基于指紋圖譜和網絡藥理學的經典名方三化湯質量標志物預測△

倪天婷，談仲川，梅佳鈺，羅鑫，朱靚婷，高潔，干國平，2*

1.湖北中醫藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065；

2.湖北省中藥炮制工程技術研究中心，湖北 武漢 430065

經典名方是古代醫家長期臨床實踐經驗的結晶，已成為我國中藥新藥研發的重要源泉[1]。三化湯出自劉完素《素問病機氣宜保命集》[2]，收載于《古代經典名方目錄（第一批）》[3]，處方由大黃、枳實、厚樸、羌活4 種藥味組成，具有祛風瀉熱、清熱通便、通腑導滯功效，用于治療中風入臟、大便不通等[4-5]。本課題組擬對三化湯進行新藥開發研究。

藥效成分量值傳遞規律是開發古代經典名方過程中的重點研究內容，首先需明確其藥效成分，但由于中藥化學成分復雜，因此需要采用中藥分析學、網絡藥理學等多學科交叉技術，通過多成分、多途徑、多靶點研究其藥效成分及治療作用。中藥指紋圖譜利用現代分析方法對中藥的藥效化合物進行表征，并將其與化學計量學結合，更客觀地反映中藥的完整性和差異性，是目前常見的發現共有成分和評估質量一致性的方法[6]。網絡藥理學通過建立成分-靶點-通路的網絡拓撲學關系，預測藥物與疾病之間的關系，其整體性、系統性的特點符合中醫藥整體觀、辨證論治的原則[7]。

中藥質量標志物（Q-marker）是以現代科學和生物技術為研究手段，對中藥形成全過程中的化學物質組成及其傳遞變化規律進行鑒定和闡明，并按照可測性、特有性、傳遞與溯源、有效性和處方配伍5 項基本原則提煉得到的活性成分（群），用以建立中藥全過程質量控制與溯源體系[8]。因此，本研究基于Q-marker 理論，整合高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜、化學計量學及網絡藥理學，從生物信息學和化學角度分析預測經典名方三化湯潛在的Q-marker，為三化湯質量控制研究提供參考依據。

1 材料

1.1 樣品

15 批不同來源的大黃、枳實、厚樸、羌活均由湖北中醫藥大學楊紅兵教授鑒定，分別為藥用大黃Rheum officinaleBaill.、酸橙Citrus aurantiumL、厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils、寬葉羌活Notopterygium franchetiiH.de Boiss。利用隨機數表法將厚樸、羌活、大黃、枳實4 味藥不同批次隨機組合，樣品信息見表1。

表1 三化湯樣品各藥味批號、產地信息

1.2 儀器

LC-20AD 型高效液相色譜儀（島津公司）；JY/YP 5002 型電子天平（上海上天精密儀器有限公司）；30MF5 3L 型微電腦養生壺（潮州市潮安區龍光電器有限公司）；AS 系列超聲波清洗機（天津市特賽恩斯儀器有限公司）；HHS-2S 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海虞龍儀器設備有限公司）；BS210S型萬分之一天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；AB135-S型十萬分之一天平（Mettler-Toledo公司）。

1.3 試藥

對照品厚樸酚（批號：Y2TJ10191584）、和厚樸酚（批號：Y2806135149）均購于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；辛弗林（批號：AF21031451）、柚皮苷（批號：AF21101953）、新橙皮苷（批號：AF21082352）、紫花前胡苷（批號：AF20060610）、蘆薈大黃素（批號：AF20021623）、大黃素甲醚（批號：AF20051502）均購于成都埃法生物科技有限公司，純度≥98%；對照品橙皮苷（批號：110721-201818，純度：96.20%）、大黃素（批號：110756-201913，純度：96.0%）、大黃酚（批號：110796-201922，純度：99.4%）、大黃酸（批號：110757-201607，純度：99.3%）均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜級甲醇、乙腈購于Sigma公司；其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件

