黑白中藥通過調節MC1R和RTKs的表達對黑色素代謝的影響研究

楊波濤 賈桂云 陳鯤 吳躍文 楊柳 查旭山

[摘要]目的：探討首烏、女貞子等七味黑色中藥和白及、白芷等七味白色中藥對豚鼠皮膚組織黑色素合成中黑皮質素1受體（Melanocortin 1 receptor，MC1R）、受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTKs）表達的影響。方法：采用水提法獲得中藥提取物，用灌胃的方法以14 d為周期等量灌胃豚鼠獲得背部皮膚組織，采用免疫組化及免疫熒光法檢測實驗和對照組MC1R、RTKs蛋白的表達，用Image J軟件統計分析結果，比較不同中藥環境對豚鼠皮膚組織的黑色素合成的影響，分析MC1R、RTKs蛋白與黑素細胞代謝三者的變化關系。結果：對MC1R蛋白有抑制作用的白藥有白芷、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶、白術，其中白芷、白僵蠶、白術的作用最為明顯，對MC1R有明顯抑制作用的黑藥有烏梅、黑芝麻、丹參、雞血藤，其中丹參的抑制作用最為明顯。該結果顯示上述10味中藥對黑色素合成有抑制作用，其中白芷、白僵蠶、白術、丹參的抑制作用最為明顯。其中對于RTKs蛋白有抑制作用的白藥有白芷、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶，其中白茯苓、白蘞、白及的作用最為明顯，具有明顯作用的黑藥有黑芝麻、丹參，其中丹參的作用最為明顯。結論：藥材顏色與藥效之間有一定關系；黑白中藥都對MC1R及RTKs蛋白有不同程度的抑制作用，色象中藥可能通過調節α-黑素細胞剌激素/黑皮素1受體（Alpha-melanocyte stimulating hormone/Melanocortin 1 receptor，α-MSH/M1CR）、干細胞生長因子/受體酪氨酸激酶（Stem cell growth factor/Receptor tyrosine kinase，SCF/RTKs）信號通路來影響黑素細胞代謝。

[關鍵詞]中藥色象理論；黑白中藥；黑素細胞；黑皮質素1受體；受體酪氨酸激酶

[中圖分類號]R285? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）03-0012-05

Study on the Effect of Black and White Chinese Medicine on Melanin Metabolism by Regulating the Expression of MC1R and RTKs

YANG Botao1，2，JIA Guiyun3，CHEN Kun3，WU Yuewen2，YANG Liu4，ZHA Xushan1

（1.Department of Dermatology，the First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，Guangdong，China; 2.Department of Dermatology，Nanhai Hospital， Guangdong Provincial People's Hospital，Foshan 510251，Guangdong，China; 3.School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China; 4.School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

Abstract： Objective? To investigate the effects of seven black Chinese herbs， such as Polygonum multiflorum Thunb， and Ligustrum lucidum， and seven white Chinese herbs， such as Bletilla striata and Angelica dahurica， on the expression of melanocortin 1 receptor （MC1R） and receptor tyrosine kinase （RTKs） in melanin synthesis of guinea pig skin. Methods? The extract of traditional Chinese medicine was obtained by water extraction， and the skin tissue of the back of guinea pigs was obtained by gavage of the same amount in a 14 day cycle. The expression of MC1R protein and RTKs protein in the experimental and control groups were detected by immunohistochemistry and fluorescence methods. The results were statistically analyzed by Image J software. The effects of different traditional Chinese medicine environments on melanin synthesis in the skin tissue of guinea pigs were compared， and MC1R The relationship between RTKs protein and melanocyte metabolism. Results? The white herbs with inhibitory effect on MC1R protein are Angelica dahurica， Poria cocos， Ampelopsis japonica， Atractylodes macrocephala， atractylodes macrocephala， among which the effects of Angelica dahurica， Atractylodes macrocephala， Atractylodes macrocephala are the most obvious， and the black herbs with significant inhibitory effect on MC1R are Ophiopogon flexuosus， Nigella sativa， Dangshen， Chickweed， among which the inhibitory effect of Dangshen is the most obvious. This result showed that the above 10 herbs had inhibitory effects on melanin synthesis， among which the inhibitory effects of Angelica dahurica， Cortex alba， Atractylodes macrocephala， and Salvia miltiorrhiza were the most obvious. Among them， the white herbs with inhibitory effect on RTKs protein are Angelica dahurica， Poria cocos， Ampelopsis pilosulae， Bupleurum officinale and Bupleurum officinale， among which Poria cocos， Ampelopsis pilosulae and Bupleurum officinale have the most obvious effect， and the black herbs with obvious effect are Nigella sativa and Salvia miltiorrhiza， among which Salvia miltiorrhiza has the most obvious effect. Conclusion? There is a certain relationship between the color of medicinal materials and their efficacy. Both black and white drugs inhibit the action of MC1R and RTKs protein to varying degrees， and color image Chinese medicine may regulate α- MSH/M1CR and SCF/RTKs signal pathways affect melanocyte metabolism.

