不同采收成熟度對烤煙萜類致香化合物及煙葉品質的影響

宋笑龍 劉芳 宗勝杰 馬浩波 孟智勇 張國平 王宏

摘要： 為探究不同采收成熟度對烤煙萜類致香物質代謝特征的影響，為烤煙適時采收及提高煙葉香氣品質提供理論依據，對各成熟度烤煙鮮煙葉腺毛分泌物（二萜類化合物）、類胡蘿卜素（四萜類化合物）含量與烤后煙葉常規化學成分、香氣成分進行測定，并對萜類物質合成和降解途徑關鍵基因表達量進行檢測；對煙葉外觀質量、感官評吸指標進行評價。結果顯示，隨著采收成熟度的提高，煙葉表面腺毛密度、類胡蘿卜素及其降解產物含量呈降低趨勢；鮮煙葉西柏三烯二醇含量整體呈現先降低后升高的趨勢，而其降解產物含量呈上升趨勢。西柏烷類合成基因 ?CYC-1 ?和 ?CYP71D16 ?的表達量隨著烤煙采收成熟度的提高呈先增加后降低的趨勢，DXR表達量在中部葉中呈降低趨勢，而在上部葉中差異很小。類胡蘿卜素降解途徑的關鍵基因PAL、LOX和合成途徑的關鍵基因PSY在中部葉中呈上調趨勢，而在下部葉中呈下調趨勢。在成熟和完熟時采收，烤后煙葉的顏色、油分、嗅香等指標得分更高，香氣量、濃度更足，外觀質量和評吸質量更佳。綜合來看，中部葉在成熟時采收，上部葉在完熟時采收，煙葉的整體表現更好。

關鍵詞： 烤煙；采收成熟度；西柏烷二萜；類胡蘿卜素；香氣成分

中圖分類號：TS41+1 ?文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）02-0104-08

煙草香氣質量是評價煙葉內在品質的核心內容和重要指標之一，然而隨著降焦工藝的發展，煙氣中香氣成分含量也隨之降低，香氣不足成為影響煙葉工業可用性的問題之一［1］。香氣物質組成和代謝十分復雜，因此很難通過農藝措施來改善煙葉的香氣品質［2］。研究發現，對煙草香氣生成量貢獻最大的3類致香前體物質分別為多酚類化合物、萜烯類化合物及生物堿［3］?？緹熭葡╊愔孪闱绑w物主要有類胡蘿卜素（四萜類化合物）、西柏烷二萜和賴百當類（二萜類化合物），其中賴百當類化合物是香料煙葉中獨有的，多數烤煙品種不含該成分［4-5］。西柏烷二萜主要存在于鮮煙葉中，主要成分是西柏三烯一醇（CBT-ol）和西柏三烯二醇（CBT-diol），對烤后煙葉的吃味具有重要貢獻，同時由于其氣味的特殊性，可作為防御害蟲的壁壘［6-7］；調制后的西柏烷二萜主要降解為茄酮及其衍生物，是烤后煙葉香氣的重要來源之一［8-10］。類胡蘿卜素屬于四萜類化合物，其降解產物二氫獼猴桃內酯、大馬酮、紫羅蘭酮、巨豆三烯酮等是烤煙中性致香物質的重要組成成分，并且香味物質刺激性較小、香氣質量較好，使煙葉能夠產生木香、花香、果香和甜香等特色香氣［11-13］。研究發現，采收成熟度對烤煙香氣質量有顯著影響，不同成熟度煙葉萜類化合物及代謝酶活性差異較大，不同基因型烤煙葉面腺毛形態特征和分泌特性也存在差異［14-16］。