采用YMC C18色譜柱（25 cm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.01%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，5%B；5～13 min，5%～17%B；13～36 min，17%B；36～55 min，17%～20%B；55～105 min，20%～70%B；105～115 min，70%～90%B；115～125 min，90%B；125～130 min，90%～5%B）；柱溫為30 ℃；檢測波長：0～10 min，224 nm；10～60 min，285 nm；60～80 min，310 nm；80～93 min，254 nm；93～105 min，310 nm；105～130 min，254 nm；流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 三化湯物質基準的制備 根據文獻考證[9-14]及本課題組前期實驗結果，確定三化湯物質基準的制備方法：取厚樸、大黃、枳實、羌活各31 g，各藥味先切碎過3目篩，不過8目篩，加水600 mL，浸泡30 min，加蓋，用微電腦養生壺煎煮，武火（500 W）煎煮8 min，再用文火（200 W）煎煮約22 min，200目篩濾過，濾液定容至300 mL，即得。

2.2.2 混合對照品的制備 將精密稱量的柚皮苷、辛弗林、紫花前胡苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、異歐前胡素、厚樸酚、大黃酚、大黃素甲醚對照品加乙腈-水（50∶50）制成質量濃度分別為4 328.52、1 415.57、728.63、299.06、3 645.78、25.06、86.99、28.95、19.43、17.36、27.56、30.12、15.04 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取三化湯物質基準5.0 mL，用乙腈-水（50∶50）混合溶劑稀釋20倍，混勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 減去處方中待測藥味，稱取其他3味藥物，先按2.2.1項下方法制成陰性樣品，再按2.2.3項下方法分別制成4種陰性樣品溶液。

2.2.4 對照藥材溶液的制備 分別取大黃、枳實、厚樸、羌活粗顆粒各31 g，按2.2.1 項下和2.2.3 項下方法分別制成4種對照藥材溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 參照峰選擇 在標準色譜圖中紫花前胡苷分離度好、峰面積大、峰形好且穩定，故選擇紫花前胡苷作為參照，計算15 批三化湯物質基準指紋圖譜中各色譜峰共有峰的相對保留時間、相對峰面積。

2.3.2 精密度試驗 取同一供試品溶液，重復進樣6 次，以紫花前胡苷為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.3.3 重復性試驗 按照2.2.3 項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按2.1項下色譜條件進行測定，以紫花前胡苷為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.3.4 穩定性試驗 取同一批供試品，于0、3、6、9、24 h 進行測定，以紫花前胡苷為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.4 指紋圖譜的建立與相關性分析

2.4.1 三化湯指紋圖譜的建立 取15 批三化湯物質基準，按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，進樣分析，將色譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），隨機選取S1（SHT01）為參照，采用中位數法，進行多點校正和全譜峰匹配分析，生成15批三化湯指紋圖譜以及對照指紋圖譜。

2.4.2 相似度評價 將15 批三化湯色譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）計算相似度。

2.4.3 共有峰的確認及指紋圖譜峰歸屬 分別吸取2.2 項下制備的對照品溶液、對照藥材溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按2.1 項下色譜條件進行測定，對指紋圖譜峰進行歸屬及指認。

2.5 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

使用統計數據分析軟件SIMCA 13.0 對15 批樣品的指紋圖譜進行OPLS-DA。采用變量重要性投影（VIP）值確定物質基準影響較大的物質。

2.6 網絡藥理學研究

2.6.1 三化湯活性成分靶點篩選 通過ccTCM 數據庫（http://cctcm.org.cn/）搜索13 個成分的靶點，通過PubChem 數據庫（https://pubchem.nehi.nlm.nih.gov）下載指認的13 個活性成分的分子結構式，以SMILES 形式導入SwissTargetPrediction 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch），設置物種為“Homo sapiens”獲得蛋白質靶點信息，設置Probability＞0，得到化合物的作用靶點。

2.6.2 疾病靶點的收集 三化湯有治療卒中、腦缺血、利尿、通便的功效，故通過GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）和DisGNET（https://www.disgenet.org）數據庫，以“stroke”“laxative”“diuresis”“cerebral ischemia”為關鍵詞進行檢索，合并得到疾病的靶點，去除重復值，得到疾病靶點。

