基于p53/SLC7A11/GPX4信號軸探討七葉內酯誘導小鼠乳腺癌4T1細胞鐵死亡的作用機制*

何 丹， 李琳霈， 譚小寧， 郜文輝， 田雪飛， 曾普華

（1湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410006；2湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006；3湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；4湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208）

據2020年國際腫瘤研究機構（International Agency for Research on Cancer， IARC）數據顯示，乳腺癌在我國女性腫瘤新發病例中位居第一［1］。約5%的患者確診即為乳腺癌晚期，失去最佳手術機會，40%患者即使進行標準治療仍會進展為晚期，且惡性程度高，治療手段局限，導致乳腺癌患者預后較差，治療效果不理想［2］。

近年來，中醫藥在乳腺癌綜合治療中的地位越來越重要。透骨草是大戟科地構葉屬植物地構葉［Phryma leptostachya subsp.asiatica（Hara） Kitamura］的全草，具有祛風除濕、舒筋活血、散瘀消腫和解毒止痛之功效［3］?，F代藥理學研究證明，透骨草在鎮痛、抗炎、抗腫瘤等方面具有廣泛的藥理學作用［4］。七葉內酯（esculetin）是透骨草的主要活性成分之一［5］。研究發現，七葉內酯不僅具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等藥理活性，在抗腫瘤方面也凸顯出重要作用，但其具體作用機制未明［6］。

因此，本研究旨在探討七葉內酯對小鼠乳腺癌4T1細胞的影響及其可能的作用機制，以期為七葉內酯的抗腫瘤作用提供實驗基礎及理論支撐。

材料和方法

1 生信分析

1.1 分子對接 從PubChem下載七葉內酯的3D化學結構圖和SDF文件，使用Pymol將其轉換為PDB格式，然后使用AutoDockTools將PDB格式轉換為PDBQT文件。文件轉換后使用Autodock Vina進行分子對接，通過Pymol構建分子對接結合位點圖。

1.2 生存分析 采用R軟件survival、survminer包，繪制Kaplan-Meier曲線，根據基因表達的中位數分為高（high）、低（low）兩組，分別評估鐵死亡（ferroptosis）相關蛋白p53、溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7， member 11， SLC7A11）和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）對乳腺癌患者生存狀況的影響。采用R軟件time-ROC包，繪制時間依賴性受試者工作特征（time-receiver operating characteristic， time-ROC）曲線，分別評估鐵死亡相關蛋白p53、SLC7A11和GPX4對乳腺癌患者1、3和5年的生存預測效能。

2 體外實驗

2.1 藥品及試劑 七葉內酯（GC38236）購于GLPBIO；陽性對照藥卡培他濱（capecitabine；220618KF）購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；鐵死亡誘導劑erastin（B1524）和鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1；A4371）購于APExBIO；丙二醛（malondialdehyde， MDA）試劑盒（YD-20206）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）試劑盒（YD-20344）和GPX4試劑盒（YD-28280）購于廈門侖昌碩生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species， ROS）試劑盒（E004-1-1）購于南京建成生物工程研究所；亞鐵離子（Fe2+）試劑盒（TC1015）購于雷根生物科技有限公司；GPX4抗體（sc-166570）和?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）抗體（sc-365230）購自Santa Cruz；SLC7A11抗 體（MA5-44922）購 自Thermo Fisher；p53抗 體（ab26）購自Abcam。

2.2 細胞及細胞培養 小鼠源性乳腺癌4T1細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的1640培養基置于二氧化碳培養箱（37 ℃、5% CO2）中培養，隔天觀察細胞貼壁情況并換液，傳代時間為3～4 d。選用對數生長期細胞進行下一步實驗。

2.3 分組及干預 實驗共設6組，分別為對照（control）組、1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組、erastin組和卡培他濱組，每組5個復孔，重復3次。其中，對照組不用藥物處理，藥物干預組按CCK-8實驗結果分別用不同劑量七葉內酯（25、50和100 mg/L）、erastin（10 μg/L）、卡培他濱（1 mg/L）干預24 h。

2.4 檢測指標及方法

2.4.1 CCK-8細胞活力檢測 采用CCK-8檢測七葉內酯不同濃度對4T1細胞毒性和活力的影響，篩選藥物干預濃度。4T1細胞按每孔5×103個的密度種于96孔板，過夜后分別用不同濃度七葉內酯處理24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1 h，酶標儀在450 nm處檢測吸光度（A）值。實驗每組5個復孔，重復3次。

