長鏈非編碼RNA LINC00987通過細胞色素P450途徑促進AML細胞凋亡的機制研究*

楊彭月， 劉 暄， 王 艷， 徐 玲， 李揚秋， 余錫寶

（暨南大學基礎醫學與公共衛生學院血液學研究所，再生醫學教育部重點實驗室，廣東 廣州 510632）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia， AML）是一種由正常干細胞基因改變引起的高度異質性的惡性克隆性疾病，常見于成人，患者往往伴有不同的細胞遺傳學和分子生物學表現，基于此，FAB系統歸類了8種AML亞型［1-3］?；颊叨嗨烙诠撬杷ソ?，目前，誘導化療、鞏固化療、造血干細胞移植以及新型靶向藥物治療是主要的治療手段。對于初診患者，標準治療方案是“3+7”方案（即3 d的蒽環類藥物聯合7 d的阿糖胞苷），盡管大部分患者緩解率可達60%～80%，但老年患者尤其伴有合并癥或免疫力低下等因素的疾病復發率仍然很高，患者五年生存率不足27%，60歲及以上患者的預后較差，緩解率僅在40%～55%之間［3-4］。因此，研究其發病機制和耐藥機制是改善AML治療效果的關鍵。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA）是一類轉錄本長度大于200nt的RNA分子，不具有編碼蛋白質的功能，但能夠在遺傳水平、轉錄水平和轉錄后水平調節基因的表達，與腫瘤的發展、轉移及耐藥密切相關［5-6］，如lncRNA TDRG1可通過調節miR-101-3p促進結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移［7］。也有文獻報道，lncRNA在AML中異常表達，多種lncRNA如HOTAIRM1、CCDC26、LOC646762可以作為AML的預后生物標志物，或用于白血病的分類和危險分級［8-10］；Qin等［11］發現lncRNA GAS5可通過抑制Nrf2的表達控制細胞的凋亡與增殖，從而抑制AML疾病的發展。

LINC00987是由人第12號染色體編碼的一段lncRNA，在人體骨骼、肺、腦和淋巴結等組織有不同程度的表達，可參與多種疾病，如在骨肉瘤中，LINC00987沉默可通過海綿化miR-376a-5p調節FNBP1的表達進而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［12］；在肺腺癌中LINC00987/A2M軸可作為腫瘤抑制因子和生物標志物評估患者預后［13］；在膠質母細胞瘤中，LINC00987被STAT1激活后通過調節miR-223-3p/FZD4軸誘導腫瘤相關巨噬細胞向M2型極化［14］。也有研究發現，該基因在AML骨髓血中高表達，與AML的預后不良相關［15］，但相關機制的報道甚少。因此，本研究將采用慢病毒包裝shRNA構建LINC00987穩定敲減的Molm13細胞模型，同時檢測該基因在AML細胞中的表達水平，從而進一步研究LINC00987對AML細胞增殖、分化和凋亡等生物學行為的影響及發揮作用的信號通路，明確其在AML病程發展中的作用和機制，為AML診療提供新思路。

材料和方法

1 材料

1.1 病歷資料 本研究外周血標本來自暨南大學第一附屬醫院收治的35例AML初診患者［（56.3±19.4）歲］、8例AML治療緩解（complete remission，CR）患者［（49.9±20.2）歲］和19例健康人［（50.1±15.7）歲］。其中，35例AML患者接受了隨訪，直至患者死亡、失訪或截止2023年8月。CR、危險分層和總生存期（overall survival， OS）的定義見文獻［16］。AML患者依據LINC00987表達水平將其分為LINC00987-Low和LINC00987-High兩組，采用SPSS 20.0軟件對獲得數據進行統計學分析，分析結果見表1。本研究經暨南大學第一附屬醫院倫理委員會批準（倫理編號：2015倫審批科No.9），并根據赫爾辛基宣言患者均獲得知情同意。

表1 AML患者信息Table 1.Clinical characteristics of patients with AML

1.2 細胞系與主要試劑 人急性髓系白血病細胞株Molm13、MV411和人腎上皮細胞系293T為本實驗室長期保存。人淋巴細胞分離液（Ficoll）購自灝洋生物制品科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）、1640培養基、DMEM培養基、TRIzol裂解液購自賽默飛世爾科技公司；RT SuperMix 反轉錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；抗腫瘤藥物阿糖胞苷（cytarabine， AraC）、阿霉素/多柔比星（doxorubicin， Doxor）和維奈托克（venetoclax， ABT-199）購自Selleck；引物均由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

