不同基原淫羊藿和巫山淫羊藿藥材的化學成分差異研究

田祥木，李天嬌，2，3，李強，楊欣欣，2，3，王帥，2，3*，包永睿，2，3*，孟憲生，2，3（.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業技術創新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600：.河北百草康神藥業有限公司，河北 衡水 053800）

2020年版《中國藥典》中收載淫羊藿藥材及巫山淫羊藿藥材[1]，其中淫羊藿包括4種基原植物，分別為淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.、朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai，巫山淫羊藿基原為巫山淫羊藿EpimediumwushanenseT.S.Ying。目前該不同基原巫山淫羊藿及淫羊藿為市場上廣泛銷售的品種。而5種藥材的產地也有所不同，淫羊藿主要分布于貴州??；箭葉淫羊藿主要分布于浙江省、安徽省等地；柔毛淫羊藿主要分布于湖北省、四川省等地；朝鮮淫羊藿主要分布于吉林省、遼寧省等地；巫山淫羊藿主要分布于四川省、貴州省等地。淫羊藿及巫山淫羊藿藥材分布的廣泛性以及其資源分布的交叉性，導致了在淫羊藿及巫山淫羊藿藥材的使用方面較為混亂。

在功效方面淫羊藿及巫山淫羊藿均為補腎陽、強筋骨、祛風濕，用于腎陽虛衰、陽痿遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣。但在臨床藥理藥效評價中有所不同，具體表現在改善腎功能指標、抗氧化作用及對血清睪酮的影響等方面[2]。藥材化學成分的差異可以直接影響其藥效的差異。經過文獻查閱發現[3]，有文獻對不同基原淫羊藿藥材的化學成分進行分析，但其中并未包含巫山淫羊藿，且質量評價所選定的化合物數量較少，故本文從淫羊藿及巫山淫羊藿藥材的化學成分的數量與相對含量角度，探討不同基原藥材化學成分的差異，及快速鑒定巫山淫羊藿及淫羊藿不同基原藥材的方法。

本試驗以探討巫山淫羊藿及淫羊藿5種不同藥材化學成分為目的，采用UPLC-Q-TOF-MS技術對淫羊藿及巫山淫羊藿藥材的化學成分進行鑒定，通過與對照品比對及相關文獻報道，共鑒定出37種化學成分，并對5種藥材化學成分鑒定的結果進行對比分析，通過SIMCA數據處理軟件對化學成分的相對含量進行統計學分析，現報道如下。

1 材料

安捷倫1290 InfinityⅡ液相色譜儀、安捷倫6550 iFunnel Q-TOF LC/MS質譜儀（美國安捷倫科技有限公司），ME55/02電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。色譜純甲醇、質譜純甲醇（德國默克集團），質譜甲酸（賽默飛世爾公司），純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

對照品淫羊藿苷（批號：wkq21042608）、朝霍定A（批號：wkq21060111）、朝霍定B（批號：wkq21071613）、朝霍定C（批號：wkq21031304）、寶霍苷Ⅰ（批號：wkq21071508）、寶藿苷Ⅱ（批號：wkq21081105）、川陳皮素（批號：wkq19012502）、新橙皮苷（批號：wkq21020406）、淫羊藿次苷Ⅰ（批號：wkq21071908）、山柰苷（批號：wkq21072107）（純度≥ 98%，四川省維克奇生物科技有限公司），金絲桃苷（批號：18090816）、木蘭花堿（批號：17020802）（純度≥ 98%，成都普菲德生物技術有限公司），山柰酚-3-O-鼠李糖苷（批號：HR232W11）、紫云英苷（批號：HS16824B1）、淫羊藿素（批號：HR3508W4）、箭霍苷B（批號：HS198266B2）（純度≥ 98%，寶雞市渭濱區新儀科技儀器經營部）。