烤煙品種Y2001是中煙100經甲基磺酸乙酯（EMS）誘變，定向選育的高分泌改良品系，與中煙100相比，農藝性狀更優良，腺毛密度高，蔗糖酯、西柏烷二萜化合物等葉面分泌物顯著提高［17］。目前對烤煙不同成熟度腺毛分泌特性及萜類致香物質合成相關酶基因表達方面的研究尚缺乏，本研究以烤煙品系Y2001為研究對象，探討不同采收成熟度對鮮煙葉西柏烷和類胡蘿卜素含量及其降解產物的影響，分析相關合成和降解基因表達量，進而對不同采收成熟度的烤煙品質進行綜合判定，以期為精準把握煙葉采收最佳成熟度，做到最大程度發揮烤煙煙葉特性、提高煙葉綜合品質和工業可用性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年在河南省農業科學院煙草研究所試驗地（34°07′06″N，113°83′09″E）進行，供試烤煙品種為Y2001，按常規措施進行栽培管理。以烤煙上部葉和中部葉為分析材料，根據黃樹永等對煙葉從成熟度的劃分，將成熟度分為欠熟、成熟、完熟和過熟4個等級［18］，詳見表1。

1.2 測定項目和方法

1.2.1 鮮煙葉腺毛觀測 不同成熟度各選取5株煙株，分別取約10 cm中上部鮮煙葉，用0.2%（質量體積比）羅丹明B水溶液染色15 min，用清水去除未結合的羅丹明B并自然晾干，沿著葉片中部主脈兩側1 cm處剪取約1.0 cm×0.3 cm大小的葉片組織，置于超景深顯微鏡下對葉面腺毛形態進行觀察并統計。

1.2.2 烤后煙葉常規化學成分的測定 煙葉烘烤結束后，分別依照YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續流動法》對總糖和還原糖含量、YC/T 161—2002《煙草及煙草制品 總氮的測定 連續流動法》對總氮含量、YC/T 162—2002《煙草及煙草制品 氯的測定 連續流動法》對氯含量、YC/T 173—2003《煙草及煙草制品 鉀的測定 火焰光度法》對鉀含量、YC/T 166—2003《煙草及煙草制品 總蛋白質含量的測定》對蛋白質含量、YC/T 468—2013《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動（硫氰酸鉀）》對煙堿含量、YC/T 216—2007《煙草及煙草制品 淀粉的測定 連續流動法》對淀粉含量進行檢測。

1.2.3 類胡蘿卜素含量的測定 （1）稱取剪碎的新鮮樣品0.1 g左右，放入研缽中，加液氮研磨充分后加95%乙醇溶液，研成均漿，繼續研磨至組織變白。（2）濾紙用乙醇濕潤后置漏斗中，將研磨液過濾到25 mL棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研杵及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。（3）用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入漏斗中。直至濾紙和殘渣中無綠色。最后用95%乙醇溶液定容至25 mL，搖勻。（4）把提取液倒入光徑1 cm的比色杯內。以95％乙醇為空白，在665、649、470 nm波長下測定吸光度，并根據如下公式計算葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）及類胡蘿卜素（Cx）含量（μg/g）：

Ca=13.95D665 nm-6.88D649 nm；

Cb=24.96D649 nm-7.32D665 nm；

Cx=（1 000D470 nm-2.05Ca-114.8Cb）/245。

1.2.4 西柏烷類和烤后煙葉香氣物質含量的測定 取約2.0 g樣品，利用蒸餾萃取裝置，通過水蒸氣蒸餾-乙腈萃取法提取有機相，利用氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）進行定性定量分析。

1.2.5 烤后煙葉外觀和感官評吸質量評價 烤后煙葉出炕后回潮、平衡水分，依據煙草行業標準GB 2635—1992《烤煙》對各處理煙葉成熟度、油分、顏色、身份、結構、色度、含青度、掛灰和雜色等外觀質量指標進行評價，各指標權重分別按照0.3、0.1、0.2、0.1、0.1、0.1、0.05、0.025、0.025賦值，計算烤煙外觀綜合得分。按照9分制對香氣質、香氣量、濃度、雜氣、勁頭、刺激性、余味、燃燒性、灰色等感官評吸指標進行打分，各指標權重依次賦值為0.25、0.15、0.1、0.12、0.1、0.13、0.1、0.025、0.025。

