血液病患者產生抗HLA 抗體的危險因素分析

季開 王瀾 陳璐瑤 鮑曉晶 袁曉妮 吳小津 何軍

(蘇州大學附屬第一醫院1.血液科，2.江蘇省血液研究所HLA 配型實驗室，江蘇 蘇州 215031)

抗HLA 抗體是人體通過妊娠、輸血、移植等途徑發生同種異體免疫反應而產生的針對HLA 抗原的抗體[1]，其中針對供者HLA 抗原的抗HLA 抗體稱為抗供者特異性抗體(donor specific antibodies，DSA)。 目前異基因造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)技術日趨成熟，但移植前患者存在抗HLA 抗體是影響移植預后的因素之一，很大程度上影響著移植的過程與結局。 國內外多個移植中心的研究均表明，移植前患者體內預存的抗HLA 抗體，特別是DSA 會導致移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)、移植物植入延遲甚至植入失敗(graft failure，GF)等不良事件的發生，直接影響血液病患者的移植效果[2-15]。 由于HLA 等位基因頻率在不同民族和地域的人群中存在差異，所編碼的HLA 抗原具有高度多態性和個體差異性，導致免疫產生的抗HLA 抗體呈現多樣化。 本文通過單中心回顧性研究分析了影響血液疾病患者抗HLA 抗體產生的危險因素，可為臨床工作者識別高危因素的患者提供參考，從而對高滴度抗HLA 抗體或者DSA 采取治療措施盡早進行抗體清除，以降低移植的風險和提高移植獲益。

1 資料與方法

1.1 研究對象

以2016 年1 月1 日—2018 年12 月31 日期間在本院擬進行HSCT 并且在本院HLA 配型實驗室內進行抗HLA 抗體檢測的1 008 名血液病患者作為研究對象，標本均為患者移植前獲取，收集其抗體檢測結果及臨床資料。

1.2 抗HLA 抗體檢測及結果判斷

在流式液相芯片(Luminex)[16]技術平臺進行抗HLA 抗體檢測，首先采用混合抗體檢測法(mixed antigen screen beads，MIX)進行抗HLA-Ⅰ類、抗HLA-Ⅱ類抗體初篩檢測，若檢測結果存在疑問，則補充進行抗體特異性檢測(single antigen beads，SAB)，以明確抗HLA 抗體的陽性情況和類型。 MIX 檢測采用美國One Lambda 公司生產的抗HLA 抗體檢測試劑盒(LSM12，LAB Screen Mixed，Lot021)，SAB 檢測采用美國One Lambda 公司生產的LAB Screen＠Single Antigen HLA Class I(LS1 A04)和LAB Sereen＠Single Antigen HLA Class 11(LS2A01)。 試劑廠家提供的說明書沒有判斷抗HLA 抗體的陽性和陰性值，實驗室可自行建立。

本實驗室制定抗HLA 抗體陽性和陰性判定標準的方法如下:分析2012-2019 年間實驗室參加美國組織相容性和免疫遺傳學會(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics，ASHI)組織的抗HLA 抗體國際間能力驗證項目，實驗室和同期國際多中心所上報全部抗體的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)值及對該抗體判斷其陽性和/或陰性符合率，以不同的抗HLA 抗體符合率將MFI 值由高到低分成可能飽和度值、陽性決定值、陽性判定界限值、可疑陽性參考值及可疑陰性參考值5 個區間，建立本實驗室的抗HLA 抗體判定界限值。 根據本實驗室發表文章的結果，抗HLA 混合抗體檢測試劑1 ～17 號微珠的MFI 值為26.86 ～21 925.58，NBG 比值為0 ～434.65。 按照包被抗原對應單抗原試劑的陽性檢出率，將各混合試劑微珠的MFI 值及NBG 比值分段為陽性區間、可疑陽性區間、可疑陰性區間、陰性區間。 當某區段90% 以上單抗原試劑檢測抗體MFI 值達到5 000、8 000 或10 000 時，各混合試劑微珠在該區段的最低MFI 值分別設定為強陽性、強強陽性、強強強陽性界限值(詳見參考文獻18:表1、表2)[17-18]。 由本實驗室制定的這一判定抗HLA 抗體陽性和陰性的判斷標準，既反映了本實驗室針對抗HLA-Ⅰ類抗體、抗HLA-Ⅱ類抗體特異性檢測結果的判定情況，同時也借鑒了國際間中心的抗體檢測情況，并征求了臨床醫生的意見和建議，具有一定應用和推廣價值。