2.6.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建 通過韋恩圖，對2.6.1 項下收集的活性成分靶點與2.6.2項下收集的疾病靶點進行交集，將得到的交集靶點導入String 數據庫（https://cn.string-db.org/），進行PPI 分析。以“Homo species”作為分析物種，“minimum required interaction score”選擇“highest confidence（0.900）”，勾 選“hide disconnected nodes in the network”項，分析并下載結果。將結果導入Cytoscape 3.10.0 軟件，利用Cyto NCA 插件對數據結果進行分析，選擇度（degree）、介度（betweenness centrality）和緊密度（closeness centrality）均大于中位數且度值＞10的靶點作為核心靶點。

2.6.4 基因本體（GO）生物學分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將38 個核心靶點導入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov），進行GO 功能分析中基因靶點的生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）和KEGG通路富集分析。以P＜0.01為篩選條件，GO 功能分析選取前10條、KEGG通路富集分析選擇前20條。

2.6.5 成分-靶點-通路網絡構建 將13 個成分、2.6.1 項下靶點、2.6.4 項下前20 條通路，導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建成分-靶點-通路網絡圖。

2.6.6 分子對接 通過PubChem 數據庫下載13 個活性成分的3D 結構。在PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）中下載核心靶點的3D 結構，導入PyMol 2.1.0 軟件對靶點蛋白進行去除配體、水。利用AutoDock 1.5.6 軟件對小分子配體和蛋白受體進行活性修飾，將處理后的小分子配體和蛋白受體進行對接運算。再導入PyMol 軟件進行作圖，得到最終的對接圖。

3 結果

3.1 方法學考察結果

3.1.1 精密度 計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0.97%～2.06%、0.77%～1.66%，結果表明，儀器精密度滿足要求。

3.1.2 重復性 計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0.81%～1.88%、0.32%～1.84%，結果表明，方法重復性良好。

3.1.3 穩定性 計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0.84%～1.81%、0.69%～2.04%，結果表明，供試品溶液在室溫24 h內穩定。

3.2 指紋圖譜的建立與相關性分析

3.2.1 三化湯指紋圖譜的建立及相似度評價 15批三化湯樣品共得到17 個共有峰，疊加指紋圖譜及標準指紋圖譜見圖1、圖2。15 批樣品的指紋圖譜相似度均＞0.97，表明不同批次三化湯樣品的相似度較高，生產工藝均一穩定。

圖1 三化湯物質基準HPLC指紋圖譜

圖2 三化湯物質基準標準指紋圖譜

3.2.2 三化湯共有峰歸屬及指認 通過比對供試品溶液、4 味藥陰性樣品溶液、4 味藥對照藥材溶液，對17 個共有峰進行歸屬，結果見圖3。峰1、3、4、5、6 歸屬為枳實；峰7、8、9、10、12、16、17 歸屬為大黃；峰13、15歸屬為厚樸；峰2、11、1歸屬為羌活。通過比對混合對照品溶液和三化湯物質基準供試品溶液指紋圖譜，指認出13 個共有峰，分別為辛弗林、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、厚樸酚、異歐前胡素、和厚樸酚、大黃酚、大黃素甲醚。

圖3 三化湯物質基準HPLC指紋圖譜中色譜峰歸屬

3.3 OPLS-DA

為了探索影響物質基準質量差異的原因，使用統計數據分析軟件SIMCA 13.0 對15 批樣品的指紋圖譜進行OPLS-DA。15 批樣品被明顯劃分為左右3個區域，見圖4。采用VIP值確定物質基準影響較大的物質，選擇VIP 值＞1.0 的化合物，得到影響較大的峰為6（新橙皮苷）、4（柚皮苷）、2（紫花前胡苷）、9（大黃酸）、11（未知，歸屬為羌活）號峰，共5個峰。

圖4 15批三化湯物質基準OPLS-DA

3.4 網絡藥理學研究

3.4.1 三化湯化合物及靶點預測 三化湯樣品指紋圖譜指認的13個成分在ccTCM、SwissTargetPrediction上搜索和預測相應靶點，去掉重復的靶點，得到499個靶點。

