山蘭米醋發酵過程中理化指標及揮發性風味物質的變化規律

吳曉茜,鐘秋平*,張云竹

1(海南大學 食品科學與工程學院,海南 ?？?570228)2(海南大學 生物醫學工程學院,海南 ?？?570228)

“山蘭稻”是海南省黎族地區獨有的山地旱稻。山蘭米營養價值極高,相比于普通稻谷,鐵、硒、鋅等微量元素含量較高,是釀造米醋的優選原料[1]。米醋是以大米為原料,經過糖化、酒精發酵和醋酸發酵等工藝釀制而成的一種調味品。食醋不僅是一種酸性調味品,而且還具有促進消化、軟化血管、消除疲勞、降低血脂和調節血壓等功效。風味物質是反應米醋品質的重要指標之一,包括揮發性和非揮發性成分。其中非揮發性物質包含有機酸和游離氨基酸[2]。米醋中的氨基酸主要來源于原料中的蛋白質降解作用,能夠緩沖醋酸帶來的刺激,使醋的口感更加柔和。在醋酸發酵階段,許多微生物生長繁殖,形成大部分醋的風味物質[3]。有機酸是食醋中酸味的主要來源,其主要成分是乙酸,具有清爽和刺激的風味,而乳酸是食醋含量最多的非揮發性酸,口感柔和,它們共同協調構成食醋獨特的風味和特點[4]。近年來,越來越多人注重健康和膳食營養,許多具備功能性的食醋正在被研究和開發。如徐融融等[5]利用鐵皮石斛為原料開發藥食同源植物鐵皮石斛的食醋產品;楊成瑞等[6]利用以云南產馬尾松松針為原料釀造馬尾松松針醋;馬敬[7]利用青稞麩皮替代小麥麩皮釀醋開發具有良好抗氧化效果的食醋;SU等[8]以兔眼藍莓為原料制作藍莓醋等。而采用山蘭米發酵食醋的研究尚未報道。

在釀制過程中,理化性質和風味物質的變化都會對小米醋的品質產生影響。本研究以山蘭黃酒為原料,通過稀釋發酵環境酒精度至最適醋酸發酵酒精度,而后添加醋酸菌進行醋酸發酵,開發一種具有保健功能的山蘭米醋產品。同時對醋酸發酵階段的總酸、pH這兩個理化指標進行跟蹤測定,分析其動態變化;通過高效液相色譜法分析發酵過程中游離氨基酸和有機酸含量的變化規律;采用頂空固相微萃取氣質聯用(headspace-solid phase micro-extraction - gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)風味分析技術對醋酸發酵過程中揮發性風味物質進行跟蹤檢測,揭示山蘭米醋風味物質的變化規律,并篩選出醋酸發酵過程中的差異性成分,為山蘭米醋產品開發提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋的制作:山蘭酒糟、酒液和純凈水等比例混合,置于80 ℃水浴鍋中滅菌15 min,取出冷卻至室溫后,添加原料1%～3%(體積分數)的醋酸菌,將其放在30 ℃的搖床進行醋酸菌發酵,每天測定總酸含量,待3 d的總酸穩定,結束醋酸發酵。醋醅取4個不同發酵時間的樣品[第3天(Acid-3 d),第7天(Acid-7 d),第11天(Acid-11 d),第15天(Acid-15 d)],每天同一時間取樣,樣品于0～4 ℃保存。

醋酸桿菌培養:配制10 g/L葡萄糖水活化醋酸菌2 d,然后進行醋酸發酵。

甲醇/乙腈/甲酸、3-硝基苯肼/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(色譜級),安譜;鹽酸(分析純),國藥;衍生試劑,Waters;NaOH(分析純),天津歐博凱化工有限公司;草酸、乳酸、乙酸、酒石酸等有機酸標準品,sigma公司。