1.3 研究因素

1)疾病確診至抗體檢測采樣時間:患者從確診之日起(包括在本院或在外院確診)，到在本院進行抗體檢測采樣之日為止，期間所經歷的時間，以“天”(d)為單位。 2)初診白細胞(WBC)、血紅蛋白(Hb)及血小板(PLT)計數:指患者因本病初次就診時的WBC、Hb 和PLT 計數(包括在本院或外院就診)。 3)既往史、感染史、妊娠史:患者初次在本院進行抗體檢測采樣前的相應病史，以“有”和“無”進行統計。 4)入院前輸血史:指患者來本院就診前的輸血情況，以“有”和“無”進行統計。 5)入院后輸血史:指患者自在本院就診之日起，到進行抗體檢測的采樣之日止，在此期間的輸血情況，以“有”和“無”進行統計。 6)紅細胞(RBC)、PLT、血漿(FP)的輸注總量、輸注次數:均指患者來本院就診后至抗體檢測采樣前的詳細輸血情況。

1.4 統計學分析

抗HLA 抗體陽性率＝抗HLA 抗體檢測陽性人數/總人數。 對影響抗體產生的因素采用IBM 公司SPSS26.0 軟件進行統計學分析，單因素分析計數資料的組間比較采用皮爾森卡方(Pearson′s chisquared test)檢驗；計量資料經檢驗均符合非正態分布，用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線篩選出具有診斷價值的因素(曲線下面積＞0.5)，再根據坐標求出最佳截斷點，用截斷點對應的值將計量資料轉換為計數資料進行比較，最終年齡、疾病確診至抗體檢測采樣的時間、妊娠次數、入院后至抗體檢測采樣前RBC 輸注總量、RBC 輸注次數、PLT 輸注總量、PLT 輸注次數、FP輸注總量、FP 輸注次數和輸血總次數轉換為計數資料進行統計分析。 ROC 曲線中無明確診斷意義的因素，結合臨床人為確定相應的截斷值或直接作為計量資料納入研究，最終初診Hb 和PLT 計數按照輸血的臨界值(Hb:＜60g/L VS ≥60g/L，PLT:＜20×109/L VS ≥20×109/L)進行分類，轉變為計數資料后進行比較；而初診WBC 計數視作計量資料，采用曼-惠特尼U 檢驗(Mann-Whitney U test)或克魯斯卡爾-沃利斯H 檢驗(Kruskal-Wallis H test)進行分析。 多因素分析采用二元Logistic 回歸模型進行。 對影響抗體類型的單因素分析參考上文進行，多因素分析采用多元Logistic 回歸模型進行。 雙側檢驗，P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 基本臨床信息

共納入1 008 名患者，其中男性575 名，女性433 名；中位年齡35(26 ～47)歲，＜35 歲患者486名，≥35 歲患者522 名；疾病診斷包括急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)患者408名、急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)患者226 名、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)患者141 名、再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)患者123 名和其他血液病患者(other hematologic diseases，Others)110 名。

2.2 抗HLA 抗體陽性率

所有患者中共有250 名在移植前檢測出抗HLA 抗體，陽性率為24.80%(250/1 008)；其中在男性和女性患者中分別有80 名和170 名檢測出抗HLA 抗體，陽性率分別為13.91%(80/575) 和39.26%(170/433)；在年齡＜35 歲和年齡≥35 歲的患者中分別有88 名和162 名檢測出抗HLA 抗體，陽性率分別為18.11%(88/486)和31.03%(162/522)；在AML、ALL、MDS、AA 和其他患者中分別有112、28、51、34、25 名檢測出抗HLA 抗體，陽性率分別為27.45%(112/408)、12.39%(28/226)、36.17%(51/141)、27.64%(34/123)和22.73%(25/110)。 抗體陽性人群特征:女性陽性率高于男性，≥35 歲年齡段陽性患者較多，疾病診斷以MDS、AML 和AA 較高，ALL 較低。

2.3 影響抗HLA 抗體產生的危險因素

2.3.1 單因素分析

單因素分析顯示，陽性組與陰性組患者相比較，性別、年齡、疾病確診至抗體檢測采樣前時間、初診WBC 計數、Hb 計數、PLT 計數、妊娠史、妊娠次數、入院前和入院后輸血史、RBC、PLT 和FP 的輸注總量、輸注次數及輸血總次數這些因素之間有顯著性差異，P值均＜0.05(表1)。

2.3.2 多因素分析

二元Logistic 回歸結果顯示:年齡≥30 歲、疾病確診至抗體檢測的時間≥41 d、初診PLT 計數＜20×109/L、抗體檢測采樣前有妊娠史、入院前有輸血史和入院后PLT 輸注總量≥30 U，為影響抗HLA 抗體產生的獨立危險因素(圖1)。

2.4 影響抗HLA 抗體類型的危險因素

2.4.1 單因素分析

單因素分析顯示，性別、年齡、疾病確診至抗體檢測采樣前時間、初診WBC、Hb 計數及PLT 計數、妊娠史、妊娠次數、入院前及入院后輸血史、入院后RBC、PLT、FP 的輸注總量和輸注次數及輸血總次數與不同類型的抗HLA 抗體產生有關，P值均＜0.05(表2)。