1.2.6 基因表達分析 在中、上部葉不同成熟期，各選取長勢基本一致的煙株5株，取同一部位長 10 cm 左右的葉片，用錫箔紙包裹后置于液氮中速凍，保存于-80 ?℃超低溫冰箱中備用。用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取葉片總RNA；之后用One Step Prime Script RT-PCR Kit成品試劑盒進行qRT-PCR分析。根據GenBank發布的煙草西柏烷生物合成關鍵基因DXR（5-磷酸脫氧木酮糖還原異構酶）、 ?CYC-1 ?（西柏三烯一醇合成酶基因）和 ?CYP71D16 ?（西柏三烯二醇合成酶基因），類胡蘿卜素合成基因：PSY（八氫番茄紅素合成酶）、PDS（八氫番茄紅素脫氫酶），胡蘿卜素降解途徑關鍵基因：PAL（苯丙氨酸解氨酶）、LOX（脂肪氧化酶），以 ?L25 ?作為內參基因［19］，設計各基因擴增引物（表2），具體按照試劑盒說明書進行。熒光定量PCR反應程序：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，按照2-ΔΔCT對結果進行分析，用Excel軟件分析作圖。

2 結果與分析

2.1 不同采收成熟度對烤煙腺毛密度的影響

如圖1、圖2所示，考煙上部葉腺毛分布與中部葉相似，不同成熟度烤煙鮮煙葉腺毛密度分布表現均為正面少于背面。隨著成熟度的增加，烤煙葉片顏色由綠色逐漸變為黃色，海綿組織逐漸變薄，葉片厚度變薄，長柄腺毛和短柄腺毛不同程度脫落，均以過熟葉腺毛密度最低。

2.2 不同采收成熟度對鮮煙葉萜類化合物的影響

由表3可知，隨著采收成熟度提高，各葉位鮮煙葉西柏三烯二醇含量整體呈現先降低后升高的趨勢，而類胡蘿卜素呈逐漸降低的趨勢，以欠熟煙葉類胡蘿卜素含量最高。上部葉中α-西柏三烯二醇以過熟葉中含量最高，β-西柏三烯二醇以完熟葉中含量最高，總西柏三烯二醇含量以過熟煙葉中含量最高；中部葉中α-西柏三烯二醇和總西柏三烯二醇含量均以完熟葉最高，β-西柏三烯二醇含量在過熟葉中最高。

2.3 不同采收成熟度烤煙鮮煙葉萜類相關基因表達

不同采收成熟度烤煙煙葉致香物質合成和降解途徑相關基因表達量如圖3、圖4所示，DXR、 ?CYP71D16 和CYC-1 ?共同參與調控西柏烷類化合物的合成，烤煙中部葉 ?CYC-1和CYP71D16 ?基因表達量隨著采收成熟度的提高呈先增加后降低的趨勢，分別在完熟、成熟時達到最高峰；DXR表達量呈降低趨勢。類胡蘿卜素合成基因PSY和降解途徑關鍵基因PAL、LOX表達量整體呈上調趨勢，在過熟時表達量達到最大值，且顯著高于其他處理；PDS?表達量呈降低趨勢，其中成熟煙葉的表達量顯著低于其他處理。

上部葉 ?CYC-1和CYP71D16 ?基因表達量的變化趨勢與中部葉相似，呈現先上調后下調的趨勢，均在成熟時期達到最大值，且顯著高于其他處理；DXR表達量的變化不大，各處理差異不顯著。PAL和LOX基因表達量整體呈下調趨勢，與中部葉相反；PSY、PDS表達量在欠熟至成熟階段表達量有所升高，在成熟階段達到最大值，之后隨著成熟度提高而顯著降低。