1.2 儀器與設備

Q Exactive質譜儀、Vanquish超高壓液相色譜儀,Thermo;Eppendorf 5430R低溫高速離心機、Tissuelyser-48組織破碎儀,上海凈信科技有限公司;pH計,上海雷磁儀器有限公司;8890氣相色譜、7000D質譜、DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),Agilent。

1.3 實驗方法

1.3.1 總酸的測定

參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》的方法,稱取25 g醋醅(精確至0.01 g)至250 mL容量瓶中,用無二氧化碳水定容至刻度,搖勻。用快速濾紙過濾,收集濾液,用于測定。

1.3.2 pH值的測定

用pH計直接測定醋醅浸泡后過濾的濾液。

1.3.3 有機酸的測定

稱取適量樣本(0.1～0.5 g),加入1 mL 提取液[V(甲醇)∶V(氯仿)=7∶3],充分混勻;冰上孵育提取30 min;加入600 μL H2O,混勻;4 ℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液,重復提取1次,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液,稀釋20倍,取40 μL樣品衍生化上機。

液相色譜條件:色譜柱:Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸乙腈溶液;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量2 μL;洗脫梯度:0.0 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10;2.0 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10;12.0 minV(水)∶V(乙腈)=10∶90;14.0 minV(水)∶V(乙腈)=10∶90;14.1 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10;16.0 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。

質譜條件:采用美國Thermo公司的Q Exactive高分辨質譜檢測系統進行的采集。電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)條件如下:鞘氣40 arb;輔助氣10 arb;離子噴霧電壓-2 800 V;溫度350 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為Fullms-ms2模式;掃描方式為負離子。一級掃描范圍(m/z)120～1 500。

1.3.4 游離氨基酸的測定

樣品制備和提取:樣品中加入0.6 mL 0.1 mol/L HCl于室溫下攪拌提取1 h,每個樣品通過0.22 μm孔膜過濾器過濾。取10 μL樣品于萃取瓶,加入70 μL硼酸緩沖液和20 μL AccQ·Tag試劑。反應混合物在室溫下靜置1 min, 55 ℃加熱10 min,冷卻后注入1 μL上機分析。

液相色譜條件:色譜柱:Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相:A相為超純水(含0.1%甲酸),B相為乙腈(含0.1%甲酸);流速0.5 mL/min;柱溫55 ℃;進樣量1 μL;洗脫梯度:0 minV(水)∶V(乙腈)=95∶5;5.5 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10;7.5 minV(水)∶V(乙腈)=75∶25;8 minV(水)∶V(乙腈)=40∶60;8.5 minV(水)∶V(乙腈)=95∶5;13 minV(水)∶V(乙腈)=95∶5。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。

質譜條件:采用美國Thermo公司的Q Exactive高分辨質譜檢測系統進行的采集。采用ESI,鞘氣40 arb;輔助氣10 arb;離子噴霧電壓+3 000 V;溫度350 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為全掃(Full MS)模式;掃描方式為正離子。一級掃描范圍(m/z)150～700。

1.3.5 風味物質的測定

樣品提取:從-80 ℃取出樣品,渦旋混合均勻,吸取1 mL樣品置于頂空瓶中,分別加入飽和NaCl溶液,10 μL(50 μg/mL)內標溶液。在60 ℃恒溫條件下,振蕩5 min,120 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶,頂空萃取15 min,于250 ℃下解析5 min,然后進行GC-MS分離鑒定。采樣萃取頭在Fiber Conditioning Station中250 ℃下老化5 min。

色譜條件:DB-5MS毛細管柱,載氣為高純氦氣(純度≥99.999%),恒流流速1.2 mL/min,進樣口溫度250 ℃,不分流進樣,溶劑延遲3.5 min。程序升溫:40 ℃保持3.5 min,以10 ℃/min升至100 ℃,再以7 ℃/min升至180 ℃,最后以25 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

質譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,質譜接口溫度280 ℃,電子能量70 eV,掃描方式為選擇離子檢測模式(SIM),定性定量離子精準掃描(GB 23200.8—2016)。

1.4 數據分析

使用Excel進行基本的數據處理,SPSS 23進行顯著性數據分析,結果表示為平均值±標準差。所有的實驗均重復3次。采用Origin 2022進行總酸和pH作圖?；谧越〝祿?對樣本的代謝物進行質譜定性定量分析。用MassHunter定量軟件打開樣本下機質譜文件,進行色譜峰的積分和校正工作。采用多元統計分析,包括采用無監督的主成分分析(principal component analysis,PCA)來觀察各組樣本之間的總體代謝物差異和組內樣本之間的變異度大小?；谡黄钚《朔ㄅ袆e分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)結果,從變量重要性投影(variable importance in projection,VIP≥1)初步篩選出組織間差異的代謝物,同時結合差異倍數值(fold change≤0.05)來進一步篩選出差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 山蘭米醋發酵過程中總酸和pH值的變化

總酸和pH值是評價米醋品質的重要指標[9]。米醋發酵過程中總酸和pH值的變化如圖1所示。醋醅為微生物生長繁殖提供營養成分,醋酸菌大量生長繁殖,將原料中的一些化合物轉化成酸類物質。米醋發酵的過程中總酸含量逐漸增加,在發酵15 d時達到最大值(4.64 g/100 mL)并趨于穩定,顯著高于發酵初期第3天(1.32 g/100 mL)。與發酵前期相比,發酵后期總酸含量變化較小,這可能是由于前期醋酸菌等產酸微生物生長旺盛,促使產生較多酸性物質導致發酵環境酸度較高,以及后期醋醅中的營養物質所剩無幾,抑制了醋酸菌等產酸菌的生長代謝。同時,隨著發酵的進行,pH值從初期的4.23下降到發酵結束的3.64。

圖1 山蘭米醋發酵過程理化指標的變化Fig.1 Changes of physicochemical indexes in the fermentation process of Shanlan rice vinegar

2.2 山蘭米醋發酵過程中有機酸的變化規律

有機酸是酸味物質的主要來源,構成醋中獨特的風味和風格[10-11]。在山蘭米醋發酵過程中,共檢測到27種有機酸,如表1所示?？傮w上,發酵過程中乙酸和乳酸的相對含量占比最大,發酵結束時含量分別達到729.91、927.59 mg/L。作為米醋中兩種主要的有機酸,共占有機酸總含量的72%左右。乙酸含量隨著發酵的過程逐漸增加,從415.91 mg/L提升至927.59 mg/L,而乳酸含量則隨著發酵的進行逐漸減少,從1 389.59 mg/L下降至729.91 mg/L,這與LI等[12]研究結果一致。分析原因可能是乳酸菌在有O2存在的條件下代謝生長緩慢,產物乳酸生成降低,且在發酵后期由于乙醇和葡萄糖被大量耗盡,乳酸則作為被醋酸菌利用的碳源。而醋酸菌在每天供氧的條件下,分泌乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶將乙醇氧化生成乙酸[13]。酒石酸、衣康酸和戊酸等有機酸占比相對較小,可能是因為在微生物代謝的過程中難以大量積累。琥珀酸和草酸兩種有機酸呈現逐漸下降的趨勢,琥珀酸由535.12 mg/L下降至404.06 mg/L,草酸由38.03 mg/L下降至6.05 mg/L。檸檬酸在發酵過程中由發酵前期的93.83 mg/L下降至中后期的27.4 mg/L,而后又上升至79.19 mg/L。綜上所述,在米醋發酵的過程中,這些有機酸之間相互協調,緩沖乙酸味道的刺激性,豐富了米醋的口感,使得米醋酸而不澀。

