缺氧誘導因子1α 通過介導鐵死亡影響動脈粥樣硬化的機制研究

蔡薈芝，羅玲

作者單位：710000 陜西省西安市，西安交通大學第一附屬醫院心血管內科

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性和代謝性疾病，可引起心臟疾病、缺血性腦卒中和外周動脈疾病，其以脂質積累和炎癥浸潤為主要病理特征。研究表明，在動脈粥樣硬化初始階段，循環中的單核細胞通過功能失調的內皮細胞遷移至內膜，后分化為巨噬細胞［1］。巨噬細胞可結合氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），但當ox-LDL含量增多并超過巨噬細胞的清除能力時，巨噬細胞因內部的脂肪含量過高而出現泡沫化，而巨噬細胞泡沫化被認為是動脈粥樣硬化壞死核心形成的關鍵步驟［2］。因此，阻止巨噬細胞泡沫化是動脈粥樣硬化的治療靶點。

鐵死亡是一種新的細胞死亡形式，其特點是鐵積累過多和脂質過氧化［3］。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase 4，GPX4）是一種關鍵的抗鐵死亡酶，其可將脂質氫過氧化物轉化為無毒的脂質醇，研究顯示，心肌細胞敲除GPX4基因后，發生了脂質過氧化，從而導致細胞鐵死亡增加；而GPX4過表達可減少脂質過氧化，抑制動脈粥樣硬化進展［4］。研究證實，鐵死亡可誘導動脈粥樣硬化斑塊不穩定，而巨噬細胞泡沫化是晚期動脈粥樣硬化斑塊的一個重要特征，其有助于動脈粥樣硬化壞死核心的形成，并導致斑塊不穩定［5］。缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducing factor 1α，HIF-1α）與動脈粥樣硬化之間存在密切關系。在缺氧條件下，HIF-1α的泛素化和降解過程被抑制，導致HIF-1α迅速累積，啟動和促進巨噬細胞泡沫化、內皮細胞功能障礙，加重炎癥反應，促進血管生成及動脈粥樣硬化［6］。HIF-1α被證實是動脈粥樣硬化中與鐵死亡相關的差異表達基因，PX-478是小分子量化合物，其可以特異性地抑制HIF-1α［7］。因此，推測調節鐵死亡可成為動脈粥樣硬化的潛在治療方法。本研究旨在探討HIF-1α通過介導鐵死亡影響動脈粥樣硬化的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 人體試驗

1.1.1 研究對象

選取2022年2月—2023年6月西安交通大學第一附屬醫院收治的6例行頸動脈內膜切除術的頸動脈粥樣硬化患者的手術標本為頸動脈粥樣硬化組，6例因糖尿病動脈閉塞所致下肢壞死而截肢者的手術標本為糖尿病動脈閉塞組，6例下肢動脈粥樣硬化患者的手術標本為下肢動脈粥樣硬化組，6例先天性四肢動靜脈瘺患者的手術標本為正常組。

1.1.2 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

將四組手術標本縱向切開并暴露動脈內膜表面，采用4%多聚甲醛溶液固定過夜，切片，后依次將切片放入二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、95%乙醇溶液5 min、90%乙醇溶液5 min、80%乙醇溶液5 min、70%乙醇溶液5 min，后采用蒸餾水清洗，進行HE染色，將切片脫水、封固后采用顯微鏡觀察。

1.1.3 油紅O染色

將四組手術標本縱向切開并暴露動脈內膜表面，采用4%多聚甲醛溶液固定過夜，切片，采用0.5%油紅O溶液染色30 min，后用60%異丙醇浸洗，將切片脫水、封固后采用顯微鏡觀察。

1.1.4 透射電子顯微鏡檢查

將四組手術標本置于0.1 mmol/L 2.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液（pH值7.4）中固定，室內放置2～3 h，采用2.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液洗滌3次，采用1%鋨酸水溶液在4 ℃下固定2 h，后分別采用10%、30%、50%、70%、90%、100%乙醇脫水，采用3%醋酸鈾酰和枸櫞酸鉛進行雙染色，在LVEM5臺式透射電子顯微鏡下觀察動脈結構變化。

1.1.5 Western blotting法檢測GPX4、HIF-1α表達水平

將四組手術標本冷凍在液氮中，在RIPA緩沖液中剪碎組織后，4 ℃下12 000 r/min離心15 min（離心半徑6.0 cm），收集上清液，采用BCA法測定樣品中總蛋白濃度。每個樣品分離50 μg蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），然后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在含有0.05% Tween-20的tris緩沖液（tris buffered saline，TBS）中加入5%干奶粉，室溫封閉2 h后加入GPX4抗體（67763-1-Ig）、HIF-1α抗體（BF8002）與抗GAPDH小鼠單克隆抗體（60004-1-Ig），于4 ℃環境下孵育過夜，加入經辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）處理的二抗，室溫孵育1 h，采用Image J軟件分析各目的蛋白條帶的灰度值。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗時間、實驗動物及分組

