鉤藤降壓解郁方抑制TLR4/NF-кB 信號通路對高血壓并發抑郁癥大鼠海馬小膠質細胞極化的影響

馬丹鳳，張傳香，陳蕾，沈程，趙紅霞，任衛瓊（.湖南省兒童醫院，湖南長沙 40007；.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙 40007）

高血壓是常見的心血管疾病，由于對患者生理、心理等多方面因素的影響，高血壓患者患抑郁癥的幾率超過25%[1]。高血壓易誘發抑郁，而不良情緒又易導致血壓波動增大，難以平穩控制，且抑郁傾向也導致疾病死亡風險增加[2-3]。高血壓并發抑郁癥（Hypertension complicated with depression，HD）的發病機制尚未完全闡明。研究[4]發現，高血壓患者體內多種炎性細胞因子表達異常，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）表達上調等。而外周炎性因子刺激可激活中樞神經炎癥，產生活動減少、快感缺失等抑郁樣行為[5]。有研究[6]表明，炎性因子損傷血腦屏障導致血液中的毒性物質更容易進入中樞，損傷神經元而引起抑郁癥狀的出現。小膠質細胞是中樞神經系統中響應免疫應答速度最快的細胞，其極化后可雙向調節神經系統炎癥反應[7-9]，通過抑制Toll 樣受體4（TLR4）來誘導小膠質細胞向M2型極化，可改善中樞神經元損傷[10]。

鉤藤降壓解郁方以《中醫內科雜病證治新義》（胡光慈編著）中的天麻鉤藤飲為基礎方化裁而來，由鉤藤、天麻、地龍、葛根、丹參、川芎、杜仲、桑寄生、白芍、貫葉連翹10 味中藥組成。方中以鉤藤、天麻熄風平肝為君，地龍活血通絡為臣，佐以杜仲、桑寄生清肝疏郁，葛根、白芍滋陰生津，全方具有養陰平肝、化瘀解郁的功效，兼有降壓與抗抑郁雙重作用。課題組前期研究[11-12]發現，鉤藤降壓解郁方能通過減少海馬組織炎性因子分泌，穩定單胺類神經遞質表達，緩解海馬神經元損傷，實現對HD 大鼠血壓及抑郁樣行為的改善作用。因此，本研究擬繼續以HD 大鼠為研究對象，探究鉤藤降壓解郁方對TLR4/核因子кB（NF-кB）信號通路以及小膠質細胞極化狀態的影響，以期為其治療HD 提供科學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 8 周齡雄性原發性高血壓大鼠（SHR）40 只，SD 雄性大鼠8 只，SPF 級，體質量150～170 g，購于北京維通利華實驗動物技術公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0006，動物質量合格證號：1100112111113502636。動物飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新中心實驗動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2020- 0003。本實驗方案通過湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會審查，批文號：ZYFY20211110。

1.2 藥物及試劑 鉤藤降壓解郁方10 味中藥材均由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供。將846 g 全方藥材加蒸餾水常規煎煮2次，合并過濾藥液，恒溫水浴鍋蒸發濃縮至生藥2.961 g·mL-1高濃度藥液，使用時以純水稀釋為1.481、0.740 g·mL-1中、低濃度藥液。

苯磺酸左旋氨氯地平片（批號：210903），吉林施慧達藥業；鹽酸氟西汀膠囊（批號：9492AA），蘇州禮來制藥公司。陽性藥制備：將苯磺酸左旋氨氯地平片（5 mg）與鹽酸氟西汀膠囊（20 mg）共同溶解于111.11 mL 蒸餾水中，充分搖勻，制備成含左旋氨氯地平0.045 mg·mL-1+氟西汀0.18 mg·mL-1的混懸液。

TNF-α、IL-1β、IL-10 ELISA 試劑盒（批號：2112R3108、2112R3518、2112R3703），江蘇菲亞生物科技公司；TLR4 抗體（批號：20220216），長沙艾方生物科技公司；NF-κB p65抗體（批號：1132BP51），武漢博士德生物公司；CD16、CD206 抗體（批號：00093405、10020244），武漢三鷹生物技術公司；HE染色液（批號：C210904），珠海貝索生物技術公司；尼氏染色液（批號：DK0021），北京雷根生物技術公司。