表1 山蘭米醋發酵過程中各種有機酸含量的變化 單位:mg/L

2.3 山蘭米醋發酵過程中游離氨基酸的變化規律

氨基酸是米醋中重要的呈味物質,能夠為米醋提供鮮、甜、苦等滋味,緩沖米醋中酸味的刺激,使得口感更柔和[2]。采用超高效液相色譜法對山蘭米醋發酵過程4個階段游離氨基酸的含量進行測定,共檢測到22種游離氨基酸,如電子版增強出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035449,下同)。整個發酵過程中谷氨酰胺和丙氨酸含量最高,占總含量的30%左右。在發酵3、7、11、15 d積累的總游離氨基酸含量分別為(3 945.65±28.778)、(4 081.70±53.659)、(3 760.03±33.852)、(3 558.16±44.155) μg/mL,發酵過程中的總游離氨基酸含量發生顯著變化(P<0.05),可以看出發酵的中期氨基酸總含量較高,這可能是因為乳酸菌和酵母菌分解蛋白質產生氨基酸,同時發酵初期到中期微生物大量生長繁殖分泌蛋白酶,將原料中的蛋白質分解產生氨基酸,而發酵后期的微生物數量減少、蛋白酶活力下降,同時乳酸菌會在脫羧酶的作用下利用游離的氨基酸產生一些多胺類的物質,導致游離氨基酸含量降低,使得游離氨基酸含量緩慢下降。根據氨基酸的呈味性質,可以分為苦味氨基酸、甜味氨基酸和鮮味氨基酸[9, 14]。甜味氨基酸和苦味氨基酸變化趨勢基本保持一致,發酵初期到中期增加,隨后略有減少,發酵結束后米醋中的甜味氨基酸和苦味氨基酸的含量分別為(1 573.96±10.734)、(723.13±18.097) μg/mL。鮮味氨基酸含量從發酵初期到發酵結束呈現逐漸下降的趨勢,發酵結束后含量為(463.24±5.971) μg/mL。成品米醋中呈味分布為甜味氨基酸>苦味氨基酸>鮮味氨基酸,甜味最為明顯,中和醋中的酸味,增加米醋的味道協調性。

2.4 山蘭米醋發酵過程中代謝物分布特征分析

2.4.1 山蘭米醋發酵過程中揮發性化合物

通過HS-SPME-GC/MS技術,在山蘭米醋發酵不同階段中共鑒定出175種揮發性代謝物,其中包括酯類、萜類、酸類等物質,如圖2所示。其中酯類化合物的種類最豐富(21.71%),其次為萜類化合物(17.71%)和雜環化合物(16%)。在米醋發酵過程中雜環化合物一般對米醋香味影響較小,但大多數酯類物質具有花香、果香和酯香,而萜類物質帶有木質香和天然香氣,為米醋風味貢獻很大的作用[15]。

圖2 山蘭米醋發酵過程中揮發性代謝物的分類Fig.2 Classification of volatile metabolites in the fermentation of Shanlan rice vinegar

2.4.2 PCA

通過對山蘭米醋發酵不同時間各樣本以及質控樣本進行PCA,可以從總體上反映各樣本組間的總體差異以及組內樣本之間的變異度大小。圖3為山蘭米醋發酵不同時間各樣本及質控樣本的PCA圖,第一主成分的貢獻率為67.64%,第二主成分的貢獻率為14.77%,二者累積貢獻率為82.41%,可以較好地反映山蘭米醋中的揮發性成分。從圖3所表示的象限中看,Acid-11 d、Acid-15 d和PC1呈現正相關,而Acid-3 d、Acid-7 d呈現負相關。此外Acid-3 d、Acid-15 d 和PC2呈現正相關,Acid-7 d、Acid-11 d和PC2呈現負相關。以上結果表明,山蘭米醋發酵不同時間的各組樣本之間完全分離并表現出顯著差異,整體說明發酵過程中代謝物差異較大,質控組內平行樣本成分接近,聚集在PCA圖的中心附近,表明方法穩定性較好,數據質量可靠。

