1株牛源屎腸球菌的分離鑒定及其益生特性

鐘舒紅 彭紅艷 李軍 石艷 白慧麗 李常挺 馬春霞 吳翠蘭 蘭美益 彭昊

摘要： 利用形態學觀察、生理生化試驗與分子生物學方法對分離自牛瘤胃內容物的1株腸球菌GXNN20210320-4進行分類學鑒定，并通過生長性能測定，動物安全性試驗、耐受性試驗及體外抑菌試驗等評價該菌的益生特性，旨在為進一步研究該菌株及開發成益生菌制劑提供一定的前期基礎。結果顯示，腸球菌GXNN20210320-4為屎腸球菌，該菌從4 h開始進入對數增長期并持續至14 h，生長繁殖速度較快，生長周期短，適合工業化生產。小鼠安全性試驗顯示，屎腸球菌GXNN20210320-4不是致病性微生物，對于動物可能是安全的。在模擬人工胃液（pH值=3.0）和模擬人工腸液（pH值= 6.8）中孵育3 h后屎腸球菌GXNN20210320-4存活率分別為76.85%、80.26%，在0.3%膽鹽濃度下孵育1、3 h的存活率分別為83.15%、70.74%，在0.5%膽鹽濃度下孵育1、3 h的存活率分別為57.97%、46.78%，說明屎腸球菌GXNN20210320-4具有較好的耐酸耐膽鹽能力，該菌株能夠經受胃腸道消化液的抑制而發揮作用。屎腸球菌GXNN20210320-4在60 ℃水浴中孵育15 min后仍有82.35%的菌株存活率，80 ℃水浴中孵育 15 min 后活菌數為0，表明屎腸球菌GXNN20210320-4可耐受60 ℃高溫，而不能長時間耐受80 ℃的高溫。體外抑菌試驗顯示，屎腸球菌GXNN20210320-4對鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制能力，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最好。綜上所述，本研究中的牛源屎腸球菌GXNN20210320-4生長性能良好，對動物無致病性，具有良好的益生特性和抑菌作用，可作為益生菌株進一步開發和應用。

關鍵詞： 屎腸球菌；分離鑒定；益生特性；抑菌作用；益生菌

中圖分類號：S182 ?文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）02-0198-07

長期以來，抗生素添加劑在畜禽生產中發揮著積極的促進作用，然而，長期將抗生素作為生長促進劑添加在飼料中所導致的耐藥病原體和藥物殘留嚴重威脅著公共衛生健康［1］。我國農業農村部194號公告宣布自2020年1月1日起，全面禁止在飼料中添加抗生素。在“禁抗”“替抗”的大環境下，益生菌作為抗生素潛在替代產品成為人們研究的熱點［2-3］。益生菌是一類服用一定量后能夠定殖在宿主腸道并對機體健康產生益生作用的活性微生物，因其具有抗腫瘤、抗過敏、抑制細菌生長和增強機體免疫等作用，廣泛應用于飼料、醫藥保健和食品等領域［4］。乳酸菌是定殖于動物腸道中的一種重要生理菌群，因其具有調整機體腸道菌群平衡、調節機體代謝、提高機體免疫力和動物生產力等益生功能，廣泛應用于畜、禽和水產養殖生產中［5-6］。腸球菌作為乳酸菌的一種，其生長性能好、抗逆性強、能產有機酸、細菌素等抑菌物質，具有促進動物生長、調節機體胃腸道菌群平衡、維持微生態穩定、提高機體免疫等益生作用，常被用作飼料添加劑［7-8］。屎腸球菌作為腸球菌的一種，被列入我國《飼料添加劑品種目錄（2023）》。同時，歐盟（EU）發布的2015/1053號法規，批準屎腸球菌DSM 10663/NCIMB 10415作為母牛繁殖、保育仔豬和肉雞育肥、火雞育肥、貓和狗的飼料添加劑使用，屎腸球菌作為飼料添加劑在畜禽生產中有著廣闊的應用市場［9］。因此，本研究利用傳統的形態學觀察、生理生化試驗與現代分子生物學相結合的方法，從牛瘤胃內容物中分離鑒定得到1株屎腸球菌GXNN20210320-4，并進一步對其生長特性、動物安全性、人工胃腸液耐受性、膽鹽耐受性、高溫耐受性及體外抑菌活性等益生特性進行測定，旨在為牛源屎腸球菌益生菌制劑的研發提供基礎候選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 牛瘤胃內容物于2021年3月采自廣西南寧某養牛場。