巫山淫羊藿與淫羊藿于2022年5月采自貴州省，柔毛淫羊藿與箭葉淫羊藿于2022年5月采自四川省，朝鮮淫羊藿于2022年5月采自遼寧省，經遼寧中醫藥大學張建奎教授分別鑒定為小檗科淫羊藿屬巫山淫羊藿EpimediumwushanenseT.S.Ying的干燥葉、小檗科淫羊藿屬淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.的干燥葉、小檗科淫羊藿屬柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.的干燥葉、小檗科淫羊藿屬箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.的干燥葉、小檗科淫羊藿屬朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥葉。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取淫羊藿粉末約1 g（過3號篩），置具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱重，超聲提取30 min，取出，放冷，用甲醇補足失重，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，即得對照品溶液（金絲桃苷、淫羊藿素、淫羊藿苷、朝霍定B、寶霍苷I、寶藿苷Ⅱ、新橙皮苷、紫云英苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷A、山柰苷、箭霍苷B、朝霍定A、朝霍定C、川陳皮素、木蘭花堿、山柰酚-3-O-鼠李糖苷質量濃度分別為0.103、0.098、0.101、0.104、0.099、0.100、0.097、0.103、0.099、0.101、0.106、0.099、0.109、0.100、0.099、0.104、0.097 mg·mL－1）。

2.3 色譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），正離子模式下流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫（0～30 min，5%～100%B）；負離子模式下流動相A為水，流動相B為甲醇，梯度洗脫（0～30 min，5%～100%B）。兩種模式下進樣量均為0.1 μL，流速為0.4 mL·min－1，柱溫為30℃。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源，正離子測定模式，毛細管電壓：4000 V，鞘氣溫度為350℃，干燥氣體溫度為250℃，鞘氣流速為11 L·min－1，干燥氣體流速為13 L·min－1，霧化器壓力為45 psi，碎裂電壓為125 V，質量范圍為100～1500m/z；負離子測定模式，除毛細管電壓為3500 V以外，其他質譜條件與正離子相同。所得數據采用MassHunter Qualitative Analysis B.06.00軟件處理。

2.4 測定

取“2.1”項下方法制備的供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件對淫羊藿及巫山淫羊藿不同基原藥材進行UPLC-Q-TOF-MS分析。所得樣品色譜圖見圖1。

圖1 淫羊藿及巫山淫羊藿藥材的質譜圖Fig 1 Mass spectra of different basal herbs of Epimedium and Wushan Epimedium

3 結果

3.1 基于UPLC-Q-TOF-MS的淫羊藿藥材化學成分鑒定

運用UPLC-Q-TOF-MS技術，對淫羊藿及巫山淫羊藿藥材的化學成分進行解析，根據各化學成分的保留時間以及質譜碎裂信息等，結合所提取的總離子流圖和相關文獻報道進行數據對比，指認化學成分。巫山淫羊藿中檢測出37種化學成分，淫羊藿中檢測出32種化合物，柔毛淫羊藿中檢測出34種化合物，箭葉淫羊藿檢測出33種化合物，朝鮮淫羊藿中檢測出32種化合物。具體分布情況見表1。

表1 淫羊藿及巫山淫羊藿藥材中化學成分鑒定結果Tab 1 Identification of chemical components in Epimedium and Wushan Epimedium herbs