2.4 不同采收成熟度對烤后煙葉常規化學成分的影響

由表4可知，采收成熟度顯著影響烤后煙葉的內在化學成分。隨著采收成熟度增加，上部葉烤后煙葉總糖、蛋白質、氯、淀粉含量和糖堿比整體呈降低趨勢；總氮、鉀含量呈先升高后降低的趨勢，均以成熟期含量最高；欠熟采收則表現為上部葉總糖、蛋白質、淀粉含量偏高，完熟和過熟采收總氮含量偏低，導致氮堿比偏低；過熟采收時，煙葉鉀含量偏低。中部葉烤后，煙葉總糖、蛋白質和淀粉含量呈降低趨勢，氯含量差異較??；總氮、鉀、蛋白質含量和氮堿比隨著采收成熟度的增加而整體降低；煙堿含量整體低于上部葉，氮堿比偏低。上部葉、中部葉淀粉含量整體偏高，總氮含量偏低，適當推遲采收，有利于其含量降低，上部葉完熟采收、中部葉成熟采收時，烤后煙葉中的主要化學成分更協調。

2.5 不同采收成熟度對烤后煙葉外觀質量的影響

由表5可知，不同采收成熟度對煙葉外觀質量的影響較大。相比欠熟采收，成熟至過熟階段采收，煙葉葉片結構疏松度更好；與欠熟采收相比，正常采收、推遲采收烤煙煙葉的成熟度得分更高，身份適中，油分更足，色度更好，含青減少。上部葉完熟和過熟時采收與欠熟、成熟時采收相比，掛灰雜色明顯增加，煙葉整體得分排名為B3>B2>B4>B1，但成熟和完熟時采收，烤后煙葉外觀得分差異不大。中部葉成熟和完熟采收時，煙葉各外觀質量指標均優于欠熟和過熟時采收，得分排名為C2>C3>C4>C1。

2.6 不同采收成熟度對烤后煙葉香氣含量的影響

由表6可知，不同采收成熟度烤煙香氣物質及其前體物存在明顯區別。隨著采收時間的推遲，上部葉類胡蘿卜素降解產物如巨豆三烯酮、大馬酮、3-羥基-2-丁酮、香葉基丙酮等含量整體呈下降趨勢，多數致香成分沒有明顯變化， 總體來看，上部葉類胡蘿卜素降解產物總量整體呈現降低趨勢；西柏烷類降解產物茄酮整體呈現上升趨勢，丁內酯含量隨著成熟度的增加有所降低，但變化幅度不大；上部葉香氣物質含量排名為B4>B2>B3>B1。中部葉不同成熟度煙葉西柏烷類降解產物整體變化趨勢與上部葉相似， 整體呈上升趨勢，類胡蘿卜素呈先上升后降低趨勢。香氣物質含量排名為C2>C3> C4>C1。不同葉位同一成熟度，煙葉致香成分含量存在差異，上部葉香氣物質含量整體高于中部葉。

2.7 不同采收成熟度對烤后煙葉評吸質量的影響

由表7可知，隨著采收成熟度的提高，中部葉、上部葉烤后煙葉香氣質、香氣量、濃度、余味、雜氣、刺激性得分均呈先增加后降低的趨勢；上部葉成熟煙葉在香氣質、勁頭和燃燒性方面得分最高；完熟和過熟葉在香氣質方面欠佳。中部完熟煙葉在香氣量、濃度、余味、雜氣、刺激性和勁頭方面的得分均為最高，過熟煙葉的香氣質最好，而香氣量不足。上部葉各處理綜合得分排名均為B2>B3>B1>B4，中部葉各處理綜合得分排名均為C3>C2>C4>C1。