1.3 主要儀器 BP-98A 型智能無創血壓計，北京軟隆生物技術公司；YLS-9A 型生理、藥理電子刺激儀，濟南益延科技發展公司；MIR-262 型恒溫箱，日本三洋公司；BX51 型熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；TS-1 型搖床，江蘇海門其林貝爾儀器公司；H1850 型臺式冷凍離心機、TG16W 型微量高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器公司；352 型酶標儀，芬蘭Labsystems 公司；DYY-6C 型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉膜儀，北京六一生物科技公司；PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學儀器公司；JJ224BC 型電子天平，美國雙杰測試儀器廠；ChemiScope6100-化學發光成像系統，上海勤翔科學儀器公司。

1.4 分組、模型復制及給藥 將40 只收縮壓穩定在180～200 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 kPa）的SHR 大鼠隨機分為5組：模型組、陽性藥（左旋氨氯地平+氟西?。┙M及中藥（鉤藤降壓解郁方）高、中、低劑量組，每組8 只；另取8 只SD 大鼠作為對照組。除對照組外，其他各組大鼠給予慢性應激（CUMS）結合孤養的方式復制HD模型[12]，連續42 d。造模同時給藥干預，中藥高、中、低劑量組分別給予鉤藤降壓解郁方29.61、14.81、7.40 g·kg-1灌胃給藥，相當于臨床用量的3、1.5、0.75 倍；陽性藥組給予左旋氨氯地平0.45 mg·kg-1+氟西汀1.8 mg·kg-1灌胃給藥；對照組、模型組均給予同等體積的生理鹽水灌胃；灌胃體積10 mL·kg-1，每天1次，連續42 d。

1.5 尾動脈收縮壓測定 采用無創傷式大鼠尾套加壓阻斷法于給藥前及每周最末日上午測量大鼠尾動脈收縮壓，取連續3次測量的平均值作為當周收縮壓。

1.6 大鼠行為學檢測

1.6.1 糖水偏好實驗 造模開始后的第2 周和最后1 周各進行1 次糖水偏好行為學檢測[12]。適應性訓練48 h，前24 h 給予1%蔗糖水與純水，后24 h 交換糖水與純水的位置。實驗開始后，各組大鼠禁食禁水23 h，然后分別記錄1 h 內各組大鼠的糖水、純水消耗量；計算：糖水偏好率（%）=糖水消耗量/總消耗量×100%。

1.6.2 水迷宮實驗 于造模結束后進行水迷宮實驗[13]。前4 d 為適應性訓練，引導大鼠學習尋找水中平臺，記錄所用時間作為逃避潛伏期；第5 天進行空間探索，通過攝像記錄大鼠90 s 內穿越平臺次數，計算目標象限停留時間占比。

1.7 ELISA 法測定血清炎性因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-10 水平 給藥結束后大鼠禁食24 h，然后用3%戊巴比妥鈉（1 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠；腹主動脈采血，靜置、離心后取上清；采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-10含量。

1.8 HE 及尼氏染色法觀察大鼠海馬組織神經元病理變化 每組隨機取3 只大鼠解剖、剝離腦組織，經4%多聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片后，分別進行HE、尼氏染色，觀察海馬CA1 區神經元細胞形態變化及尼氏體凋亡情況。

1.9 免疫熒光雙染法檢測海馬組織小膠質細胞CD16、CD206 表達 取小鼠海馬組織切片，常規脫蠟、脫水后，以EDTA 抗原修復液進行抗原修復，用山羊血清封閉液在37 ℃下封閉30 min；滴加CD16（1∶300）與CD206（1∶20 000）混合一抗，4 ℃下孵育過夜；復溫30 min 后，滴加DyLight 488 熒光素標記羊抗小鼠和熒光DyLight 594 標記羊抗兔IgG 混合二抗（兩者稀釋比例均為1∶100），室溫下孵育45 min；滴加DAPI染色液復染，用抗熒光淬滅封片劑封片；在熒光顯微鏡下觀察、拍照，使用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0 計算平均熒光強度。通過熒光雙染法標記海馬小膠質細胞中M1、M2型小膠質細胞的特有標志物CD16、CD206，進行熒光強度分析，計算M2/M1 型小膠質細胞占比。