3.2 淫羊藿及巫山淫羊藿藥材中部分化合物質譜裂解規律

化合物1保留時間為7.297 min，一級質譜圖中得到其準分子離子峰為m/z151.0398 [M-H]－，推測其分子式為C8H8O3。在二級質譜圖中發現碎片離子m/z136.1058 [M-H-O]－，m/z108.0212 [M-HCO2]－。通過與化合物異香草醛的碎片離子進行比較[3]，與化合物異香草醛的質譜碎片一致，推測化合物1為異香草醛?；衔?保留時間為8.754 min，一級質譜圖中得到其準分子離子峰為m/z549.1937 [M＋H]＋，故推測其分子式為C27H32O12。在二級質譜圖中發現碎片離子m/z387.1424 [M＋H-C6H10O5]＋，m/z297.0818 [M＋H-C9H16O8]＋。通過與化合物茂藿苷A的碎片離子進行比較[4]發現與其質譜碎片一致，推測化合物2為茂藿苷A?；衔?保留時間為11.880 min，一級質譜圖中得到其準分子離子峰為m/z463.0873 [M-H]－，故推測其分子式為C21H20O12。在二級質譜圖中發現碎片離子m/z402.8090 [M-H-CH2O3]－，m/z344.0462[M-H-C4H8O4]－，m/z314.0353 [M-H-C5H10O5]－，m/z301.0299 [M-H-C6H11O5]－，m/z271.0225 [M-HC7H13O6]－。通過與金絲桃苷對照品的碎片離子進行比較發現與其質譜碎片一致，推測化合物4為金絲桃苷?；衔?保留時間為11.896 min，一級質譜圖中得到準分子離子峰為m/z579.1697 [M-H]－，故推測其分子式為C27H32O14。二級質譜圖中發現碎片離子m/z271.0599 [M-H-C12H21O9]－，m/z151.0034[M-H-C20H28O10]－，m/z119.0495 [M-H-C19H25O13]－。通過與化合物柚皮苷的碎片離子進行比較[6]發現與其質譜碎片一致，推測化合物5為柚皮苷?；衔?保留時間為12.310 min，一級質譜圖中得到準分子離子峰為m/z593.1494 [M-H]－，故推測其分子式為C27H30O15。二級質譜圖中發現碎片離子m/z446.0825 [M-H-C6H12O4]－，m/z299.0178[M-H-C12H23O8]－，m/z271.0225 [M-H-C13H23O9]－。通過與化合物槲皮素-3，7-二-O-鼠李糖苷的碎片離子進行比較[7]發現與其質譜碎片一致，推測化合物6為槲皮素-3，7-二-O-鼠李糖苷?；衔?保留時間為12.641 min，一級質譜圖中發現其準分子離子峰為m/z609.1800 [M-H]－，故推測其分子式為C28H34O15。二級質譜圖中發現碎片離子m/z343.0814 [M-H-C10H19O8]－，m/z302.0722 [M-HC12H20O9]－，m/z286.0459 [M-H-C12H20O10]－。通過與新橙皮苷對照品的碎片離子進行比較發現與其質譜碎片一致，推測化合物7為新橙皮苷?；衔?保留時間為13.170 min，一級質譜圖中發現其準分子離子峰為m/z447.0922 [M-H]－，故推測其分子式為C21H20O11。二級質譜圖中發現碎片離子m/z301.0311 [M-H-C5H7O5]－，m/z285.0375[M-H-C6H11O5]－，m/z255.0272 [M-H-C7H13O6]－，m/z162.9586 [M-H-C13H18O7]－，m/z123.0105 [M-HC15H17O8]－。通過與紫云英苷對照品的碎片離子進行比較發現與其的質譜碎片一致，推測化合物8為紫云英苷?；衔?9保留時間為17.340 min，一級質譜圖中發現其準分子離子峰為m/z837.2788[M-H]－，故推測其分子式為C39H50O20。二級質譜圖中發現碎片離子m/z676.2387 [M-H-C6H10O5]－，m/z675.2259 [M-H-C6H11O5]－，m/z645.2136 [M-HC7H13O6]－，m/z366.1102 [M-H-C18H32O14]－。通過與朝霍定A對照品的碎片離子進行比較發現與其質譜碎片一致，推測化合物19為朝霍定A?；衔?6保留時間為18.895 min，一級質譜圖中發現其準分子離子峰為m/z691.2204 [M-H]－，故推測其分子式為C33H40O16。二級碎片離子m/z545.1640[M-H-Rha]－，m/z529.1692 [M-H-Glc]－，m/z383.1100 [M-H-Rha-Glc]－，m/z368.0911 [M-H-Rha-Glc-CH3]－，m/z313.0375 [M-H-Rha-Glc-C3H3O]－。通過與化合物sagittasine C的碎片離子進行比較[7，11]發現與其的質譜碎片一致，推測化合物26為sagittasine C?；衔?0保留時間為20.120 min，一級質譜圖中發現其準分子離子峰為m/z499.1592[M-H]－，故推測其分子式為C26H28O10。二級碎片離子m/z353.0999 [M-H-C6H11O4]－，m/z309.0375[M-H-C9H19O4]－，m/z281.0428 [M-H-C10H19O5]－。通過與寶藿苷Ⅱ對照品的碎片離子進行比較發現與其質譜碎片一致，推測化合物30為寶藿苷Ⅱ?；衔?6保留時間為22.403 min，一級質譜圖中發現其分子離子峰為m/z513.1757 [M-H]－，故推測其分子式為C27H30O10。二級碎片離子m/z486.1852 [M-H-C2H4]－，m/z445.1077 [M-H-C5H9]－，m/z367.1118 [M-H-C7H15O3]－，m/z324.0931 [M-HC9H18O4]－，m/z217.0484 [M-H-C15H21O6]－。通過與寶霍苷Ⅰ對照品的碎片離子進行比較發現與其的質譜碎片一致，推測化合物36為寶霍苷Ⅰ。