實驗時間：2022年3月—2023年6月。從西安交通大學第一附屬醫院實驗室實驗動物中心選取ApoE-/-C57BL/6小鼠（4周齡）18只。將小鼠置于溫度控制的環境中（溫度24～25 ℃，相對濕度55%），光照12 h/黑暗12 h，自由攝入食物和水。采用簡單隨機法將小鼠分為對照組、高脂肪飲食（high fat diet，HFD）組、PX-478組，每組6只。對照組小鼠采用正常飼料喂養；HFD組和PX-478組小鼠采用HFD連續喂養5個月。之后PX-478組小鼠給予PX-478 5 mg·kg-1·d-1，每2 d腹腔注射1次；對照組和HFD組小鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液，每2 d腹腔注射1次，均連續給藥2個月。腹腔注射結束后處死小鼠，取其主動脈。

1.2.2 HE染色

將小鼠主動脈竇縱向切開并暴露內膜表面，采用4%多聚甲醛溶液固定過夜，切片，檢測方法同1.1.2。

1.2.3 油紅O染色將小鼠主動脈竇縱向切開并暴露內膜表面，采用4%多聚甲醛溶液固定過夜，切片，檢測方法同1.1.3。

1.2.4 Russell-Movall五色染色

Russell-Movall五色染色試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司。將小鼠主動脈竇縱向切開并暴露內膜表面，石蠟封層，后進行脫蠟；采用試劑盒A液染色20 min，之后采用流水沖洗5 min；采用試劑盒B液染色1 h，之后采用流水沖洗20 min；采用試劑盒C液染色15 min，之后采用蒸餾水沖洗5次；采用試劑盒D液分化至彈力纖維與背景對比鮮明，然后采用蒸餾水清洗5次；采用試劑盒E液染色1 min，之后采用流水沖洗5 min、蒸餾水稍洗；采用試劑盒F液染色1～5 min，之后采用蒸餾水沖洗5次、0.5%醋酸稍洗；采用試劑盒G液染色2次、5 min/次，之后采用0.5%醋酸稍洗，然后速洗3次；采用試劑盒H液染色15 min，然后快洗3次；采用二甲苯透明2～3次，然后采用人工樹脂封固。測量斑塊面積、脂質面積和黏蛋白面積。

1.2.5 Western blotting法檢測HIF-1α表達水平

將小鼠主動脈標本冷凍在液氮中，其余步驟同1.1.5。

1.3 細胞實驗

1.3.1 實驗時間

2022年3月—2023年6月。

1.3.2 細胞培養

THP-1細胞購自北京伊萊瑞生物科技有限公司，將THP-1細胞在PRMI-1640培養基（含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素）中培養24 h，培養條件：37 ℃、5%CO2的潮濕孵化箱中。將THP-1細胞接種于6孔板中，每孔1×106個細胞，采用100 nmol/L佛波酯處理48 h，以誘導THP-1細胞向巨噬細胞分化。將THP-1巨噬細胞分為THP-1巨噬細胞組、ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組，其中ox-LDL組加入100 μg/ml ox-LDL并孵育48 h，ox-LDL＋PX-478組加入100 μg/ml ox-LDL 和PX-478（100 μmol/L）并孵育48 h。

1.3.3 Western blotting法檢測GPX4、HIF-1α表達水平

用含有Roche蛋白酶抑制劑和磷酸鹽抑制劑的RIPA緩沖液在冰上裂解三組細胞。細胞裂解物進行SDS-PAGE，4 ℃下12 000 r/min離心15 min（離心半徑6.0 cm），收集上清液，采用BCA法測定樣品中總蛋白濃度，之后操作步驟同1.1.5。

1.3.4 Mito-Tracker染色法

使用Mito-Tracker染色法對三組細胞進行染色，具體方法為：在三組細胞中加入提前配制好的Mito-Tracker Red氯甲基-X-迷迭胺（chloromethyl-X-rosemary amine，CMXRos），于37 ℃陰暗環境中孵育30 min，后采用PBS洗滌，用4%多聚甲醛溶液固定，在室溫下靜置15 min，使用熒光顯微鏡計數20倍鏡下隨機5個視野中染色的細胞〔即活性氧（reactive oxygen species，ROS）陽性細胞〕數，求平均值。

1.3.5 鐵含量測定

將三組細胞接種于24孔板，密度為2×103個/孔，采用細胞內鐵比色測定試劑盒（E1042）檢測鐵含量。

1.3.6 谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定

將三組細胞接種于24孔板，密度為2×103個/孔，收集細胞進行裂解，使用谷胱甘肽測定試劑盒（A006-2）檢測GSH水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人體試驗結果