因素總體(n ＝1 008)未檢出抗體(n＝758)檢出抗體(n ＝250)χ2/U 值P 值性別85.0930.000男575(57.04)495(65.30)80(32.00)女433(42.96)263(34.70)170(68.00)年齡(歲)35(26-47)33(24-46)40(30-49)31.3320.000＜30371(36.81)316(41.69)55(22.00)≥30637(63.19)442(58.31)195(78.00)疾病確診至抗體檢測采樣時間(d)30(4-110)23(3-93)63.5(11.75-164.25)31.3050.000＜41557(55.26)457(60.29)100(40.00)≥41451(44.74)301(39.71)150(60.00)WBC(×109/L)5.86(2.30-32.23)6.57(2.34-37.03)4.39(2.12-16.74)84 163.000?0.008 Hb(g/L)80(64-100)83(65-104)74(61-93)4.3210.038＜60189(18.75)131(17.28)58(23.20)≥60819(81.25)627(82.72)192(76.80)PLT(×109/L)43(20-97)47(22-107.25)34.5(16.75-71.25)8.8630.003＜20244(24.21)166(21.90)78(31.20)≥20764(75.79)592(78.10)172(68.80)既往史5.1690.023無598(59.33)465(61.35)133(53.20)有410(40.67)293(38.65)117(46.80)感染史1.3600.243無899(89.19)681(89.84)218(87.20)有109(10.81)77(10.16)32(12.80)妊娠史128.6940.000無684(67.86)587(77.44)97(38.80)有324(32.14)171(22.56)153(61.20)妊娠次數(次)0(0-1)0(0-0)1(0-2)128.6940.000＜1684(67.86)587(77.44)97(38.80)≥1324(32.14)171(22.56)153(61.20)入院前輸血史12.9010.000無470(46.63)378(49.87)92(36.80)有538(53.37)380(50.13)158(63.20)入院后輸血史25.7150.000無539(53.47)440(58.05)99(39.60)有469(46.53)318(41.95)151(60.40)RBC 輸注總量(U)0(0-3.5)0(0-3)0(0-5.63)19.3740.000＜1.5645(63.99)514(67.81)131(52.40)≥1.5363(36.01)244(32.19)119(47.60)RBC 輸注次數(次)0(0-2)0(0-2)0(0-3)18.6710.000＜1643(63.79)512(67.55)131(52.40)≥1365(36.21)246(32.45)119(47.60)PLT 輸注總量(U)0(0-25)0(0-15)10(0-55)41.6080.000＜30762(75.60)611(80.61)151(60.40)≥30246(24.40)147(19.39)99(39.60)PLT 輸注次數(次)0(0-3)0(0-2)1(0-6)32.0750.000＜2697(69.15)560(73.88)137(54.80)≥2311(30.85)198(26.12)113(45.20)FP 輸注總量(mL)0(0-0)0(0-0)0(0-250)15.5360.000＜100812(80.56)632(83.38)180(72.00)≥100196(19.44)126(16.62)70(28.00)FP 輸注次數(次)0(0-0)0(0-0)0(0-1)15.5360.000＜1812(80.56)632(83.38)180(72.00)≥1196(19.44)126(16.62)70(28.00)輸血總次數(次)0(0-5)0(0-4)2(0-11)26.7150.000＜1539(53.47%)440(58.05%)99(39.60%)≥1469(46.53%)318(41.95%)151(60.40%)

2.4.2 多因素分析

多元Logistic 回歸分析結果顯示:年齡≥30 歲的患者相比＜30 歲的患者更容易產生抗HLA-Ⅰ類抗體，抗體檢測采樣前有妊娠史的患者相比無妊娠史的患者更容易產生抗HLA-Ⅱ類抗體；疾病確診至抗體檢測時間≥41d 相比＜41d 的患者、初診PLT計數＜20×109/L 相比≥20×109/L 的患者、抗體檢測采樣前有妊娠史相比無妊娠史的患者、入院前有輸血史相比無輸血史的患者、入院后PLT 輸注≥30U 相比＜30U 的患者更容易產生抗HLA-Ⅰ＋Ⅱ類抗體(圖2)。

圖2 影響抗HLA 抗體類型的多因素分析Figure 2 Multivariate analysis of factors affecting anti-HLA antibody types