2.4.2 電鏡觀察線粒體形態 4T1細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板，藥物干預24 h后收集細胞，電鏡固定液室溫避光固定30 min，4 ℃過夜，脫水、包埋、切片、染色，并在電鏡下觀察細胞線粒體形態改變，評估線粒體損傷情況。

2.4.3 熒光探針法檢測細胞內ROS水平 4T1細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板，孵育過夜后用相應藥物干預24 h，每孔加入500 μL終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA熒光素，入培養箱避光孵育30 min，PBS洗去未進入細胞的探針，置于熒光顯微鏡下觀察DCF熒光強度。

2.4.4 試劑盒檢測Fe2+、MDA、GSH和GPX4水平4T1細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板，藥物干預24 h后收集細胞上清，按照相應試劑盒說明書檢測Fe2+、MDA、GSH和GPX4水平，以反映4T1細胞脂質過氧化程度。

2.4.5 劃痕實驗 通過劃痕實驗檢測細胞遷移能力。用直尺在6孔板底部均勻劃橫線，4T1細胞以每孔2×105個的密度種板，過夜后用無菌槍頭劃痕，用PBS洗去不貼壁細胞，更換新鮮培養基，加入相應干預藥物。分別于0 h、12 h和24 h在顯微鏡下拍照。

2.4.6 Transwell小室實驗 通過Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力。Matrigel膠稀釋后均勻涂抹于上室表面，37 ℃放置0.5～1 h，使其聚合成凝膠。取對數生長期4T1細胞100 μL加入上室，于培養箱中培養24 h。取出小室，固定、染色、風干后高倍顯微鏡下觀察細胞。

2.4.7 Western blot檢測p53、SLC7A11、GPX4和ACSL4蛋白表達水平 4T1細胞以每孔7×105個的密度接種于大皿，藥物干預24 h后收集細胞，用預冷PBS清洗3遍后進行裂解、蛋白提取，使用BCA法進行蛋白定量后制樣。配膠、上樣、電泳、轉膜、封閉、Ⅰ抗孵育、洗膜、Ⅱ抗孵育、洗膜、曝光后收集蛋白條帶，分析灰度值。

3 統計學處理

采用SPSS 21.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析。計量資料若為正態分布，用均數±標準差（mean±SD）進行統計描述，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩均數比較采用Tukey法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 生信分析

1.1 分子對接 將p53、SLC7A11和GPX4與七葉內酯進行分子對接，展示結合位點。結果表明，七葉內酯與p53、SLC7A11和GPX4具有良好的結合活性，在結合位點緊密相連，其結合能分別為-7.1、-5.3和-7.0，對接結果中結合能（affinity值）越小，說明七葉內酯與p53、SLC7A11和GPX4的相互作用越穩定（圖1）。

Figure 1.Molecular docking of esculetin with p53， SLC7A11 and GPX4.A： the 3D chemical structure chart of esculetin；B， C and D：the protein structure p53， SLC7A11 and GPX4；E， F and G： the binding site of esculetin with p53， SLC7A11 and GPX4.圖1 七葉內酯與p53、SLC7A11和GPX4的分子對接

1.2 生存分析 Kaplan-Meier和time-ROC生存預后分析均提示，在乳腺癌患者中，p53， SLC7A11和GPX4的表達與其生存預后密切相關。Kaplan-Meier曲線生存狀況結果顯示：p53、SLC7A11和GPX4的表達與乳腺癌患者的生存預后相關（P＜0.05），見圖2A～2C。time-ROC生存預測結果顯示，p53在1、3和5年生存預后中的預測效能分別為0.502、0.474、0.505，SLC7A1的預測效能分別為0.493、0.597和0.548，GPX4的預測效能分別為0.603、0.468和0.438，見圖2D～2F。

Figure 2.Prognostic analysis of p53， SLC7A11 and GPX4 in breast cancer patients.A， B and C： the Kaplan-Meier curves of p53，SLC7A11 and GPX4；D， E and F： the time-ROC curves of p53， SLC7A11 and GPX4.圖2 乳腺癌患者中p53、 SLC7A11和GPX4的預后分析

2 體外實驗

2.1 七葉內酯對4T1細胞活力的影響 CCK-8實驗結果顯示，與空白組比較，當七葉內酯濃度≤6.25 mg/L時，對4T1細胞活力未見明顯抑制作用；當七葉內酯濃度為50 mg/L時，對4T1細胞的抑制率約為50%，即七葉內酯對4T1細胞的IC50為50 mg/L；當七葉內酯濃度為100 mg/L時，對4T1細胞的抑制率≥50%。因此，后續實驗中選取25 mg/L（1/2 IC50）、50 mg/L（IC50）和100 mg/L（2 IC50）作為七葉內酯的干預劑量（圖3）。