2 主要方法

2.1 數據庫分析 通過Vizome數據庫篩選急性髓系白血病的相關資料，分析AML不同亞型及融合基因患者中LINC00987基因的表達差異，利用統計學軟件進行數據處理，對LINC00987在急性髓系白血病中的表達差異進行描述，并繪制散點圖。在GEPIA數據庫篩與LINC00987表達強相關的基因，通過Enrich R平臺進行信號通路的富集。

2.2 引物和shRNA的設計與合成 從NCBI數據庫查 找LINC00987（Gene ID： 100499405）、CYP11B1（Gene ID： 1584）、CYP2U1（Gene ID： 113612）、CYP2C9（Gene ID：1559）mRNA的序列，并設計合成其特異性檢測引物，引物序列見表2。結合LINC00987mRNA序列進行短發夾RNA設計并合成2條LINC00987 shRNA用于后續實驗，shRNA及對照（sh-NC）序列見表3。

表2 RT-qPCR引物序列表Table 2.The sequences of the primers for RT-qPCR

表3 shLINC00987 oligo 序列Table 3.shLINC00987 oligo sequences

2.3 細胞培養與模型建立 將液氮保存的Molm13、MV411和293T細胞取出復蘇后，加入含10%胎牛血清的1640培養基或DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2環境中培養。待293T細胞增殖狀態良好時將其接種到10 cm培養皿中，在細胞生長至密度60%～75%時進行轉染，8 h后更換成完全培養基，24 h或48 h后收集慢病毒上清液。取2×105處于對數期生長的Molm13細胞培養接種于6孔板，加入適量上述收集的病毒血清，48 h后熒光顯微鏡觀察感染效率，待感染效率達10%時，用嘌呤霉素篩選感染成功的Molm13細胞并獲得穩定細胞株，建立目的基因敲減細胞模型，繼續培養用于后續實驗。RT-qPCR鑒定慢病毒過表達效果。

2.4 RT-qPCR檢測RNA表達水平 取對數生長期Molm13、MV411細胞，離心收集細胞，TRIzol法提取總RNA、反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板、RTqPCR法檢測細胞中LINC00987及CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9 mRNA表達水平。以β-actin為內 參 照，計 算LINC00987、CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9相對表達量，繪制熔解曲線，最終數據以2-ΔΔCt方法進行分析。實驗重復3次。

2.5 細胞凋亡檢測 Annexin V-APC/PI法檢測細胞凋亡。LINC00987穩定敲減的Molm13細胞株接種于6孔板中，用5 μmol/L阿糖胞苷處理細胞，24 h后低速離心收集細胞，使用100 μL 1×Binding buffer重懸細胞，每管加入0.5 μL AnnexinV-APC和1 μL PI避光孵育5 min，使用流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次。FlowJo10軟件分析結果。

3 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，GraphPad Prism 8.0.2軟件進行繪圖。使用Fisher確切概率法（樣本量＜40）對分類資料進行差異比較，Mann-WhitneyU檢驗或t檢驗對連續變量進行差異比較。利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank法進行檢驗。各實驗均獨立重復3次，以均數±標準差（mean±SD）表示正態分布數據。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LINC00987在AML中低表達，且低表達LINC00987與AML患者預后差相關

我們首先通過RT-qPCR檢測LINC00987在AML外周血單個核細胞的mRNA表達水平，結果顯示，與健康人和AML-CR患者相比，LINC00987在AML患者外周血單個核細胞和AML細胞系中低表達，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖1A。采用X-tile軟件計算臨界值將AML患者分為LINC00987低表達組和LINC00987高表達組，結果顯示，低表達LINC00987的AML患者預后較差，差異具有統計學意義（P=0.003），其中LINC00987低表達組的1年OS率僅有12.5%，而LINC00987高表達組的1年OS率達48.1%，見圖1B。此外，利用Vizome數據庫分析發現，LINC00987在FAB-AML分類（M0、M1、M2、M3、M4、M5和M7）患者和伴有不同融合基因（CBFB

Figure 1.Detection of LINC00987 expression in AML.A： LINC00987 expression was analyzed by RT-qPCR；B： prognostic analysis of patients with high and low LINC00987 expression by X-tile software；C： LINC00987 expression in different AML subtypes was analyzed by Vizome database；D： LINC00987 expression in different fusion genes of patients with AML was analyzed by Vizome database.Mean±SD.**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs AML-CR group.圖1 LINC00987在AML中表達情況的檢測