1.10 Western Blot 法檢測海馬組織中TLR4、NF-κB p65 蛋白的表達取大鼠海馬組織適量，稱質量后剪碎，加入含有PMSF 的裂解液中，充分勻漿后冰上孵育20 min；以4 ℃、13 000 r·min-1（離心半徑=11 cm）離心20 min，取上清液，采用BCA 法測定總蛋白濃度。上樣20 μL蛋白，經SDS-PAGE 凝膠電泳后，將蛋白轉至PVDF 膜；5%脫脂奶粉封閉后，滴加一抗TLR4（1∶500）、NF-κB p65（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃下孵育過夜；洗滌后滴加二抗（1∶5 000），室溫下孵育90 min；洗滌后采用ECL顯影定影，掃描；采用ImageJ 圖像分析軟件測定各蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，對目的蛋白進行半定量分析。

1.11 統計學處理方法 采用SPSS 24.0 統計軟件進行數據分析；計量資料以均數±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗；水迷宮實驗逃避潛伏期數據采用重復測量設計的方差分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鉤藤降壓解郁方對HD 大鼠尾動脈收縮壓的影響結果見圖1。與對照組比較，模型組大鼠第1～6周的尾動脈收縮壓均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組大鼠第1～6周的尾動脈收縮壓均顯著降低（P＜0.01）。結果表明，鉤藤降壓解郁方可有效降低HD大鼠的尾動脈收縮壓。

圖1 鉤藤降壓解郁方對高血壓并發抑郁癥大鼠尾動脈收縮壓的影響（±s，n=8）Figure 1 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on tailartery blood pressure in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

2.2 鉤藤降壓解郁方對HD 大鼠糖水偏好率的影響結果見表1。造模第2 周，各組間大鼠的糖水偏好率無明顯差異（P＞0.05）。給藥結束后，與對照組比較，模型組大鼠的糖水偏好率顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組大鼠的糖水偏好率均明顯上升（P＜0.05）。結果表明，鉤藤降壓解郁方可改善HD大鼠抑郁程度。

表1 鉤藤降壓解郁方對高血壓并發抑郁癥大鼠糖水偏好率的影響（±s，n=8）Table 1 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription sucrose preference in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

表1 鉤藤降壓解郁方對高血壓并發抑郁癥大鼠糖水偏好率的影響（±s，n=8）Table 1 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription sucrose preference in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

組別對照組模型組陽性藥組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組糖水偏好率/%造模第2周73.08±9.27 71.85±5.59 69.74±6.25 70.51±6.78 72.57±7.30 73.62±3.45給藥結束后76.08±18.01 48.76±13.00**63.76±7.24△61.98±6.16△61.86±15.67△56.25±6.65△

2.3 鉤藤降壓解郁方對HD 大鼠學習記憶能力的影響結果見表2、圖2。與對照組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），穿越平臺次數及目標象限停留時間占比顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組及鉤藤降壓解郁方高劑量組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05，P＜0.01），穿越平臺次數及目標象限停留時間占比均明顯增加（P＜0.05）。結果表明，鉤藤降壓解郁方能夠改善HD大鼠的學習記憶能力。

表2 鉤藤降壓解郁方對高血壓并發抑郁癥大鼠逃避潛伏期的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on escape latency in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對照組模型組陽性藥組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組逃避潛伏期/s第1天65.09±8.68 64.03±5.42 63.59±6.06 62.44±5.59 61.44±6.71 60.46±12.15第2天51.94±8.86 63.91±3.42*46.84±8.12△△51.03±12.07△51.34±7.02△54.31±14.68第3天29.09±16.78 46.13±6.87**32.94±8.55△34.37±11.11△34.87±12.42 36.84±9.64第4天16.84±5.77 32.56±14.03**17.13±5.62△△21.53±5.95△24.78±9.27 26.94±8.32

