調TREM1蛋白的表達可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路促進M2型TAM向M1型轉化，從而改變肝癌微環境的組成，抑制腫瘤進展[40]。CXCL5是趨化因子CXC亞家族成員之一，Zhou等[41]發現CXCL5可以通過共激活PI3K/AKT和ERK通路促進腫瘤細胞增殖，并促進中性粒細胞在腫瘤中的浸潤，進一步促進炎癥發生。此外，在腫瘤環境以及炎癥環境下，白細胞介素8（IL-8）分泌增加，研究表明IL-8 可以促進腫瘤的轉移以及上皮細胞-間充質轉化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）[42]，在肝細胞癌中IL-8可以通過PI3K/AKT通路上調整合素β3促進肝細胞癌的進展[43]。另外有研究顯示，白細胞介素37（IL-37）可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路調節肝癌細胞的自噬[44]。

3 靶向PI3K/AKT/mTOR信號通路的藥物研究與應用

3.1 PI3K抑制劑的研究及應用

第一代PI3K特異性抑制劑是化合物LY294002。Ma等[45]發現該化合物作用于HCC后細胞活力顯著降低、凋亡增加、遷移侵襲能力下降。進一步的機制研究發現，LY294002治療能夠下調PI3K/AKT誘導的AEG-1的表達并抑制AKT、GSK3β的磷酸化。除了作用于PI3K/AKT通路發揮作用，一項臨床前研究還發現LY294002能夠增加肝細胞癌對放射治療的敏感性[46]。然而，由于單獨應用第一代PI3K抑制劑顯示出了較大的毒副作用，因此限制了其臨床應用[47]。

阿培利西（Alpelisib）是一種新型口服PI3K抑制劑，已被FDA批準用于具有PIK3CA突變的乳腺癌治療。在肝癌臨床前模型中，阿培利西同樣可以特異性地治療具有PIK3CA突變的HCC，然而在PI3K/AKT通路激活但不存在PIK3CA突變的HCC中阿培利西并沒有顯示出顯著的治療效果，通過聯合使用Alpelisib與mTOR或CDK4/6抑制劑可以進一步提升PIK3CA突變HCC的治療效果[48]。

伊德拉利西（Idelalisib，GS-1101，CAL-101）是一種選擇性PI3Kδ抑制劑[49]，已獲批用于慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤的治療。在肝癌中，伊德拉利西可抑制HCC細胞增殖并誘導半胱天冬酶依賴性細胞凋亡，機制上其誘導的細胞凋亡有賴于Bim的上調[50]。

除了單獨用藥，近年來基于PI3K抑制劑的聯合治療研究也顯示出較好的臨床應用前景。研究表明，科潘利西（Copanlisib）與索拉非尼（Sorafenib）聯合用于人HCC時表現出協同作用，提示該聯合治療方案在肝癌治療中具有潛在合理性[51]。

3.2 AKT抑制劑的研究及應用

近年來，多個研究團隊對于不同的新型AKT抑制劑在肝癌治療中的效果及作用機制行了評估。例如，Sokolowski等[52]發現，變構AKT抑制劑MK2206可通過抑制PI3K/AKT和Notch1雙重途徑誘導HCC細胞凋亡并引起細胞增殖停滯，但MK2206 在體內HCC中是否同樣具有雙重靶向的效果仍有待進一步研究。DC120是一種靶向于AKT的ATP結合位點的新型人工合成化合物，除了直接抑制AKT之外，DC120還能夠以劑量依賴性和時間依賴性的方式下調FKHR、FKHRL1、GSK3β和mTOR的磷酸化水平，達到抑制腫瘤細胞生長、增殖的效果[53]。此外，一些傳統中草藥中也含有類似AKT抑制劑的成分。Zhuo等[54]發現臭椿酮（Ailanthone）可通過抑制PI3K（p110α）的表達和AKT的Ser位點的磷酸化，在肝癌Huh7細胞中發揮抗腫瘤活性；毛蘭素（Erianin）被證實以劑量依賴性方式抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲，并可誘導HCC細胞的凋亡，而其作用機制與PI3K/AKT，p38和ERK/MAPK信號通路的抑制相關[55]。

在聯合用藥方面，研究人員發現DC120與MEK/ERK通路抑制劑U0126聯用，可通過同時抑制PI3K/AKT/mTOR和MEK/ERK通路在體內協同抑制腫瘤生長[56]。SC66 能夠有效抑制總AKT和磷酸化AKT的表達，并可以劑量和時間依賴的方式抑制HCC的細胞活力和集落形成能力，SC66 與多柔比星（doxorubicin）或依維莫司（RAD001）聯合治療能夠更加強力地抑制體外培養Hep3B細胞和小鼠體內移植瘤的生長[57]。ARQ092 與索拉非尼聯合使用在HCC大鼠模型治療中顯示出良好的耐受性和更強的抗腫瘤作用，并且顯示出了較好的抗纖維化作用，提示這種聯合治療方案可能在肝硬化基礎上發生肝癌的患者中具有潛在的治療優勢[58-59]。