MYH11、DEK-NUP214、GATA2-MECOM、MLLT3-KMT2A、PML-RARA和RUNX1-RUNX1T1）的患者中表達水平略有差異但均低表達，其中在M3亞型和伴有PML-RARA融合基因的患者中較為明顯，而在M7亞型和伴有GATA2-MECOM融合基因的患者中相對較弱，見圖1C、D。

2 LINC00987的表達與AML臨床特征的關系

我們隨后分析LINC00987的表達與臨床特征的關系。如表1所示，低表達LINC00987的患者經治療后緩解的情況差于高表達LINC00987的患者，差異具有統計學意義（P＜0.05）；兩組患者在年齡、年齡分組、性別、白細胞、白細胞分組、血小板、骨髓原始細胞比例、融合基因分型、風險分組、治療方式方面的差異無統計學意義（P＞0.05），但這有可能是我們的標本量小、統計數據部分有缺失。

3 LINC00987在抗腫瘤藥物處理AML細胞株后表達增加

AraC、Doxor、三 氧 化 二 砷（arsenic trioxide，ATO）、ABT-199是可用于治療AML的抗腫瘤藥物［2，17-20］。利用 不 同濃 度（0 μmol/L /0.1 μmol/L /1 μmol/L /10 μmol/L）的AraC、Doxor、ATO、ABT-199分別處理Molm13、MV411兩種AML細胞株，于24 h后收集，RT-qPCR檢測LINC00987的表達水平。結果顯示，四種抗腫瘤藥物均可顯著誘導AML細胞系的LINC00987表達（P＜0.05），見圖2。以上結果提示：LINC00987可能參與腫瘤細胞死亡相關信號通路的激活或介導細胞死亡抵抗。

Figure 2.LINC00987 expression in AML cell lines treated with chemotherapy drugs.A： LINC00987 expression in Molm13 cells treated with AraC；B： LINC00987 expression in Molm13 cells treated with Doxor；C： LINC00987 expression in Molm13 cells treated with ATO；D： LINC00987 expression in Molm13 cells treated with ABT-199；E： LINC00987 expression in MV411 cells treated with AraC；F： LINC00987 expression in Molm13 cells treated with Doxor；G： LINC00987 expression in Molm13 cells treated with ATO；H： LINC00987 expression in Molm13 cells treated with ABT-199.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 mol/L group.圖2 AML細胞株經化療藥物處理后LINC00987的表達情況

4 下調LINC00987表達抑制AraC誘導的AML細胞凋亡

為研究LINC00987在AML中的生物學功能，我們設計了兩條不同的LINC00987 shRNA（對照組為sh-NC），并通過293T細胞包裝慢病毒及感染Molm13獲得LINC00987穩定敲減的AML細胞株，之后予以抗腫瘤藥物AraC（5 μmol/L）處理，通過Annexin V/PI雙染色檢測細胞凋亡情況。與對照組相比，LINC00987敲減抑制了AraC誘導的AML細胞凋亡（P＜0.05），見圖3。表明LINC00987在促進AML細胞凋亡中具有重要作用。

Figure 3.Effect of LINC00987 knockdown on AraC-induced apoptosis of AML cells.A： effect of LINC00987 knockdown on AraC-induced apoptosis of Molm13 cells；B： effect of LINC00987 knockdown on AraC-induced LINC00987 expression levels.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs sh-NC group.圖3 敲減LINC00987對AraC誘導AML細胞凋亡的影響

5 LINC00987通過細胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）介導的氧化應激途徑促進AraC誘導的AML細胞凋亡

進一步探究LINC00987參與AML細胞存活與凋亡的相關上下游分子或信號通路，我們在GEPIA數據庫篩選出了與LINC00987表達強相關的前200個基因，然后通過Enrich R平臺進行信號通路的富集，發現LINC00987共表達基因可富集于CYP450介導的氧化應激通路，見圖4A，且LINC00987的表達與CYP450家族基因CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的表達水平呈正相關，見圖4B。此外，RT-qPCR檢測發現AraC可顯著誘導Molm13細胞CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的mRNA表達（P＜0.05），通過shRNA敲減LINC00987表達后以上mRNA表達被抑制（P＜0.05），見圖4C。綜上所述，LINC00987可能通過CYP450介導的氧化應激途徑促進AraC誘導的AML細胞凋亡。