圖3 山蘭米醋發酵不同階段樣本及質控的PCA得分圖Fig.3 PCA scores of samples and quality control at different stages of fermentation of Shanlan rice vinegar

2.4.3 山蘭米醋發酵過程中代謝物的OPLS-DA及模型驗證

與PCA相比,OPLS-DA能夠將X矩陣信息分解成與Y相關和不相關的兩類信息,通過去除不相關的差異來篩選差異變量,使組間區分最大化,有利于尋找差異代謝物。OPLS-DA模型得分散點圖如電子版增強出版附圖1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035449,下同),其中橫坐標表示預測主成分,可以看出組間的差距?？v坐標表示正交主成分,可以看出組內的差距,縱向距離越近表明組內重復性越好。百分比表示該成分對數據集的解釋率。圖中的每個點表示一個樣品,同一個組的樣品使用同一種顏色表示。OPLS-DA評價模型的預測參數有R2X、R2Y和Q2,其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預測能力,這3個指標越接近于1表示模型越穩定可靠,Q2>0.5可認為是有效的模型,Q2>0.9為出色的模型。電子版增強出版附圖2為OPLS-DA模型置換驗證圖,橫坐標表示模型R2Y,Q2值,縱坐標是模型分類效果出現的頻數,即本模型對數據進行200次隨機排列組合實驗,一般情況下,P<0.05時模型最佳。由附圖1-a可知,Acid-3 d和Acid-7 d兩組分別位于置信區間的左右兩側,并且Acid-3 d和Acid-7 d之間具有明顯的區分度。PC1和PC2的貢獻率為41.5%和36.1%,R2Y=0.994、Q2=0.936,P<0.05,證實了該OPLS-DA模型擬合度好,具有預測性和穩定性。由附圖1-b可知,Acid-3 d和Acid-11 d兩組分別位于置信區間的左右兩側,并且Acid-3 d和Acid-11 d之間具有比較明顯的區分度。PC1和PC2的貢獻率為50.6%和24.4%,R2Y=0.992、Q2=0.923,P<0.05。由附圖1-c可知,Acid-3 d和Acid-15 d兩組分別位于置信區間的左右兩側,并且Acid-3 d和Acid-15 d之間具有明顯的區分度。PC1和PC2的貢獻率為 46.1%和39.9%,R2Y=0.995、Q2=0.977,P<0.05,證實了3組OPLS-DA兩兩實驗組對比模型擬合度好,具有預測性和穩定性。由附圖1可以看出,每兩組樣本之間區分非常顯著,樣本全部處于95%置信區間內,表明山蘭米醋發酵過程中的代謝物存在顯著差異,可用于后續代謝物差異分析。

2.4.4 差異代謝物聚類分析和篩選

為了更直觀地觀察到發酵過程中不同階段差異代謝物含量的變化趨勢,采用聚類分析方法對山蘭米醋發酵過程中的差異代謝物進行分析。電子版增強出版附圖3說明了代謝物在山蘭米醋發酵過程中的變化規律。根據附圖3-a的樣本聚類的樹狀圖分析,將發酵過程分成兩個區域,Acid-3 d的3個平行樣本為第1區域,Acid-7 d、Acid-11 d和Acid-15差異代謝物聚成一類為第2區域,Acid-3 d大多數代謝物顏色比其他3個階段的深,而其他3個階段中Acid-15 d的代謝物豐度又比其他兩組高。由附圖3可知,Acid-7 d和Acid-11 d的差異代謝物數量較少,說明在發酵中期到中后期代謝物的變化較小,即代謝物表達量變化的趨勢相接近[16]。苯甲醛、苯甲酸烯丙酯、β-苯乙酸乙酯、芐丁醚、吡啶甲酰胺和1-(2-呋喃基)-1-戊酮等隨著發酵時間的延長,代謝物含量逐漸增加,在發酵結束時達到最大。有50%的差異代謝物的含量隨著發酵的進行呈現遞減的趨勢,包括9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯和十六烷酸乙酯等。由附圖3-b可知,隨著發酵時間的延長,差異代謝物的數量逐漸減少,并且篩選出的主要差異代謝物集中在酯類、醇類、酸類、酮類和雜環化合物等。