3.3 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

取“2.1”項下方法制備的供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件對不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿藥材進行UPLC-Q-TOF-MS分析，結合淫羊藿中所含化學成分，將所有成分在淫羊藿及巫山淫羊藿藥材中相對含量進行統計，并將數據導入SIMCA軟件進行OPLS-DA分析。圖2A的OPLS-DA結果表明不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿藥材可以明顯區分，存在組間差異。為了更加直觀地觀察組間差異，本研究采用有監督的OPLS-DA分析方法，篩選淫羊藿及巫山淫羊藿5種藥材的差異化合物。由OPLS-DA結果可知，R2X（cum）＝0.974，R2Y（cum）＝0.956，Q2（cum）＝0.853，表明模型的解釋度及預測度良好。根據變量重要投影（VIP）篩選出差異化合物，其中VIP值越大表明該化合物對分類的貢獻越大，當VIP值＞1時，表示該變量對分類起到關鍵性作用。本研究VIP值如圖2C所示，從圖中可以發現VIP＞1的化合物由大到小依次為淫羊藿定L、2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、木蘭花堿、新橙皮苷、紫云英苷、epimedokoreanoside 或其異構體、寶霍苷Ⅰ、山柰苷、大黃素、朝藿定Ⅰ、淫羊藿苷、朝霍定A共12種成分。同時為了驗證OPLS-DA模型的有效性，進行了200輪置換測試。如圖2B所示，左側所有藍色Q2值均低于右側原點，且Q2藍色回歸線與垂直軸在零點或以下相交，表示該模型是可靠的。

圖2 不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿藥材OPLS-DA分析結果Fig 2 OPLS-DA analysis of different basal herbs of different basal epimedium and Wushan epimedium

4 討論

經過相關文獻報道[13]，黃酮類成分為淫羊藿藥材中主要的活性成分，故本研究以黃酮類成分為主進行淫羊藿藥材化學成分差異性研究。通過對不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿藥材的化學成分進行分析鑒定，共鑒定出37種化合物，其中共同含有的化學成分包括寶霍苷Ⅰ、淫羊藿素、寶霍苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅰ、sagittasine C、箭霍苷C、朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C、寶藿苷Ⅶ、淫羊藿苷、大黃素、淫羊藿新苷A、淫羊藿屬苷C、大花淫羊藿苷F等共28種。其他化學成分并未廣泛分布于各藥材中，具體表現為淫羊藿中未檢測到新橙皮苷、2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、epimedokoreanoside或其異構體、淫羊藿定L、朝藿定Ⅰ 5種化合物；柔毛淫羊藿中不含有2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、木蘭花堿及icarisoside B 3種化合物；箭葉淫羊藿中不含有2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、epimedokoreanoside 或其異構體、淫羊藿定L及icarisoside B 4種化合物；朝鮮淫羊藿中不含有異香草醛、2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、epimedokoreanoside 或其異構體、川陳皮素及icarisoside B5種化合物；而巫山淫羊藿中包含了上述全部37種化合物。在OPLS-DA分析，我們所發現的VIP＞1的12個成分包括淫羊藿定L、2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、木蘭花堿、新橙皮苷、紫云英苷、epimedokoreanoside 或其異構體、寶霍苷Ⅰ、山柰苷、大黃素、朝藿定I、淫羊藿苷、朝霍定A可以作為區分不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿的藥材的指標性成分。