2.4 鉤藤降壓解郁方對HD 大鼠血清炎癥因子水平的影響 結果見表3。與對照組比較，模型組大鼠的血清TNF-α、IL-1β 含量顯著上升（P＜0.01），IL-10 含量顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組大鼠的血清TNF-α、IL-1β 含量顯著下降（P＜0.01），IL-10含量顯著上升（P＜0.01）。結果表明，鉤藤降壓解郁方能夠抑制HD 大鼠的血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平，提高抗炎因子IL-10水平。

表3 鉤藤降壓解郁方對高血壓并發抑郁癥大鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，n=8）Table 3 Effects of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on serum inflammatory cytokines in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

表3 鉤藤降壓解郁方對高血壓并發抑郁癥大鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，n=8）Table 3 Effects of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on serum inflammatory cytokines in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別對照組模型組陽性藥組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組TNF-α/（pg·mL-1）158.78±14.14 475.80±23.11**184.57±15.62△△201.06±23.32△△209.74±29.87△△271.40±20.18△△IL-1β/（pg·mL-1）185.04±19.65 543.11±31.61**249.53±10.87△△258.42±19.79△△297.11±40.31△△383.33±53.20△△IL-10/（pg·mL-1）52.30±2.69 20.64±1.36**50.39±2.45△△48.05±2.29△△46.59±2.44△△39.64±3.04△△

2.5 鉤藤降壓解郁方對HD 大鼠海馬組織病理變化的影響 結果見圖3。HE 染色結果顯示，對照組大鼠海馬CA1 區神經元結構完整，軸突布滿整個視野，胞體整齊排列，核質分明。與對照組比較，模型組胞核深染，胞質固縮，細胞凋亡明顯。與模型組比較，陽性藥組及中藥高劑量組的神經元椎體細胞結構相對完整，細胞凋亡明顯減少。尼氏染色結果顯示，對照組大鼠海馬CA1 區神經元細胞核仁清晰，胞體與樹突基部尼氏體豐富。與對照組比較，模型組視野中多空泡狀胞體，胞內尼氏體大量溶解，泛白色。與模型組比較，陽性藥組及中藥高、中劑量組細胞內尼氏體豐富，空泡狀細胞較少。結果表明，鉤藤降壓解郁方能夠減輕HD大鼠海馬神經元損傷。

圖3 鉤藤降壓解郁方對高血壓并發抑郁癥大鼠海馬CA1 區病理變化的影響Figure 3 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on hippocampus CA1 region in hypertension complicated with depression rats

2.6 鉤藤降壓解郁方對HD 大鼠海馬小膠質細胞M1、M2 型活化的影響 結果見圖4。與對照組比較，模型組大鼠海馬小膠質細胞CD206/CD16 熒光強度比明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性藥組及中藥高劑量組大鼠海馬小膠質細胞CD206/CD16 熒光強度比明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，鉤藤降壓解郁方高劑量可提高HD 大鼠海馬M2 型小膠質細胞占比。

圖4 鉤藤降壓解郁方對高血壓并發抑郁癥大鼠海馬小膠質細胞中CD16、CD206 陽性細胞的影響（免疫熒光，×400；±s，n=3）Figure 4 Effects of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on CD16 and CD206 positive cells in the section of hippocampal microglia in hypertension complicated with depression rats（IF，×400；±s，n=3）

2.7 鉤藤降壓解郁方對HD 大鼠海馬組織TLR4、NF-кB p65 蛋白表達的影響 結果見圖5。與對照組比較，模型組大鼠海馬組織TLR4、NF-кB p65 蛋白表達顯著上調（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組及中藥高劑量組大鼠海馬組織TLR4、NF-кB p65蛋白表達明顯下調（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，鉤藤降壓解郁方對HD 大鼠海馬組織TLR4/NF-кB 通路具有抑制作用。