Figure 3.Effect of esculetin on the viability of 4T1 cells.CCK-8 was used to detect the effects of different concentrations of esculetin on the viability of 4T1 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 七葉內酯對4T1細胞活力的影響

2.2 七葉內酯對4T1細胞線粒體形態的影響 線粒體電鏡結果顯示，對照組細胞線粒體形態正常，結構完整，線粒體嵴的數目及形態正常，細胞核膜結構清晰；與對照組比較，七葉內酯能損傷線粒體形態，使線粒體嵴減少甚至消失，細胞核膜結構不清晰（圖4）。

Figure 4.Effect of esculetin on mitochondrial morphology of 4T1 cells.After 24 h of drug intervention， the 4T1 cells were collected，and the morphological changes of mitochondria were observed under electron microscope.圖4 七葉內酯對4T1細胞線粒體形態的影響

2.3 七葉內酯對4T1細胞ROS水平的影響 如圖5所示，與對照組比較，七葉內酯干預能升高4T1細胞中ROS水平，其中七葉內酯1/2 IC50、IC50和2 IC50組分別升高了21.49%、32.06%和45.17%（P＜0.05）；與七葉內酯IC50組比較，erastin和卡培他濱組ROS水平分別升高了15.82%和12.51%。

Figure 5.Effect of esculetin on ROS levels in 4T1 cells.The 4T1 cells were treated with DCFH-DA fluorescent probe for 30 min after 24 h of drug intervention， and the fluorescence intensity was observed under fluorescence microscope.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.圖5 七葉內酯對4T1細胞ROS水平的影響

2.4 七葉內酯對4T1細胞脂質過氧化程度的影響如圖6所示，與對照組比較，七葉內酯干預能升高4T1細胞中Fe2+和MDA水平，降低GSH和GPX4水平。其中，七葉內酯1/2 IC50、IC50和2 IC50組Fe2+及MDA水平分別升高了1.85倍、2.17倍和2.94倍，以及0.4倍、2.1倍和3.82倍（P＜0.05）。七葉內酯1/2 IC50、IC50和2 IC50組GSH和GPX4水平分別降低了0.22倍、0.39倍和0.46倍，以及0.19倍、0.38倍和0.49倍（P＜0.05）。

Figure 6.Effect of esculetin on the degree of lipid peroxidation in 4T1 cells.After 24 h of drug intervention， the 4T1 cell supernatant was collected and the levels of Fe2+ （A）， GPX4 （B）， GSH （C） and MDA （D） were detected by kits.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.圖6 七葉內酯對4T1細胞脂質過氧化程度的影響

2.5 七葉內酯對4T1細胞遷移能力的影響 如圖7所示，對照組中4T1細胞生長狀態及遷移能力良好，隨時間推移劃痕逐漸變窄，說明4T1細胞具有較好的遷移能力。與對照組比較，七葉內酯干預能降低4T1細胞的遷移能力（P＜0.05）。其中，0 h時各組細胞遷移能力無變化，12 h時可見細胞遷移，24 h時細胞藥物干預組遷移緩慢，劃痕較對照組增寬。

Figure 7.Effect of esculetin on migration ability of 4T1 cells.Scratch healing was observed at 0， 12 and 24 h after drug intervention.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.圖7 七葉內酯對4T1細胞遷移能力的影響

2.6 七葉內酯對4T1細胞侵襲能力的影響 如圖8所示，對照組中4T1細胞穿膜數為307.60±28.95，七葉內酯1/2 IC50組、IC50組和2 IC50組4T1細胞穿膜數分 別 為241.60±20.75、173.50±14.94和133.80±12.51，erastin和卡培他濱組4T1細胞穿膜數分別為130.6±11.24和116.2±10.85，顯著低于對照組（P＜0.05），提示七葉內酯、erastin和卡培他濱可抑制4T1細胞侵襲能力，且呈劑量依賴性。

Figure 8.Effect of esculetin on the invasion ability of 4T1 cells.The invasion of 4T1 cells was observed after 24 h of drug intervention in Transwell chamber.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.圖8 七葉內酯對4T1細胞侵襲能力的影響

2.7 七葉內酯對4T1細胞p53、SLC7A11、GPX4和ACSL4蛋白表達的影響 如圖9所示，與對照組比較，七葉內酯、erastin和卡培他濱干預后的4T1細胞中SLC7A11和GPX4蛋白表達降低，p53和ACSL4蛋白表達升高（P＜0.05），提示七葉內酯、erastin、卡培他濱可通過調控鐵死亡相關的p53、SLC7A11、GPX4和ACSL4蛋白表達誘導4T1細胞鐵死亡。

