腸道菌群與叢集性頭痛的因果關系：兩樣本孟德爾隨機化分析

郭玉夢，崔楊霖，孔雨晨，高磊，張憲忠

作者單位：1.250014 山東省濟南市，山東中醫藥大學 2.276800 山東省日照市中醫醫院中醫經典科

叢集性頭痛（cluster headache，CH）是最嚴重的原發性頭痛類型，常單側發作并出現嚴重的頭面部疼痛［1］，通常伴有同側自主神經癥狀，如上瞼下垂、瞳孔縮小、面部發紅或潮紅、鼻塞、流涕、眶周腫脹、煩躁不安或激越等，但其病理生理學機制復雜［2］。研究表明，約55%的CH患者發作期出現自殺傾向，故其又被稱為“自殺性頭痛”［3］。既往研究表明，CH與偏頭痛具有部分相同的臨床特征，包括前驅癥狀、發作性視覺超敏反應、發作性異常性疼痛和自主神經癥狀［4］。全基因組關聯研究薈萃分析結果顯示，CH與偏頭痛至少共享1個遺傳位點，故兩者具有部分相同的解剖結構和病理生理學機制［5］。研究表明，腸道菌群與偏頭痛的發病相關［5-6］，如TANG等［7］研究發現，腸道菌群紊亂可能通過上調TNF-α表達而導致偏頭痛的發生?；贑H與偏頭痛存在相似性，筆者提出腸道菌群也是誘發CH的病理因素的假設?；诖?，本研究采用兩樣本孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）分析探討腸道菌群與CH的因果關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究設計

采用兩樣本MR分析方法，以腸道菌群為暴露因素，CH為結局，分析腸道菌群與CH的因果關系。

1.2 數據來源

1.2.1 腸道菌群數據集

腸道菌群數據集來自MiBioGen聯盟（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）的匯總數據，該數據集包括18 340例不同種族和國籍的參與者的16S rRNA基因測序數據（72.3%為歐洲人，27.7%為中東、東亞、美國西班牙裔/拉丁裔和非裔美國人）［8］，共涉及1 053 032 560個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）。

1.2.2 CH數據集

CH數據集來自R9版本的芬蘭數據庫（https://r9.finngen.fi/），該數據集包括288 944例參與者，其中CH患者1 107例、健康對照者287 837例，共涉及20 167 676個SNP。

1.3 篩選工具變量

剔除15種未知菌屬后，本研究共納入196種腸道微生物。各腸道微生物工具變量應滿足以下條件：（1）在基因位點范圍內存在顯著性閾值（P＜1.0×10-5）的SNP被作為潛在工具變量［9］；（2）排除連鎖不平衡的SNP，即r2＜0.001；（3）區域寬度為10 000 kD，以確保各SNP間相互獨立；（4）選取F＞10的SNP，以排除弱工具變量［10］。F值計算公式如下：F=β2/se2［11］，其中β為效應值、se為標準誤。

1.4 兩樣本MR分析過程

1.4.1 正向MR分析

（1）MR分析方法：本研究主要采用逆方差加權法（inverse variance weighting，IVW）進行MR分析，以探討腸道菌群與CH的潛在因果關系，并采用錯誤發現率（false discovery rate，FDR）校正P值，以P＜0.05且PFDR＜0.10為存在因果關系，P＜0.05且PFDR≥0.10為可能存在潛在關聯［12-13］。其次，以MR-Egger回歸、加權中位數法（weighted median estimator，WME）、加權眾數法（weighted mode，WM）、簡單眾數法（simple mode，SM）作為IVW的補充方法，當MR-Egger回歸、WME、WM、SM的β值與IVW的β值方向一致時，提示IVW結果穩定可靠［14］。（2）統計學異質性：應用CochranQ檢驗評估SNP間是否存在統計學異質性，P＜0.05提示SNP間存在統計學異質性。（3）水平多效性：采用MR-Egger回歸的截距項評估SNP的水平多效性，若截距項與0相比無統計學意義，表明SNP不存在水平多效性［15］。（4）離群值：采用MR-PRESSO法識別SNP的離群值，并剔除離群值后重新進行MR分析［16］。（5）敏感性分析：采用留一法進行敏感性分析，以判斷單個SNP對MR分析結果的影響［17］。

1.4.2 反向MR分析

以CH為暴露因素，腸道菌群為結局，僅采用IVW、MR-Egger回歸分析腸道菌群與CH的反向因果關系。

2 結果

2.1 工具變量

196種腸道微生物包括9門、16綱、20目、32科、119屬，共得到2 774個與腸道微生物高度相關的SNP。

2.2 正向MR分析

IVW 分析結果顯示，放線菌門是CH 的危險因素〔OR=1.786，95%CI（1.154 ～2.764），P=0.009，PFDR=0.046〕，糞球菌屬1是CH的保護因素〔OR=0.563，95%CI（0.355～0.894），P=0.015，PFDR=0.074〕，副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、瘤胃球菌屬UCG003組與CH具有潛在關聯（P值分別為0.036、0.036、0.048，PFDR值分別為0.180、0.180、0.240）。且MR-Egger回歸、WME、WM、SM的β值與IVW的β值方向一致，見表1、圖1。

圖1 腸道菌群與CH因果關系的5種MR分析方法結果散點圖Figure 1 Scatter plots of the results of five MR analysis methods for the causal relationship between intestinal flora and CH