1.1.2 供試菌株 用于體外抑菌試驗的大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），均由廣西獸醫研究所細菌室保存。

1.1.3 供試動物 雄性8周齡健康C57 BL/6J小鼠［體質量（18±2） g］，購自長沙市天勤生物技術有限公司。

1.1.4 主要試劑 本研究中用到的主要試劑詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 益生菌的分離培養 牛瘤胃內容物和滅菌生理鹽水按1 ∶ 9混懸，上清液倍比稀釋，接種環蘸取適量稀釋液劃線于MRS固體培養基上，37 ℃恒溫培養24 h。接種環挑取單個長勢較好的菌落繼續劃線接種MRS固體培養基，37 ℃恒溫培養24 h，直至分離到形態一致的單個菌落，革蘭氏染色并觀察其染色結果和形態特征。同時，接種環挑取單個菌落接種MRS液體培養基，37 ℃ 200 r/min恒溫培養24 h，連續活化3代，4 ℃保存備用。益生菌的分離培養在廣西獸醫研究所細菌研究室進行，后續益生菌益生性能的測定均相同。

1.2.2 分離菌的生化鑒定 根據《伯杰氏系統細菌學手冊（第二版）》腸球菌生理生化鑒定試驗，采用細菌微量生化鑒定管對分離菌株進行生理生化鑒定。

1.2.3 16S rRNA基因序列的測定 提取分離菌株DNA，采用通用引物27F（5′- A?G?A?G?T?T?T?G?A?T?C?M?T?G?G?C?T?C?A?G -3′）、1492R（5′- T?A?C?G?G?Y?T?A?C?C?T?T?G?T?T?A?C?G?A?C?T?T -3′）進行PCR擴增，預期擴增產物長度為 1 500 bp。擴增體系為25.0 μL，包括Taq mix 12.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O補至25.0 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環；72 ℃延伸10 min。擴增結束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。PCR 產物條帶大小符合預期，送蘇州金唯智生物科技有限公司進行16S rRNA測序鑒定，測序結果通過NCBI中的BLAST進行同源性分析。

1.2.4 分離菌生長曲線測定 將分離菌種子液按2%的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃、200 r/min 恒溫培養，并以MRS液體培養基為空白對照，每隔2 h測定菌懸液吸光度D600 nm，繪制菌株生長曲線。

1.2.5 動物安全性試驗 10只8周齡健康C57 BL/6J小鼠隨機分成2組，5只/組，分別為試驗組（E），空白對照組（C）。E組灌服濃度為1×109 CFU/mL 的分離菌混懸液，C組灌服滅菌生理鹽水，0.2 mL/只，連續7 d。記錄試驗期間2組小鼠的精神狀況，采食、飲水、運動及被毛生長情況。

1.2.6 模擬人工胃、腸液耐受試驗 參照丁詩瑤等的方法配制模擬人工胃液：稀HCl 16.4 mL，H2O 900 mL，胃蛋白酶10 g，均勻混合后蒸餾水定容至 1 000 mL，調節pH值=3.0，過0.22 μm濾膜除菌，4 ℃保存備用［10-11］。

根據《中國人民共和國藥典（2015）》配制模擬人工腸液：KH2PO4 6.8 g，H2O 500 mL使之溶解，NaOH調節pH值=6.8，按10 g/L濃度加入胰蛋白酶，使之溶解，過0.22 μm濾膜除菌，4 ?℃保存備用［12］。