3 討論與結論

不同采收成熟度對烤煙香氣物質及前體物會產生一定影響，準確把握煙葉采收成熟度對提高烤煙產質量及提升烤后煙葉工業可用性有重要意義。本試驗結果顯示，衰老會導致煙葉表皮腺毛脫落，隨著采收成熟度的提高，鮮煙葉表面腺毛密度、類胡蘿卜素含量呈現降低的趨勢，上部葉西柏三烯二醇含量以過熟煙葉最高，而中部葉以完熟葉最高。曾祥難的研究顯示，成熟葉類胡蘿卜素降解產物含量高于過熟和欠熟煙葉［20］；趙銘欽等對煙葉成熟度與香氣質量的研究顯示，烤煙香氣成分含量隨成熟度的提高而增加，最大出現在過熟階段［14］；宣曉泉等認為，香氣成分總量隨成熟度提高而持續增加，最大值出現在完熟階段，之后含量緩慢下降［21］；文利超等研究認為，隨著煙葉成熟衰老，類胡蘿卜素合成減弱而降解增強，類蘿卜素降解基因部分呈下調表達，部分呈上調表達，合成相關基因多數呈下調表達［22］，與本研究烤煙中部煙葉表現一致。但上部 葉與中部葉PAL、LOX和PSY基因表達量存在一定差異，可能是由于不同葉位采收成熟標準不同導致。

成熟度與烤后煙葉的外觀質量、評吸質量及香氣質量等方面密切相關［9，23-24］。適熟采收初烤煙葉產質量最高、內在化學成分最協調、感官評吸質量最好，低成熟度（欠熟）煙葉采烤的烤后煙葉化學成分不協調，評吸質量表現為香氣質差、香氣量不足，刺激性明顯，青雜氣略重。采收時西柏烷類致香前體物質含量高，并不能決定其對烤后煙葉香氣貢獻大［25］，因此本研究中西柏烷二萜前體物含量與烤后煙葉中西柏烷降解產物不是完全對應的關系。另外，煙葉香氣成分除了萜烯類化合物，還有其他成分如苯丙氨酸降解產物、棕色化反應產物等，尤其是質體色素降解產物新植二烯，其成分含量所占比重較高［26-27］，由此看來，西柏烷和類胡蘿卜素降解產物含量高的處理，感官評吸指標香氣質量得分不一定最高。綜合看來，中部葉成熟采收，上部葉完熟采收，煙葉外觀質量和感官評吸更佳，化學成分更協調，煙葉整體表現更好。

參考文獻：

［1］ 申培林，楊鐵釗，張小全，等. 煙草類萜生物合成途徑中關鍵酶基因的克隆與表達調控［J］. 江蘇農業科學，2012，40（1）：37-40.

［2］葉賢文，謝學云，孟韋名，等. 采收成熟度對烤煙致香物質和感官質量的影響［J］. 昆明學院學報，2019，41（3）：15-19.

［3］景延秋，宮長榮，張月華，等. 煙草香味物質分析研究進展［J］. 中國煙草科學，2005，26（2）：137-139.

［4］朱顯靈，潘文杰，陳 懿，等. 不同品種烤煙鮮葉表面提取物的主要成分分析［J］. 中國煙草科學，2011，32（3）：51-56.

［5］陰耕云，徐世濤，阮 昕，等. 復烤過程中B4F烤煙煙葉類胡蘿卜素和西柏烷類降解產物的變化［J］. 煙草科技，2012（10）：61-64.

［6］劉國順，周世民，高致明，等. 香料煙腺毛的形態發生和分泌活動研究［J］. 中國煙草科學，2010，31（1）：22-27.

［7］汪裕強. 煙草腺毛發育相關基因U-box的克?。跩］. 生物化工，2018，4（2）：17-21.

［8］王 冬，張小全，楊鐵釗，等. 類西柏烷二萜代謝機理及調控研究進展［J］. 中國煙草學報，2014，20（3）：113-118.

［9］謝新喬，戴 勛，王 毅，等. 有機初烤煙葉中性致香物質特征分析［J］. 作物雜志，2013（2）：70-74.

［10］ 曹建敏，別 瑞，王玉華，等. 烤煙新品種中煙特香301特征香氣物質研究［J］. 中國煙草科學，2022，43（2）：64-70.

［11］杜叢中，宋 晶，王生才，等. 郴州地區不同品種烤煙煙葉質體色素及其降解致香物質含量差異研究［J］. 中國農學通報，2012，28（21）：260-263.