3.4.2 疾病靶點預測 GeneCard 篩選得到5027 個靶點，DrugBank 得到69 個靶點，OMIM 得到95 個靶點，刪除重復項，共得到5058個疾病靶點。

3.4.3 PPI 網絡構建 繪制韋恩圖，得到有效成分靶點和疾病靶點數據集的交集靶點298 個（圖5）。PPI網絡模型見圖6。度、介度和緊密度值均大于中位數且度值＞10 的靶點作為核心靶點，共38個（表2）。

圖5 三化湯治療疾病靶點韋恩圖

圖6 三化湯治療疾病靶點PPI網絡

表2 三化湯化合物核心靶點

3.4.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3.4.4.1 GO 功能富集分析 運用DAVID 數據庫對已整理的核心靶點進行GO 富集的BP、CC、MF 3個項目進行分析，共得到418 條富集結果。其中BP 289 條，主要富集基因表達的正調控、細胞凋亡過程的負調控、對外源性刺激的反應、肽基絲氨酸磷酸化的正調控、蛋白質磷酸化的正調控等；CC 39條，主要富集細胞質、大分子復合物、核質、核等；MF 90 條，主要富集酶結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）結合、泛素蛋白連接酶結合、激酶活性等過程。根據P值選取前10條通路展示，見圖7A。

圖7 三化湯治療疾病靶點GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3.4.4.2 KEGG 通路富集分析 運用DAVID 數據庫對已整理的潛在靶點進行KEGG 通路富集，共得到157 條富集通路，其中主要富集到的通路是內分泌抵抗、脂質和動脈粥樣硬化、前列腺癌、結直腸癌、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路等。根據P值選取前20 條KEGG 通路展示，見圖7B。

3.4.5 成分-靶點-通路網絡構建 將指紋圖譜中指認的13 個化合物及其對應靶點、20 條通路及其富集靶點導入Cytoscape，構建成分-靶點-通路網絡，見圖8。結果表明，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚與靶點及通路的連接強度較大。

圖8 三化湯治療疾病成分-靶點-通路網絡

3.4.6 分子對接 由PPI 網絡可知，三化湯中發揮療效的主要為腫瘤蛋白P53（TP53）、Akt1、90 kDa熱休克蛋白αA1（HSP90AA1）、非受體酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（PIK3CA）等靶點，將13 個成分與核心靶點Akt1 進行分子對接，結果顯示13 個化合物與Akt1 的結合能均小于0，表明核心靶點與成分能在體內自發地結合。分子對接結合能見表3，分子對接結果圖見圖9。

圖9 三化湯13個成分與Akt1分子對接結果

表3 三化湯13個成分與Akt1分子對接結合能 kcal·mol-1

4 討論

本研究采用HPLC 多波長切換法建立了三化湯的指紋圖譜，共篩選出17個共有峰，并對其中13個峰進行了指認。采用化學計量學分析，15 批三化湯物質基準被分為3類，并通過VIP值得出枳實中黃酮類成分及大黃中大黃酸對三化湯的質量影響較大。在指認的13 個成分中，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚歸屬于大黃，辛弗林、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷歸屬于枳實，厚樸酚、和厚樸酚歸屬于厚樸，紫花前胡苷、異歐前胡素歸屬于羌活，結果表明13 個成分滿足Q-marker中處方配伍及特有性的要求；在《中華人民共和國藥典》2020 年版規定三化湯涉及藥材指標性成分有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚（大黃的定量指標成分），辛弗林（枳實的定量指標），厚樸酚、和厚樸酚（厚樸的定量指標），異歐前胡素（羌活的定量指標）[15]。13個成分質量分數在三化湯物質基準中均較高（＞0.01%），在后續的三化湯制備工藝研究中，為了探討中藥-飲片-基準物質的質量傳遞與溯源，根據三化湯指紋圖譜的色譜條件，建立了同時測定13 個成分含量的測定方法，方法學驗證結果表明符合指導原則要求，表明13 個成分均滿足Q-marker中可測性的原則。