Figure 4.Signaling pathway enrichment of LINC00987-coexpressed genes and detection of CYP450 family gene expression levels.A： coexpressed genes of LINC00987 were screened using GEPIA database and enriched with Enrich R platform；B： correlation analysis of LINC00987 and CYP450 family gene CYP11B1， CYP2U1 and CUP2C9 expression levels；C： CYP11B1，CYP2U1 and CUP2C9 mRNA expression in Molm13 cells treated with AraC and LINC00987 knockdown.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 mol/L group；#P＜0.05 vs shNC group.圖4 LINC00987共表達基因信號通路富集及CYP450家族基因表達水平檢測

討 論

本研究發現LINC00987在AML外周血單個核細胞低表達，且低表達LINC00987的患者預后較差，與此相反的是，Liu等［21］發現，與健康骨髓樣本相比，AML患者骨髓細胞中LINC00987表達升高，與HS-5健康人骨髓基質細胞相比，THP-1，KG-1，HL-60，U937等AML細胞株LINC00987的表達也顯著升高；Li等［15］發現，AML患者骨髓樣本LINC00987高表達與預后不良相關。上述相反的結果可能與本研究對象為患者外周血樣本，而Li和Liu的研究對象為骨髓樣本有關，且相應的對照組細胞來源也存在差異，此外，鑒于AML異質性較大，不同患者的遺傳學和分子生物學表現常存在差異，且基因的表達往往受多種因子調控，因此上述研究結果的差異可能與樣本細胞組成及處理等諸多原因有關。后續研究需要進一步明確LINC00987在AML病人骨髓和外周血中的表達差異及其與患者生存預后的關系。

進一步研究發現抗腫瘤藥物AraC、Doxor、ATO和ABT-199在抑制AML細胞存活的同時可顯著誘導AML細胞系表達LINC00987，提示LINC00987可能參與了藥物誘導的細胞凋亡過程。進一步應用AraC處理LINC00987穩定敲減AML細胞系發現細胞凋亡受到抑制，表明LINC00987在AML發生發展中發揮著抑癌基因的作用，與AML化療療效密切相關。

進一步通過GEPIA數據庫和Enrich R平臺對LINC00987共表達基因進行篩選和信號通路富集，發現這些基因可富集于CYP450介導的氧化應激通路/網絡，且LINC00987的表達與CYP450家族基因CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的表達水平呈正相關。CYP450是一類主要存在于肝臟和其他組織內質網中的血紅蛋白偶聯單加氧酶，需要輔酶NADPH和分子氧的共同參與來發揮作用，是主要的藥物和毒物代謝酶系統。一方面CYP450活性的變化可以引起細胞周圍環境毒素代謝水平改變，另一方面，CYP450在氧化還原過程中可不斷產生活性氧（reactive oxygen species， ROS）調節氧化應激過程，進而影響細胞的存活與凋亡［22-23］。值得注意的是，ROS在腫瘤的發生發展中通常發揮著雙刃劍的作用，低至中等水平的ROS可以通過誘導細胞增殖、DNA突變和基因組不穩定性等促進腫瘤的發生；高水平的ROS可通過氧化應激促進細胞凋亡和嚴重的細胞損傷，而癌細胞常在腫瘤發展的早期通過壓力選擇不斷進化 出 抗氧 化 機 制［24］。陳 宗 云 等［25］的 研 究 發 現，CYP450家族中重要的藥物代謝酶CYP2B6在CYP2B6 785 A＞G位點攜帶等位基因G可能會增加AML患病風險。有趣的是，AML化療藥物如AraC和ABT-199是CYP450的底物［26-27］，AraC可誘導ROS水平增高，激活AML腫瘤細胞的氧化應激，并引發細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用［28］。這一點與我們的研究結果相符，提示AraC通過促進LINC00987表達進而增高了CYP450活性，通過產生大量ROS促進AML細胞死亡。進一步研究發現，下調LINC00987的表達可抑制阿糖胞苷誘導的CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的mRNA表達，提示LINC00987可能通過CYP450介導的氧化應激途徑促進阿糖胞苷誘導的AML細胞凋亡。但LINC00987的表達情況與ROS水平是否直接或間接相關，有待進一步研究。

綜上，本研究通過體外實驗證實了阿糖胞苷可以激活AML細胞LINC00987的表達，LINC00987可能通過調控CYP450家族基因CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的表達，啟動氧化應激途徑促進AML細胞凋亡，提示LINC00987有望成為AML靶向治療的新靶點，并作為預后標志物幫助評估患者預后，但仍需進一步的驗證。