3 討論

本課題組前期采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜技術檢出鉤藤降壓解郁方中51種化合物，主要包括異鉤藤堿、葛根素、丹參酮ⅡA 等[11]。研究[14]表明，異鉤藤堿可通過調節神經炎癥因子及神經營養因子發揮抗抑郁作用。在脂多糖誘導的神經膠質細胞炎癥中，異鉤藤堿能顯著下調炎癥因子TNF-α及IL-1β 水平，抑制中樞炎癥[15]。葛根素具有多種藥理活性，其中樞保護作用與抑制TLR4 蛋白表達來降低促炎因子水平相關[16]。在心血管疾病治療中，葛根素能有效降低原發性高血壓大鼠的收縮壓、舒張壓及心率，其作用機制與血管舒張相關通路有關[17]。丹參酮ⅡA 能通過調節免疫細胞功能來減少炎癥介質產生，如提高抑炎因子IL-10 水平，同時抑制促炎因子TNF-α、IL-1β 表達，在心血管及神經系統疾病方面具有保護作用[18]。還有研究[19]表明，葛根素與丹參酮ⅡA 聯合可以更好地抑制炎癥細胞浸潤，減少心肌細胞破壞。本研究結果表明，鉤藤降壓解郁方可有效降低HD 大鼠的尾動脈收縮壓，并改善其抑郁程度及學習記憶能力，抑制血清促炎因子TNF-α、IL-1β 水平，提高抗炎因子IL-10 水平，表現出較強的抗炎活性。

認知障礙被認為是抑郁癥的核心特征[20]，HD 患者的記憶能力下降程度比單純的高血壓患者表現得更為嚴重[21]。海馬體是腦內掌管學習記憶功能最重要的區域，海馬神經元損傷是認知障礙發生的重要因素。本研究通過水迷宮實驗顯示，鉤藤降壓解郁方能夠有效改善HD 大鼠的學習記憶能力；結合海馬CA1區神經細胞病理學觀察發現，鉤藤降壓解郁方能夠減輕HD 大鼠海馬神經元損傷，表現出較好的神經細胞保護作用。

小膠質細胞是維持中樞神經系統穩態最重要的免疫細胞，其能迅速識別損傷及感染，由靜止轉為活化狀態[22]?；罨男∧z質細胞具有雙重性，根據其特性分為M1 與M2 型，兩者在特定條件下可相互轉化。M1 型小膠質細胞分泌促炎因子，產生神經毒性；而M2型小膠質細胞則可以通過抗炎因子促進炎癥消退，維持大腦環境的穩定[23]。有研究[24]發現，通過IL-4誘導小膠質細胞向M2 型轉化后能減少神經元的損傷與凋亡。因此，誘導小膠質細胞由M1 型向M2 型轉化可促進對中樞神經細胞的保護作用。TLR4 是小膠質細胞表面非特異性免疫模式識別受體，通過激活其下游信號分子NF-κB 誘導小膠質細胞向M1 型活化[25-26]，抑制TLR4/NF-κB 途徑能夠減輕小膠質細胞產生的中樞神經炎癥[27]。通過熒光雙染法標記海馬小膠質細胞中M1、M2 型小膠質細胞的特有標志物CD16、CD206[28-29]，可以分析M2/M1 型小膠質細胞占比。本研究結果表明，鉤藤降壓解郁方高劑量可提高HD 大鼠海馬M2 型小膠質細胞占比，并能下調海馬組織TLR4、NF-кB p65蛋白表達。

綜上所述，鉤藤降壓解郁方可有效降低HD 大鼠的尾動脈收縮壓，并改善其抑郁程度及學習記憶能力，減輕海馬神經元損傷，可能與其通過抑制TLR4/NF-кB 通路提高M2 型小膠質細胞占比，抑制血清促炎因子TNF-ɑ、IL-1β 水平，提高抗炎因子IL-10 水平有關。