2.1.1 HE染色和油紅O染色

HE染色結果顯示，與正常組相比，頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組動脈中可見內膜增厚、纖維帽和核心壞死的動脈粥樣硬化斑塊，見圖1。油紅O染色結果顯示，與正常組相比，頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組動脈內膜存在廣泛的脂質沉積，見圖2。

圖1 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組HE染色結果Figure 1 HE staining results of normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

圖2 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組油紅O染色結果Figure 2 Oil red O staining results of normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

2.1.2 透射電子顯微鏡檢查

透射電子顯微鏡檢查結果顯示，與正常組相比，頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組動脈中線粒體普遍較小，線粒體嵴模糊，見圖3。

圖3 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組透射電子顯微鏡檢查結果Figure 3 Transmission electron microscopy examination results of normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

2.1.3 GPX4、HIF-1α表達水平

四組GPX4、HIF-1α表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中下肢動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和頸動脈粥樣硬化組GPX4表達水平低于正常組，HIF-1α表達水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組GPX4、HIF-1α表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of GPX4 and HIF-1α expression levels in normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

表1 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組GPX4、HIF-1α表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of GPX4 and HIF-1α expression levels in normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

注：GPX4=谷胱甘肽過氧化物酶4，HIF-1α=缺氧誘導因子1α；a表示與正常組比較，P＜0.05。

組別例數GPX4HIF-1α正常組61.31±0.431.01±0.31下肢動脈粥樣硬化組60.51±0.42a1.92±0.46a糖尿病動脈閉塞組60.59±0.33a2.56±0.39a頸動脈粥樣硬化組60.71±0.38a1.89±0.38a F值5.2016.10 P值0.04＜0.01

2.2 動物實驗結果

2.2.1 HE染色、油紅O染色

HE染色結果顯示，與對照組相比，HFD組小鼠主動脈竇中斑塊形成，膠原纖維沉積；與HFD組相比，PX-478組小鼠主動脈竇中斑塊形成、膠原纖維沉積減少，見圖4。油紅O染色結果顯示，與對照組相比，HFD組小鼠主動脈竇中脂質沉積；與HFD組相比，PX-478組小鼠主動脈竇中脂質沉積減少，見圖5。

圖4 對照組、HFD組、PX-478組HE染色結果Figure 4 HE staining results of control group，HFD group，PX-478 group

圖5 對照組、HFD組、PX-478組油紅O染色結果Figure 5 Oil red O staining results of control group，HFD group，and PX-478 group

2.2.2 斑塊面積、脂質面積、黏蛋白面積、HIF-1α表達水平

三組斑塊面積、脂質面積、黏蛋白面積、HIF-1α表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；HFD組斑塊面積、脂質面積、黏蛋白面積大于對照組和PX-478組，HIF-1α表達水平高于對照組和PX-478組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 對照組、HFD組、PX-478組斑塊面積、脂質面積、黏蛋白面積、HIF-1α表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of plaque area，lipid area，mucin area and HIF-1α expression level in control group，HFD group，PX-478 group

表2 對照組、HFD組、PX-478組斑塊面積、脂質面積、黏蛋白面積、HIF-1α表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of plaque area，lipid area，mucin area and HIF-1α expression level in control group，HFD group，PX-478 group

注：HFD=高脂肪飲食；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與HFD組比較，P＜0.05。

組別只數 斑塊面積（mm2）脂質面積（mm2）黏蛋白面積（mm2）HIF-1α對照組60.54±0.14 0.62±0.31 0.49±0.22 0.96±0.24 HFD組6 1.22±0.34a 1.16±0.37a 1.19±0.42a 1.85±0.31a PX-478組6 0.66±0.42b 0.58±0.41b 0.54±0.36b 1.06±0.36b t值7.598.416.439.02 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 細胞實驗結果

三組GPX4表達水平、HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數、鐵含量、GSH水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組GPX4表達水平、GSH水平低于THP-1巨噬細胞組，HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數、鐵含量高于THP-1巨噬細胞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；ox-LDL＋PX-478組GPX4表達水平、GSH水平高于ox-LDL組，HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數、鐵含量低于ox-LDL組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 THP-1巨噬細胞組、ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組GPX4、HIF-1α表達水平及ROS陽性細胞數、鐵含量、GSH水平比較（±s，n=6）Table 3 Comparison of GPX4 and HIF-1α expression levels，ROS positive cells，iron content，GSH level in THP-1 macrophage group，ox-LDL group，ox-LDL＋PX-478 group

表3 THP-1巨噬細胞組、ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組GPX4、HIF-1α表達水平及ROS陽性細胞數、鐵含量、GSH水平比較（±s，n=6）Table 3 Comparison of GPX4 and HIF-1α expression levels，ROS positive cells，iron content，GSH level in THP-1 macrophage group，ox-LDL group，ox-LDL＋PX-478 group