Key words： Color-effect phenomenon theory of traditional Chinese herbs; black and white Chinese herbs; melanocytes; melanocortin 1 receptor; receptor tyrosine kinase

中藥色象是表明中藥材顏色與療效相關的現象，該理論稱為色象理論，而基于該理論的中藥稱為色象中藥[1]，但中藥材本身的顏色與藥效之間是否存在特定的作用關系，機制尚未闡明。筆者團隊從2007-2022年來一直致力于中藥色象理論基礎研究與臨床工作，最近通過觀察臨床常用治療白癜風與黃褐斑色象中藥以及文獻統計分析篩選出最常用的色象中藥即黑色與白色中藥[2]各七味，提取物灌胃豚鼠后，采用免疫組化及熒光檢測并觀察實驗組和對照組黑素皮質激素受體1（MC1R）蛋白、RTKs蛋白的表達量，分析不同中藥環境對豚鼠皮膚組織的黑色素合成影響的原因及其相互作用關系，現報道如下。

1? 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級成年豚鼠64只，體重約250克/只，均購于廣東省動物實驗中心。

1.1.2 主要試劑與材料：白芷、白附子、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶、白術、首烏、熟地、烏梅、女貞子、黑芝麻、丹參、雞血藤共14味中藥（均由香港奧美藥業股份有限公司提供）、免疫染色固定液、免疫染色洗滌液、RTKs Rabbit Monclonal Antibody、MC1R Rabbit Monclonal Antibody、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（均購于碧云天生物技術公司）。電磁爐（購于美的集團股份有限公司）、離心機（Model E3116R，ESSENSCIEN U.S.A.）、粉碎機、載玻片（帆船）、冷凍切片機（Leica，Germany）、熒光倒置顯微鏡（Nikon，Japan），電子天平（ME203E/02，購于梅特勒-托利多儀器上海有限公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥的提?。ㄋ岱ǎ簩?4味黑白中藥分別稱取10 g，用粉碎機粉碎成粉末狀，分別加入蒸餾水300 ml，浸泡30 min，大火煎煮至沸騰，改用文火煎煮至黏稠。再加150 ml蒸餾水煎煮，重復上述操作兩次，室溫下靜置過夜，次日用4層紗布過濾，得濾液于離心管，5 000 r/min離心15 min，收集上清液后定容至50 ml，分裝后-20℃保存。

1.2.2 豚鼠給藥及皮膚組織獲?。簩?4只健康豚鼠（實驗動物倫理編號：KJ-2019-03-001）按照隨機分組的方式分為16組，每組4只，其中兩組為對照組，余下14組為實驗組。相同條件下飼養1周后實驗組每組每只每天灌胃喂養0.5 ml的中藥提取液，對照組以同樣的方法喂入等量的蒸餾水，連續喂藥14 d，每天盡量保證同一時間給藥。喂藥周期結束后，處死豚鼠，刮去背毛，取其背部約4 cm2的皮膚組織，用液氮迅速冷卻后置于離心管中做好標記后在-80℃下儲存。

1.2.3 皮膚組織的免疫組化：使用德國Leica冷凍切片機將獲取的豚鼠皮膚組織切成10μm的薄片置于載玻片上，滴加免疫染色固定液覆蓋組織切片，固定10 min后用免疫染色洗滌液洗滌2～3次，5分鐘/次。吸去最后1次洗滌液后立即滴加BSA封閉液室溫封閉1.5 h，回收封閉液后立即滴加稀釋好的一抗[MC1R抗體或RTKs抗體（均按照1∶200的比例稀釋）]室溫孵育1.5 h?；厥找豢?，用洗滌液洗滌3次，6分鐘/次，吸去最后一次洗滌液后滴加稀釋好的二抗[辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（按照1∶200的比例稀釋）]室溫孵育1 h?；厥斩?，用洗滌液洗滌3～5次，6分鐘/次（整個過程要避免切片干燥，否則極易產生較高的背景），加入配置好的DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（A液∶B液=1∶1）染色10 min，用蒸餾水洗滌3次。將載玻片置于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光，拍照記錄結果。