［12］邵蘭軍，謝 晉，左安建，等. 烤后煙葉類胡蘿卜素的穩定性及其影響因素［J］. 煙草科技，2015，48（7）：9-13.

［13］魏春陽，蔡憲杰，王信民，等. 不同種植區烤煙煙葉類胡蘿卜素與外觀質量指標分值的關系［J］. 中國煙草學報，2010，16（1）：42-49.

［14］趙銘欽，張 迪，趙進恒，等. 種植密度對烤煙質體色素及其降解產物的影響［J］. 江蘇農業學報，2010，26（4）：711-715.

［15］袁衛瑜，王興德，李軍營，等. 烤煙生長過程中多酚類物質及其相關酶活性的變化［J］. 西南農業學報，2017，30（7）：1528-1532.

［16］李艷華，張洪映，魏躍偉，等. 典型烤煙品種腺毛形態及分泌特性比較分析［J］. 中國煙草學報，2017，23（2）：84-91.

［17］王召軍， 李雪君， 楊永鋒， 等. 烤煙'中煙100'高分泌型改良品系'Y2001'創制及性狀分析［EB/OL］. （2022-9-17）［2023-02-02］.https：//kns.cnki.net/kcms2/article/abstract？v=rNedIcCUbLBlD1Kb7Z9QBqq8UnmKWTmNLqH1nGKYSX0-VCR tIgU0Cf8jaNIqVorxpCA2hUIjOxObUSU6tBl7OuHJJ5Lljd2DKc4ZxS EvFKXJ8Yy95C_8A==&uniplatform=NZKPT.

［18］黃樹永，付 祺，郭 偉，等. 不同成熟度烤煙質體色素的降解轉化差異及其與品質的關系［J］. 中國農學通報，2013，29（3）：203-208.

［19］王 燃，許亞龍，李澤鋒，等. 基于芯片數據的煙草qRT-PCR內參基因鑒定與驗證［J］. 煙草科技，2015，48（2）：1-6.

［20］曾祥難. 不同成熟度采收對烤煙香氣物質及前體物的影響［J］. 天津農業科學，2013，19（12）：59-62.

［21］宣曉泉，薄云川，徐如彥，等. 不同成熟度煙葉中香味成分分析［J］. 中國農學通報，2007，23（2）：98-102.

［22］文利超，吳鳳燕，李 偉，等. 煙葉衰老過程中類胡蘿卜素代謝及相關基因表達分析［J］. 中國煙草科學，2019，40（4）：62-68.

［23］陳 頤，魯康興，周 彬，等. 施氮量和留葉數互作對紅大鮮煙葉素質及產量的影響［J］. 江蘇農業科學，2018，46（19）：80-84.

［24］楊 洋，符云鵬，劉新源，等. 豫西煙區上部葉成熟度與品質形成的關系［J］. 江蘇農業科學，2023，51（8）：79-85.

［25］ 王 晶，趙宸楠，王霄龍，等. 云南K326和云87成熟過程中主要葉面分泌物的研究［J］. 江西農業學報，2013，25（6）：70-72.

［26］周芳芳，楊學書，楊 策，等. 云南3個主栽烤煙品種致香物質含量差異及區域特征分析［J］. 江西農業學報，2021，33（10）：80-86.

［27］王 冬，趙銘欽，王 淼，等. 典型濃香型產區不同生態條件對烤煙化學成分和香氣物質含量的影響［J］. 河南農業科學，2011，40（1）：69-73.

收 稿日期：2023-04-04

基金項目：河南省農業科學院自主創新項目（編號：2022ZC19）。

作者簡介：宋笑龍（1993—），女，河南洛陽人，碩士，研究實習員，主要從事煙葉調制加工研究。E-mail：292212139@qq.com。

通信作者：王 宏，農藝師，主要從事煙葉生產和煙基建設工作。E-mail：275014264@qq.com。