注：ROS=活性氧，GSH=谷胱甘肽，ox-LDL=氧化型低密度脂蛋白；a表示與THP-1巨噬細胞組比較，P＜0.05；b表示與ox-LDL組比較，P＜0.05。

組別GPX4HIF-1αROS陽性細胞數（×106/L）鐵含量（μmol）GSH（μmol）THP-1巨噬細胞組1.19±0.411.22±0.5811.13±1.331.56±0.2811.21±0.98 ox-LDL組0.52±0.32a4.77±0.64a78.98±3.23a3.17±0.41a7.71±0.86a ox-LDL＋PX-478組0.64±0.33ab2.09±0.55ab54.64±2.33ab2.01±0.36ab9.09±0.62ab F值5.459.4356.5610.4213.33 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

研究顯示，鐵死亡是鐵依賴性調節性細胞死亡形式，與細胞凋亡、壞死性凋亡和其他類型的細胞死亡不同［8］。研究顯示，抑制THP-1細胞向巨噬細胞分化及ox-LDL的促動脈粥樣硬化作用可抑制鐵死亡［9］。本研究人體試驗結果顯示：頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組動脈中可見內膜增厚、纖維帽和核心壞死的動脈粥樣硬化斑塊；動脈內膜存在廣泛的脂質沉積；動脈中線粒體普遍較小，線粒體嵴模糊。同時，頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組GPX4表達水平低于正常組，HIF-1α表達水平高于正常組，表明動脈粥樣硬化過程中存在鐵死亡現象。研究顯示，隨著動脈粥樣硬化的進展，斑塊的生長會導致血管狹窄，從而限制血液中的氧氣擴散到斑塊區域的能力。隨著斑塊的發展，氧氣擴散到斑塊的減少可能導致斑塊內部缺氧，導致動脈粥樣硬化晚期斑塊中心出現缺氧現象，而斑塊中心缺氧可能導致一些具有促動脈粥樣硬化作用的分子和細胞的積累，如巨噬細胞和泡沫細胞等，這些細胞在缺氧環境下會釋放出一些炎癥因子和細胞因子等，如HIF-1α［10］。在缺氧條件下，HIF-1α聚集并易位到細胞核，激活其功能靶基因，且HIF-1α調控基因對動脈粥樣硬化的進展有促進作用［11］。

研究表明，HIF-1α的積累與細胞外脂質核心的存在有關，并與巨噬細胞和巨噬泡沫細胞之間有很好的共定位［12］。PX-478是一種抑制HIF-1α的特異性小分子抑制劑，其通過調節參與膽固醇代謝的肝臟基因而降低膽固醇水平，最終抑制動脈粥樣硬化斑塊形成或脂質的發展［13］。本研究動物實驗結果顯示，HFD組小鼠主動脈竇中斑塊形成，膠原纖維沉積，脂質沉積；PX-478組小鼠主動脈竇中斑塊形成、膠原纖維沉積、脂質沉積減少；HFD組斑塊面積、脂質面積、黏蛋白面積大于對照組和PX-478組，HIF-1α表達水平高于對照組和PX-478組。表明選擇性HIF-1α抑制劑——PX-478可通過下調HIF-1α表達水平縮小斑塊面積、脂質面積、黏蛋白面積，進而抑制動脈粥樣硬化，提示PX-478是一種潛在的抗動脈粥樣硬化藥物。

研究顯示，抑制鐵死亡可以減輕脂質過氧化，從而減輕動脈粥樣硬化小鼠主動脈內皮細胞的內皮功能障礙［9］。敲除HIF-1α基因能抑制巨噬細胞泡沫化，也可抑制M1型巨噬細胞的分化，降低炎癥基因的表達，進而減輕動脈粥樣硬化［14-15］。本研究細胞實驗結果顯示，ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組GPX4表達水平、GSH水平低于THP-1巨噬細胞組，HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數、鐵含量高于THP-1巨噬細胞組；ox-LDL＋PX-478組GPX4表達水平、GSH水平高于ox-LDL組，HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數、鐵含量低于ox-LDL組。表明ox-LDL可增加脂質ROS生成，降低GSH水平，促進鐵死亡，而PX-478可抑制ox-LDL的上述作用。

4 結論

綜上所述，動脈粥樣硬化過程中存在鐵死亡現象，HIF-1α表達水平升高；下調HIF-1α表達可減少ROS生成，升高GSH水平，抑制鐵死亡，從而減輕動脈粥樣硬化。但本研究為單中心、小樣本量基礎研究，其結論需要在多中心、大樣本量臨床研究中進一步證實。

作者貢獻：蔡薈芝、羅玲進行文章的構思與設計；蔡薈芝進行研究的實施與可行性分析、資料整理、論文撰寫及修訂；羅玲進行資料收集、統計學處理，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。