2? 結果

2.1 黑白中藥對MC1R蛋白表達的影響：結果顯示，對MC1R蛋白有抑制作用的白藥有白芷、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶、白術，其中白芷、白僵蠶、白術的作用最明顯，見圖1。黑藥中對MC1R有明顯抑制作用的中藥有烏梅、黑芝麻、丹參、雞血藤，其中丹參的抑制作用最為明顯，見圖2（結果圖片來源于廣州大學生命科學院）。黑白中藥對MC1R蛋白表達影響Image J軟件分析結果見圖3。

2.2 黑白中藥對RTKs蛋白的影響：結果顯示，對RTKs蛋白有抑制作用的白藥有白芷、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶，其中白茯苓、白蘞、白及的作用最為明顯，見圖4；具有明顯抑制作用的黑藥有黑芝麻、丹參，其中丹參的作用最為明顯，見圖5。黑白中藥對RTKs蛋白表達影響Image J軟件分析結果見圖6。

2.3 黑白中藥對豚鼠背部皮膚組織熒光強度與面積的影響分析：結果顯示，黑白中藥對豚鼠背部皮膚組織MC1R、RTKs熒光強度與面積的影響作用與熒光圖片、Image J軟件分析結果一致。見表1。

3? 討論

本研究選擇經典的黑色素代謝研究方法（含中藥血清對體外干預蘑菇酪氨酸酶活性的方法、中藥血清干預體外培養人黑素細胞后其酪氨酸酶基因蛋白的表達、黑素合成量）來研究色象中藥對色素代謝的影響，保證實驗結果的可靠。黑色素的產生與黑素細胞分化緊密相關，分化和色素沉著的產生以各種信號轉導途徑的激活為標志，這些途徑主要導致誘導鄰苯二甲酸相關的轉錄因子Mitf轉錄。Mitf反過來激活的黑色素合成相關基因如TYIP1，TYRP2，Tyr等基因的分化。研究表明[3-7]，有兩種主要途徑可控制Mitf的誘導：α-黑素細胞刺激素（α-MSH）/黑皮質素1受體（MC1R）信號傳導途徑，以及干細胞因子（SCF）/RTKs受體酪氨酸激酶途徑。作為對紫外線輻射的急性生理反應，角質形成細胞產生并分泌α-MSH（類似于促腎上腺皮質激素，ACTH）可以與MC1R結合，從而在黑素細胞中啟動細胞內cAMP介導的信號級聯?；罨鞍追催^來激酶A（PKA）磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（CREB），導致Mitf的轉錄激活，從而驅動皮膚色素沉著。而RTKs受體（CD117）是由原癌基因RTKs編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，它是Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族（RTK）的重要成員[8]，SCF/RTKs信號通路調節黑素細胞的增殖和遷移[9-10]。以上都說明α-MSH/M1CR、SCF/RTKs兩種信號通路在黑素細胞代謝中起到關鍵作用。而本實驗結果中發現黑白色中藥均有不同程度抑制MC1R與RTKs（酪氨酸激酶受體）蛋白的作用，這與之前研究的基礎推論一致。黑色素增加與減少與MC1R與RTKs兩者關系緊密，呈現一定相關性。

本實驗研究從中醫傳統治驗與臨床皮膚病治療的實踐中最常應用的治法“以黑治白，以白治黑”入手，選擇臨床常用于治療色素障礙性疾病的黑、白兩大類中藥各7種中藥作代表發現了藥材本身的顏色（黑藥、白藥）與藥效之間確實存在一定關系，也印證中藥色象理論的科學性。而中藥顏色與藥效關系的機制之一可能是通過調節α-MSH/M1CR、SCF/RTKs信號通路來影響黑素細胞代謝。

本研究存在不足：①現有資料表示僅有白附子和白僵蠶具有毒性。豚鼠皮膚對藥物刺激反應靈敏，其反應與人類相似，在飼喂豚鼠的過程中，所有藥物的使用劑量對黑色素的合成有抑制作用但并未明顯表現出毒性，若后續用于臨床研究，則需先進行毒性檢測，條件與時間所限本實驗暫時未做藥物的毒性檢查。②本研究只對MC1R以及RTKs蛋白表達做了基礎研究，但是對MC1R的凋亡通路以及RTKs蛋白增殖通路包括SCF/RTKs信號傳導途徑是否有被黑白中藥具體影響還值得深入研究?？梢钥吹降氖乾F有研究黑藥如黃連、紅花等中藥的美白已經初具成效[11-12]，白藥如白及、白附子等中藥美白也在理化研究階段[13-15]，黑白中藥即色象中藥在皮膚美容方面擁有較大的發展潛力。

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[收稿日期]2023-01-09

本文引用格式：楊波濤，賈桂云，陳鯤，等.黑白中藥通過調節MC1R和RTKs的表達對黑色素代謝的影響研究[J].中國美容醫學，2024，33（3）：12-16.