基于OPLS-DA結果,以同時滿足OPLS-DA模型的VIP>1.0,t檢驗的P<0.05為標準,篩選山蘭米醋發酵不同階段樣品間的差異代謝產物,結果見電子版增強出版附表2。在醋酸發酵的不同階段共檢測到41種差異性代謝物。醋的味道一般來自醇類、酯類、醛類、酸類和酮類等各種化合物相互協調配合[17]。與Acid-3 d組相比較,4種酸類化合物[油酸、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸、11-順-十八碳烯酸和(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸]在Acid-15 d組中的含量發生顯著下降,從高含量降至低含量。醋中的醇類物質大多來自于原料,或者酒精發酵階段微生物作用下的產物。4組樣本共檢測到丙二醇、己醇、(E)-4-己烯-1-醇和3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-醇4種醇類差異代謝物,這些豐富的揮發性化合物,是醋中的香氣活性物質[18]。丙二醇、己醇都屬于雜油醇,是谷物通過酒精發酵后的產物。醋中含有少量的高級醇,能夠賦予醋特殊的味道,并起到襯托酯香的作用,使醋香更加完美。醛類和酮類因為分子中均含有羰基所以合稱為羰基化合物,在米醋發酵過程中共檢測到8種羰基類代謝差異化合物。醋中主要的酮類物質為乙偶姻(3-羥基-2-丁酮),乙偶姻帶有淡淡的奶油酸奶香氣[19-20]。乙偶姻是眾多微生物作用的產物,在醋的釀制過程中由α-乙酰乳酸脫羧酶轉化雙乙酰產生,是醋中常見的香氣化合物。由附圖3和附表2可以看出,乙偶姻在醋酸發酵過程中逐漸被消耗。發酵期間,醛類差異代謝物只有3個,包括環己烷甲醛、苯甲醛和十八醛。苯甲醛含有杏仁香味,能夠增加山蘭米醋的風味。在發酵第3天和第7天含量幾乎沒有發生變化,而在中后期其含量發生大幅度上升。十八醛具有強烈的椰子油香氣,在發酵期間緩慢減少。酯類化合物一般由酸與醇的共同反應生成,多數酯類化合物具有花果香氣,可使米醋具有理想的風味[21]。檢測到發酵過程中的酯類差異代謝物共有12種,占差異代謝物數量的29%。其中,十六烷酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、β-苯乙酸乙酯和(4Z,15Z)-4,15-十八碳烯乙酸酯等酯類含量較大。β-苯乙酸乙酯具有甜甜的玫瑰花香味,其含量在發酵期間變化最大,呈現逐漸遞增的趨勢。油酸乙酯由油酸和醇類物質酯化反應生成,油酸乙酯含量在醋酸發酵過程中逐漸減少,考慮與油酸含量減少有關。萜類化合物的產生主要來源于米醋的原料,β-紫羅蘭酮具有木質香韻,是合成視黃醇、β-胡蘿卜素和維生素A等的前提化合物,具有抗癌作用[22],其含量隨著發酵的過程緩慢增加。