CochranQ檢驗分析結果顯示，與上述5種腸道微生物高度相關的SNP間不存在統計學異質性（P＞0.05）；MR-Egger回歸的截距項分析顯示，與上述5種腸道微生物高度相關的SNP不存在水平多效性（P＞0.05）；MRPRESSO法分析結果顯示，與上述5種腸道微生物高度相關的SNP不存在離群值（P＞0.05），見表2。留一法分析結果顯示，剔除單個SNP后，MR分析結果無明顯改變，見圖2。

圖2 腸道菌群與CH因果關系的留一法分析結果Figure 2 Leave-one-out analysis results of the causal relationship between intestinal flora and CH

表2 與腸道菌群高度相關的SNP的Cochran Q檢驗、MR-Egger回歸、MR-PRESSO法分析結果Table 2 Results of Cochran Q test, MR-Egger regression and MRPRESSO method analysis of SNP highly correlated with intestinal flora

2.3 反向MR分析

反向MR分析結果顯示，CH與放線菌門、糞球菌屬1、副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、瘤胃球菌屬UCG003組不存在反向因果關系（P＞0.05），見表3。

表3 CH與腸道菌群因果關系的IVW、MR-Egger回歸分析結果Table 3 IVW and MR-Egger regression analysis results of the causal relationship between CH and intestinal flora

3 討論

研究表明，CH的疼痛機制是三叉神經源性炎癥［18］，炎癥可引起三叉神經-副交感神經反射［19］，而三叉神經血管系統激活可誘導神經遞質與促炎遞質的分泌，如降鈣素基因相關肽、一氧化氮和神經激肽［20］，進而加劇疼痛；此外，上述物質也可以影響三叉神經系統，誘導相關疾病發作［21］，如降鈣素基因相關肽會引發肥大細胞脫顆粒，并與P物質一起導致神經源性炎癥［22-23］，促進一氧化氮合成及三叉神經致敏，從而驅動CH并加劇疼痛［24］。5-羥色胺是一種存在于周圍神經的神經遞質，其分泌增多會刺激腦血管，誘發三叉神經核活動，進而引發CH［25-26］。另有研究發現，白介素1β可調節三叉神經中傷害性感覺神經元總電壓依賴性鈉電流，進而引發炎癥相關性痛覺過敏［27-28］。上述物質不僅與CH關系密切，還與腸道菌群相關。研究表明，腸道菌群可影響背根神經節中降鈣素基因相關肽的產生［29］。XIANG等［30］研究發現，雙歧桿菌與辣椒素誘導的胃腸道炎癥模型小鼠血清降鈣素基因相關肽水平呈正相關。5-羥色胺又稱為血清素，90%來自胃腸道，由腸嗜鉻細胞分泌［31］。ZHANG等［32］研究發現，長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、丁酸梭菌、嗜熱鏈球菌、糞腸桿菌等可以產生5-羥色胺酸和5-羥色胺。CH與偏頭痛在發病機制及臨床癥狀方面具有相似性［2］。近年學者發現，腸道菌群可通過腦腸軸與偏頭痛產生關聯［33］，此外，很多神經系統疾病如多發性硬化癥、精神分裂癥、阿爾茨海默病、帕金森病等均與腦腸軸功能障礙有關［34-36］，CH同為神經疾病，故可能與腸道菌群相關。

本研究采用兩樣本MR分析探討腸道菌群與CH的因果關系，結果顯示，放線菌門是CH的危險因素，糞球菌屬1是CH的保護因素，副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、瘤胃球菌屬UCG003組與CH具有潛在關聯。分析原因為：與降鈣素基因相關肽和5-羥色胺呈正相關的雙歧桿菌屬于放線菌門，其衍生的神經遞質、炎癥因子等物質可能通過腦腸軸或通透性增加的腸壁而直接或間接地影響顱神經，從而誘發CH；普雷沃氏菌是一種可產生豐富丁酸和丙酸的腸道菌群，而丁酸和丙酸能有效抑制炎癥反應，從而延緩CH的發生［37］；但目前，糞球菌屬1、副擬桿菌屬、瘤胃球菌屬UCG003組與CH相關的具體機制尚未見報道，仍有待進一步研究探索。

本研究的優勢：（1）本研究樣本量較大，可有效避免混雜因素的干擾；（2）IVW結果穩定可靠。本研究的局限性：（1）由于腸道菌群的最低分類水平是屬，故無法在物種水平上分析腸道菌群與CH的因果關系；（2）本研究數據來源于歐洲人群，該結果是否在亞洲人群中成立尚有待進一步研究證實；（3）既往關于腸道菌群與CH關系的研究報道較少，無法深入闡釋上述腸道菌群與CH相關的機制。

4 結論

綜上所述，放線菌門是CH的危險因素，糞球菌屬是CH的保護因素，副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、瘤胃球菌屬UCG003組與CH具有潛在關聯。后期仍有待大樣本量RCT進一步闡明放線菌門、糞球菌屬與CH的因果關系及具體作用機制。

作者貢獻：郭玉夢、張憲忠進行文章的構思與設計；郭玉夢、崔楊霖進行研究的實施與可行性分析；郭玉夢、崔楊霖、孔雨晨進行數據收集、整理、分析；郭玉夢、孔雨晨進行結果分析與解釋；郭玉夢負責撰寫、修訂論文；高磊、張憲忠負責文章的質量控制及審校；張憲忠對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。