3.3 mTOR抑制劑的研究及應用

mTOR的異常激活在肝癌等多種腫瘤中極為常見，因此目前針對mTOR抑制劑治療肝癌的研究也最為普遍[60]。常見的mTOR抑制劑主要分為兩代。第一代mTOR抑制劑主要是雷帕霉素類似物及其衍生物，這些藥物在臨床前研究中均顯示出了對肝癌細胞生長顯著的抑制作用。例如，替西羅莫司（CCI-779）可以誘導肝癌細胞出現細胞周期G1期阻滯，以此抑制體內、外肝癌的生長[61]。在小鼠肝癌模型中，依維莫司能夠以計量依賴的方式抑制腫瘤的生長[62]，而長期的依維莫司治療則能夠顯著延緩DNA損傷誘導的腫瘤進展[63]。鑒于在臨床前研究中取得的良好效果，相關藥物也在臨床中開展了研究。然而，第一代mTOR抑制劑在臨床試驗中的表現并不盡如人意。盡管在1/2期隨機研究中依維莫司均顯示有一定的臨床治療效果[64]，但在隨后的多中心3 期臨床研究中，依維莫司治療并沒有明顯改善出現腫瘤進展或不能耐受索拉非尼治療的肝癌患者的總體預后[65]。而替西羅莫司更是在1/2期臨床試驗中即遭遇失敗[66]。

因此，為了進一步提升治療效果，第二代mTOR抑制劑應運而生。相較于第一代mTOR抑制劑，第二代抑制劑能夠同時抑制由mTORC1 和mTORC2催化的下游基因磷酸化進程。以雙mTOR抑制劑MLN0128為例，該化合物能夠通過同時抑制mTORC1和mTORC2限制腫瘤細胞生長并誘導細胞凋亡[67]，在AKT/c-MET小鼠肝癌模型中，單獨給予口服MLN0128治療也可以在一定程度上抑制腫瘤的生長[68]。另一個雙mTOR抑制劑CC-233（ATG-008）在體外肝癌細胞系、人原代肝癌細胞以及小鼠移植瘤模型中均顯示出了強力的殺傷作用[69]。因此，相關研究團隊也對CC-233的臨床應用可能進行了評估（NCT01177397），然而目前為止相關的研究結果并未公布。

在基于mTOR抑制劑的聯合治療方面，前期已開展的聯合用藥相關臨床試驗主要針對mTOR抑制劑聯合索拉非尼或抗血管生成抑制劑貝伐珠單抗方案進行了研究，從目前已公布的研究結果來看，替西羅莫司聯合貝伐珠單抗的方案在一項Ⅱ期臨床研究中顯示出了較好的應用潛力，作為一線治療，該方案的客觀緩解率達到19%，患者總體生存期為14個月[70]。然而，其余已公布聯合治療方案的效果均不盡如人意[71-72]。因此，近年來各研究團隊主要針對其他潛在的聯合治療方案在臨床前模型中進行了探索，以期尋找更加有效的聯合治療策略。本課題組前期研究發現，MLN0128與肝癌二線靶向藥物卡博替尼聯合應用可以在肝癌細胞系和部分小鼠肝癌模型中協同抑制肝癌[73]。此外，有研究顯示VitD可以重新致敏對依維莫司治療耐藥的HCC細胞，機制上VitD可以通過上調miR-375 的表達，引起下游負責EMT和耐藥性的幾種癌基因表達的下調，從而使依維莫司治療重新有效[74]。另有研究顯示，mTOR抑制劑和苦參堿的聯用能增強樹突狀細胞的活化和分化并顯著提高體內外抗腫瘤免疫效果[75]?？梢娀趍TOR抑制劑的聯合治療策略可能為進展期肝癌的治療提供新的可能，然而上述體外研究的結論仍需進一步在臨床試驗中進行驗證。

4 小結與展望

隨著腫瘤信號通路中關鍵靶點的不斷發現，分子靶向治療在近年來得到了飛速的發展。作為在肝癌發生與發展中最關鍵的信號傳導通路之一，PI3K/AKT/mTOR通路成為肝癌靶向治療的研究熱點。綜合近期的研究進展不難看出，一些特異性作用于通路中關鍵基因突變的藥物在具有相應突變的肝癌亞型中具有良好的治療效果，提示這些靶向藥物在未來肝癌的精準化治療中可能具有重要意義。然而，其余多數靶向制劑在臨床應用中仍然存在毒副作用大、藥物耐受等問題，此外由于肝癌異質性強以及PI3K/AKT/mTOR通路常與其他腫瘤信號通路存在串擾等原因，這些藥物在臨床應用中具有一定的局限性。因此，進一步探索通過聯合使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑和靶向其他關鍵通路的抑制劑在肝癌中的治療將是未來研究的主要方向。另外，免疫檢查點抑制劑聯合靶向藥物治療在近年來的肝癌臨床治療中取得了重大的成果，近期的研究也發現PI3K/AKT/mTOR通路在肝癌免疫微環境的調控中同樣發揮著重要的作用，包括腫瘤相關巨噬細胞極化、中性粒細胞浸潤等都受到該通路的調節。因此，通過聯合PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑與腫瘤免疫檢查點抑制劑治療肝癌的相關研究也將會成為未來研究的重點。