Figure 9.Effect of esculetin on ferroptosis related proteins in 4T1 cells.After 24 h of drug intervention， 4T1 cells were collected and Western blot experiment was performed to observe the protein expression of p53， SLC7A11， GPX4 and ACSL4.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.圖9 七葉內酯對4T1細胞鐵死亡相關蛋白的影響

討 論

七葉內酯是我國傳統中藥透骨草的重要活性成分。近年來，其其抗腫瘤藥理活性在越來越多的研究中得到證實［7-8］。erastin是一種鐵死亡誘導劑，能夠誘導非凋亡的細胞死亡，這種誘導效應取決于氧化應激水平和細胞鐵的積累［9］?？ㄅ嗨麨I是一種抗腫瘤藥物，具有抑制細胞分裂、干擾蛋白質合成、抑制腫瘤生長等作用［10］。鐵死亡是一種鐵依賴性的，不同于凋亡、自噬、壞死的細胞程序性死亡方式，近年來與腫瘤的發生發展密切相關［11］。因此，本實驗探討了七葉內酯在乳腺癌4T1細胞鐵死亡中的作用及其分子機制。

鐵死亡的發生機制主要與細胞脂質過氧化以及抗氧化系統失活相關［12］。在脂質過氧化中，Fe2+是鐵死亡最直接的促進因素，是鐵死亡的典型標志之一［13］。Fe2+的累積會導致細胞膜脂質過氧化反應，甚至誘導氧化應激，促進ROS和MDA大量累積，引起細胞死亡［14］。在本實驗中，我們以不同濃度（25、50和100 mg/L）的七葉內酯對4T1細胞進行了干預，結果發現七葉內酯處理可明顯降低細胞存活率。在Fe2+、ROS和MDA的檢測中發現，七葉內酯干預后的4T1細胞中Fe2+、ROS和MDA水平升高，提示七葉內酯能促進4T1細胞脂質過氧化反應。

GSH和GPX4在鐵死亡的抗氧化系統中起主要作用［15］。GSH是細胞中的主要抗氧化劑，也是GPX4的首選底物，GSH在GPX4的作用下會減少 ROS在細胞中的累積，進而抑制鐵死亡［16］。相反，GSH和GPX4活性的抑制可導致脂質過氧化物積累，同時，ACSL4可激活多不飽和脂肪酸，協同促進脂質過氧化反應，加速鐵死亡的發生［17］。SLC7A11是鐵死亡中的關鍵上游調節因子之一，p53是一種腫瘤抑制基因。研究發現，p53可通過抑制SLC7A11的表達及活性，調節GPX4表達，促進細胞發生鐵死亡［18］。本研究在GSH和GPX4的檢測中發現，七葉內酯干預后的4T1細胞中GSH和GPX4水平降低，Western blot結果顯示SLC7A11和GPX4蛋白表達水平降低，p53和ACSL4蛋白表達水平升高，提示七葉內酯可通過調控p53、SLC7A11、GPX4和ACSL4蛋白表達誘導4T1細胞鐵死亡。為驗證七葉內酯是否通過鐵死亡促進細胞死亡，本實驗采用鐵死亡抑制劑Fer-1對4T1細胞進行阻斷實驗，結果發現，Fer-1干預可逆轉七葉內酯誘導的鐵死亡。

此外，線粒體在半胱氨酸剝奪誘導的鐵死亡中起著關鍵作用，主要原因是半胱氨酸缺乏會導致線粒體膜電位超極化和脂質過氧化物積累，進而誘發鐵死亡［19-20］。本實驗對4T1細胞線粒體進行了觀察，結果發現對照組細胞線粒體形態正常，結構完整，線粒體嵴的數目及形態正常，細胞核膜結構清晰；而七葉內酯處理后的細胞線粒體形態出現損傷，線粒體嵴減少甚至消失，細胞核膜結構不清晰。

腫瘤細胞的遷移和侵襲是導致腫瘤患者預后不良的重要原因，因此，本研究還進行了細胞劃痕及Transwell小室實驗，以檢測七葉內酯對4T1細胞遷移和侵襲能力的影響。實驗結果表明，七葉內酯可降低細胞劃痕愈合能力及侵襲細胞數量，并伴有濃度依賴性，說明七葉內酯可抑制4T1細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究結果表明，七葉內酯可抑制4T1細胞的增殖、遷移及侵襲能力，并通過調控p53/SLC7A11/GPX4信號通路誘導4T1細胞發生鐵死亡，進而抑制乳腺癌的發生發展，為七葉內酯可能成為新型抗腫瘤藥物提供了實驗依據。