2.4.5 差異代謝物的代謝通路分析

山蘭米醋的發酵過程受到多種因素的共同調控,需進一步對其代謝通路進行分析,找到發酵過程中潛在的代謝途徑。因此,根據山蘭米醋發酵不同階段差異代謝物的結果,進行KEGG通路富集分析,其中Rich Factor為對應通路中差異代謝物個數與該通路注釋到的代謝物總數的比值,該值越大表示富集程度越大,P值越接近于0,表示富集越顯著,結果見圖4。點的顏色反映P值大小,越紅表示富集越顯著,點的大小代表富集到相應通路上的差異顯著代謝物個數。由圖4可知,參與山蘭米醋發酵過程的關鍵代謝通路共有17條,主要的相關代謝途徑有植物次生代謝產物的生物合成通路、不飽和脂肪酸的生物合成通路、二萜生物合成通路、次生代謝產物的生物合成通路、代謝途徑通路、芳香族化合物降解通路和不同環境下的微生物代謝通路。且不同環境下的微生物代謝通路的富集程度最為顯著,次生代謝產物的生物合成通路、植物次生代謝產物的生物合成通路和不飽和脂肪酸的生物合成通路的富集程度最高。

圖4 山蘭米醋發酵過程中差異代謝物通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of differential metabolite pathway during fermentation of Shanlan rice vinegar

將關鍵代謝通路中主要參與的差異代謝物與代謝路徑進行整合,如圖5所示。圖中標紅的表示發酵過程中的主要差異性代謝。由圖5可知,主要參與的差異代謝物有6種,分別為丙二醇、苯甲醛、反式香葉基香葉醇、油酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸和(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸。在山蘭米醋發酵過程中,乙酰輔酶A先轉化成丙二酰輔酶A,而后將飽和脂肪酸氧化生成不飽和脂肪酸[油酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸]。苯甲醇在芳基醇脫氫酶的作用下生成苯甲醛,苯甲醛在苯甲醛脫氫酶的作用下生成苯甲酸酯,苯甲酸酯在二羥基環己二烯羧酸脫氫酶的作用下生成鄰苯二酚,鄰苯二酚經過多重轉化形成琥珀酰輔酶A,琥珀酰輔酶A在氧化酶的催化下最終生成乙酰輔酶A,進入代謝循環。葡萄糖在醛縮酶的作用下生成磷酸甘油酮,在甘油脫氫酶的作用下磷酸甘油酮轉化成L-乳醛,L-乳醛在乳醛酸還原酶作用下產生丙二醇。香葉基焦磷酸經過香葉酰二磷酸酶的作用生成萜類物質反式香葉基香葉醇。綜合代謝通路的分析結果,這些關鍵代謝物質可能影響山蘭米醋的風味和品質。

圖5 山蘭米醋發酵過程中差異代謝物途徑分析Fig.5 Analysis of differential metabolite pathway during fermentation of Shanlan rice vinegar

3 結論

以山蘭米醋為研究對象,對發酵過程中的理化性質、游離氨基酸、有機酸和風味代謝物進行定量分析。山蘭米醋發酵過程中總酸含量逐漸增加,而pH值呈現緩慢下降趨勢,兩者呈現負相關。在山蘭米醋不同發酵階段共檢測到27種有機酸,其中乳酸和乙酸的含量較高,占有機酸總含量的72%左右,是山蘭米醋中的兩種主體有機酸,而酒石酸、衣康酸和戊酸等有機酸含量占比相對較小。整個發酵過程中谷氨酰胺和丙氨酸含量最高,而游離氨基酸總含量在發酵的中期較高,成品米醋中呈味分布為甜味氨基酸>苦味氨基酸>鮮味氨基酸?；赑CA和OPLS-DA結果分析,發酵不同階段的代謝物差異較大,共檢測到41種差異代謝物。通過分析發酵過程中差異代謝物相對含量的變化,發現隨著發酵時間的延長,大部分差異代謝物的相對含量顯著增加。山蘭米醋的發酵過程受到多種因素的共同調控,通過對差異代謝物的代謝途徑進行分析,篩選出17條關鍵代謝通路,發現不同環境下的微生物代謝通路的富集程度最為顯著,次生代謝產物的生物合成通路、植物次生代謝產物的生物合成通路和不飽和脂肪酸的生物合成通路的富集程度最高。