3 討論

本研究發現患者初診時的PLT 計數、入院后的PLT 輸注總量均是影響抗HLA 抗體產生的重要因素。 這可能是由于初診時PLT 計數低于臨床危急值的患者在治療過程中需要輸注更多的PLT，而HLA 抗原廣泛存在于PLT 表面，故異體PLT 表面攜帶的豐富抗原會刺激人體產生抗HLA 抗體；同時抗HLA 抗體又會破壞攜帶相應抗原的PLT[19]，反過來使患者PLT 水平持續低下，進一步增加PLT輸注量和次數，形成惡性循環。 因此對于PLT 輸注效果不佳的患者，應考慮進行抗HLA 抗體檢測，尤其是對于MFI 高的患者，可采取輸注相匹配HLA抗原，或規避異源型抗原刺激等方法輸注PLT，以此改善輸血效果。 對于將接受移植的血液病患者，如果化療后骨髓抑制時間長、程度重，要及時加用促造血藥物促進血細胞回升，合理選用對血細胞影響小的抗生素預防感染[20]，避免由感染刺激導致的抗體產生和血細胞消耗增加，盡可能減少輸注量和次數，從而減少抗HLA 抗體的產生。

在接受單倍體移植的血液病患者、老年血液病患者、兒童血液病患者和接受同胞全相合移植的血液病患者中，國內研究顯示移植前抗HLA 抗體的陽性率分別為21.0%、26.7%、13.0%和25%[21-24]。Ciurea 等學者報道，在惡性血液病患者中，抗HLA抗體的陽性率在18%～39.4%之間[25-28]；而國內不同地區健康人群中抗HLA 抗體的陽性率約為0.6%～13.38%[29-32]，明顯低于血液病患者，提示血液病本身或不同的治療手段(如輸血等)等因素有可能導致了其抗體陽性率高于健康人群。 Nickel 等報道，抗HLA 抗體陽性，尤其是抗HLA-Ⅰ類抗體陽性的患者，相比陰性患者接所受的血小板輸注量明顯更多[33-34]；還有學者研究顯示，疾病診斷、性別、年齡、妊娠史和輸血史與抗HLA 抗體的產生與有關[21，23，24]，本研究關于影響抗體產生的危險因素的結果支持這一觀點。

年齡較大的血液病患者的相關研究發現，妊娠史與抗HLA-Ⅰ類抗體的產生有關，病程(≥7.5 個月)與高MFI 水平的抗HLA-Ⅰ類抗體有關[23]；對兒童患者的相關研究發現，輸血與抗HLA-Ⅰ類抗體的產生相關[24]。 本研究發現，年齡與抗HLA-Ⅰ類抗體的產生相關，這可能是因為年齡越大的患者，經歷更長的病程和更多的妊娠次數(對于女性而言)，而更長的病程則伴隨更多的輸血量和次數，最終影響抗HLA-Ⅰ類抗體的產生。 另外有研究發現，在年齡較大的血液病患者中，女性與抗HLA-Ⅱ類抗體的產生有關[23]；另1 項對孕婦妊娠期間抗HLA 抗體檢出情況的研究顯示，經產婦比初產婦更容易檢測到抗HLA 抗體，且抗HLA-Ⅱ類抗體在妊娠晚期的陽性率會增加[35]。 本研究認為妊娠史與抗HLA-Ⅱ類抗體的產生有關，與這些文獻報道相一致。

由于HLA-Ⅰ類抗原廣泛分布在體內包括PLT在內的多種細胞表面，通過輸血進入受者體內的異體血制品所攜帶的I 類抗原會刺激機體產生抗HLA-Ⅰ類抗體。 也有研究顯示，PLT 輸注同時與抗HLA-Ⅰ＋Ⅱ類抗體的產生有關[23]，而該課題組的另1 項研究則顯示，女性、既往輸血或妊娠與抗HLA-Ⅰ＋Ⅱ類抗體陽性有關[21]。 本研究結果則表明，病程、初診PLT 計數、抗體檢測前輸血史、妊娠史和PLT 輸注量會影響抗HLA-Ⅰ＋Ⅱ類抗體的產生，提示除了輸血和妊娠各自的影響之外，更多的因素可產生交互影響，影響抗HLA-Ⅰ類和抗HLA-Ⅱ類兩種抗體同時產生。

綜上所述，抗HLA 抗體的產生與多種因素有關，如年齡、病程、輸血、妊娠等因素均可能影響抗HLA 抗體的產生。 目前抗HLA 抗體對于造血干細胞移植預后的不利影響已成為共識，因此對行HSCT 的血液病患者，在移植前應常規檢測抗HLA抗體，這對于選擇合適供者和評估移植風險具有重要價值。 對于具有移植相關危險因素的患者，應重點進行監測，必要時采取治療措施清除抗體或降低其MFI 值，以最大程度規避移植風險。 待確定供者后，還應該結合供、受者HLA 高分辨基因分型，定性、定量分析患者體內抗HLA 抗體情況，并以移植前抗HLA 抗體檢測結果為基線和參考，動態追蹤移植后不同時間內患者的抗體檢出情況、抗體類型和MFI 值的變化，結合臨床及時予以相應的處理，降低抗HLA 抗體對移植的影響，改善HSCT 預后[36]。