卒中后便秘可能是因為卒中后人的活動能力受限、活動減少，胃腸運動也受到影響，容易導致便秘。吳門醫派認為卒中責之肝腎陰虛，水不涵木，卒中之后易向胃陰不足轉歸而發生便秘[16]。三化湯中大黃的功能主治為瀉下攻積、清熱瀉火，用于實熱積滯便秘，其中蒽醌類成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚是大黃的主要活性物質[17]。唐大軒等[18]研究得出大黃中發揮導瀉作用的最終物質是蒽醌類成分，其刺激胃腸道分泌，升高胃腸道內蛋白質濃度，進而發生容積性導瀉。枳實中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷可促進胃腸動力，有顯著促進胃腸蠕動和胃排空的作用，抑制腸道內炎癥因子和蛋白質的過度表達，減少對腸黏膜的損傷[19]，改善便秘；辛弗林有松弛胃平滑肌的作用[20]。厚樸中厚樸酚與和厚樸酚均有促進小鼠胃排空和腸推進的作用，和厚樸酚具有抗炎作用[21-23]，在腦缺血的治療中有良好效果[24]。羌活中紫花前胡苷、異歐前胡素具有抗炎鎮痛作用[25]。結果提示三化湯中大黃蒽醌類成分、枳實黃酮類成分及生物堿成分、厚樸中厚樸酚與和厚樸酚、羌活中紫花前胡苷和異歐前胡素有改善胃腸道環境、促進胃腸道蠕動、抗炎、治療腦缺血的作用。

對13 個成分進行網絡藥理學預測分析，得出TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 等為三化湯核心靶點。研究發現，激活Akt1可以維持Cajal間質細胞（ICC）的功能，ICC 胃腸道運動有緊密關系[26-27]。TP53 和HSP90AA1 是癌癥相關靶點。研究表明，便秘會增加短期內患癌癥的風險[28]；Zhang等[29]證實，HSP90AA1 通過正向調節SRP9，使結直腸癌細胞過度增殖。SRC 家族包括膜結合型非受體酪氨酸激酶亞類，其參與各種細胞信號傳導途徑。研究表明，SRC 磷酸化可增加微血管通透性，并參與血腦屏障損傷后的病理通透過程，抑制SRC 活性可有效保護血腦屏障，減輕腦腫脹[30]。PIK3CA 是PI3K 的催化亞基，參與多種生長因子的細胞信號傳導[31]。結果提示，TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 可能與三化湯治療卒中后二便不通、腦缺血有關。

KEEG 通路主要涉及了癌癥通路、內分泌抵抗、脂質和動脈粥樣硬化、PI3K-Akt 信號通路等。分子對接對網絡藥理學結果進行了驗證結果顯示，13 個成分均能與核心靶點穩定地結合。便秘可能涉及PI3K/Akt 信號通路，Yao 等[32]認為可以通過上調Akt的磷酸化、增強PI3K/Akt 和核轉錄因子E2相關因子2/血紅素氧合酶1（Nrf2/HO-1）信號通路，減少免疫細胞凋亡，進而改善便秘。PI3K/Akt 信號通路被激活后可調控抗神經元凋亡以及促進血管新生保護腦組織[33]。Yan等[34]證實，激活PI3K/Akt/mTOR通路可抑制氧化應激相關的神經元自噬，發揮神經保護功能。腦缺血有可能引起嚴重的炎癥反應、腦水腫和神經功能缺損[35-36]。結果提示三化湯可能是通過TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 等靶點作用于PI3K/Akt信號通路發揮療效。

綜上所述，三化湯中13 個成分均滿足Q-marker五原則，基于VIP 值＞1（新橙皮苷、柚皮苷、紫花前胡苷、大黃酸）、成分含量排名前4（柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林、紫花前胡苷）及成分-靶點-通路網絡中連接強度前5（大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚），預測新橙皮苷、柚皮苷、紫花前胡苷、大黃酸、辛弗林、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚10 個成分可能為三化湯的潛在Q-marker，為三化湯質量控制及后續研究提供了參考。

本研究只進行了三化湯指紋圖譜與網絡藥理學的研究，網絡藥理學的研究存在一定的局限性，后續可以開展三化湯治療卒中、腦缺血、卒中后二便不通的動物、細胞實驗，進一步深入研究三化湯作用機制。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。