中醫理論認為，淫羊藿能夠溫補腎陽、祛風濕、強筋骨?，F代藥理學研究表明，淫羊藿具有促進生殖系統、抗骨質疏松、抗腫瘤及抗動脈粥樣硬化等作用[14-15]。Zhang等[16]的相關研究結果表明，淫羊藿苷可以通過增加睪丸、附睪的重量、指數等方式來減弱全氟辛烷磺酸（PFOS）誘導所引發的睪丸毒性；同時也可以通過減輕Sertloli細胞的連接損傷來改善PFOS誘導的血液睪丸屏障的破壞；Meng等[17]的研究結果表明，在淫羊藿粗提物中，正丁醇及乙醇部分可以對成骨細胞UMR-106有刺激增殖活性，其中淫羊藿苷、朝霍定B及朝霍定C 3種成分可以明顯促進成骨細胞UMR-106的增殖。Hu等[18]的研究結果表明，淫羊藿苷可以減輕異丙腎上腺素誘導的H9c2或者NRCM心肌細胞肥大。Li等[19]的研究結果表明，淫羊藿苷可以通過MDM2-p53途徑下調甲胎蛋白對肝癌細胞起到抑制作用。Tao等[20]通過實驗驗證了淫羊藿素對人類髓源性抑制細胞（MDSCs）的抑制作用。結合淫羊藿藥材的有效化學成分，淫羊藿中的淫羊藿苷、淫羊藿素、朝霍定B等成分，可以作為控制淫羊藿藥材藥效的指標性化學成分。本研究發現，淫羊藿苷在柔毛淫羊藿中相對含量最高，其次為朝鮮淫羊藿，淫羊藿中所含最少；淫羊藿素在巫山淫羊藿中含量最高，其次為箭葉淫羊藿，柔毛淫羊藿中含量最少；朝霍定B在心葉淫羊藿中含量最高，其次為柔毛淫羊藿，巫山淫羊藿中含量最少。查閱相關文獻報道[2]，對淫羊藿、箭葉淫羊藿及朝鮮淫羊藿3種不同基原淫羊藿藥材的藥效差異性進行對比分析發現，不同基原淫羊藿藥材對不同指標方面的藥效程度有所不同，如在腎功能指標改善作用方面，淫羊藿及朝鮮淫羊藿效果顯著，但箭葉淫羊藿作用不明顯；在抗氧化作用方面，淫羊藿及箭葉淫羊藿效果顯著，但朝鮮淫羊藿效果不明顯等。結合本試驗研究結果，不同淫羊藿藥材的化學成分差異可以直接影響其藥效的差異。

通過本實驗對不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿的藥材中所鑒定出成分的相對含量進行測定，結合相關文獻，并通過數據分析軟件初步探討不同基原藥材化學成分的差異性。由于淫羊藿藥材分布的廣泛性及其基原的復雜性，后續將繼續收集多批次不同產地、不同基原的淫羊藿藥材進一步驗證，深入研究藥材功效與化學成分之間的關系，為不同基原淫羊藿藥材的鑒定、質量控制及臨床上合理用藥奠定基礎。