菌懸液按10%接種量分別接種至配制好的模擬胃、腸液中，混合均勻，于37 ℃水浴鍋中分別孵育0、3 h后，平板計數法分別計數0、3 h混懸液中屎腸球菌活菌數，每個試驗重復3次，求平均值。以菌株存活率評估屎腸球菌對模擬人工胃、腸液的耐受能力，菌株存活率計算公式如下：存活率=lg（3 h 活菌數）/lg（0 h活菌數）×100%。后續試驗中屎腸球菌存活率的測定方法均相同。

1.2.7 膽鹽耐受試驗 參照寧豫昌等的方法在MRS液體培養基中分別加入質量分數為0、0.3%和0.5%的豬膽鹽，將上述含不同濃度豬膽鹽的MRS液體培養基于121 ℃條件下滅菌15 min，冷卻備用。菌懸液按10%接種量分別接種于不同濃度豬膽鹽的MRS液體培養基中，以不加豬膽鹽的培養基為對照，37 ℃培養0、1、3 h后，平板計數法分別計數各濃度各時間段菌懸液中屎腸球菌活菌數和存活率［13］。

1.2.8 高溫耐受試驗 參照翟夢凱的方法測定屎腸球菌耐高溫能力，即提前將水浴鍋溫度分別調至37、50、60、80 ℃，菌懸液按10%接種量接種至滅菌生理鹽水后靜置于以上不同水浴中孵育 15 min，以37 ℃作對照，平板計數法分別測定不同溫度下菌懸液中屎腸球菌的活菌數和存活率［9］。

1.2.9 體外抑菌試驗 參照鐘舒紅等的方法用牛津杯測定屎腸球菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的體外抑菌能力，即將滅菌牛津杯分別放置于涂有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的LB固體培養基上，每個牛津杯中滴加150 μL屎腸球菌菌懸液，37 ℃恒溫培養24 h，測定抑菌圈直徑（mm），以抑菌圈直徑大小評估屎腸球菌對致病菌的體外抑菌能力［14］。

2 結果與分析

2.1 細菌分離純化和形態學觀察

由圖1-A可知，分離菌在MRS瓊脂平板上菌落凸起呈圓形、表面光滑、邊緣整齊的灰白菌落，直徑為0.5～1.0 mm。由圖1-B可知，革蘭氏染色鏡檢呈單個、成對或短鏈狀排列，是無芽孢、無莢膜的革蘭氏陽性球菌。

2.2 分離菌鑒定結果

由表2可知，分離菌生理生化試驗結果顯示，七葉苷試驗、甘露醇產酸、精氨酸水解酶、馬尿酸鈉水解均呈陽性，觸酶試驗、運動性和V-P測定及山梨醇產酸為陰性，能在6.5% NaCl中生長，可發酵糖類，結果符合腸球菌生化標準。結合菌株形態與革蘭氏染色結果，可初步鑒定該分離菌株為腸球菌，命名為GXNN20210320-4。

2.3 16S rRNA分子鑒定及序列分析結果

由圖2可知，分離菌PCR擴增產物經凝膠電泳檢測在1 000～2 000 bp 間出現1 500 bp的預期目的條帶。將PCR產物測序序列經BLAST比對，發現與NCBI基因庫中已收錄的屎腸球菌基因組序列相似度最高，并利用Megalign進行同源性比較。由圖 ?3 可知，GXNN20210320-4（GenBank 登錄號MZ452349.1）菌株與基因庫中已收錄的11株屎腸球菌基因序列相似度高達99%以上，由此判定分離菌株GXNN20210320-4為屎腸球菌。隨后利用MEGA 7.0 軟件繪制系統發育進化樹，由圖4可知，MZ452349.1菌株與E.faecium GXNN20201226-1（MZ4523347.1）、E.faecium BHN-LAB 106（MN533909.1）親緣關系較近。

2.4 生長曲線測定結果

屎腸球菌GXNN20210320-4的生長曲線，由圖5可知，從4 h開始進入對數增長期，并持續至14 h，14～18 h進入穩定期， 18 h后進入衰亡期。本研究中分離鑒定的屎腸球菌生長繁殖速度較快，生長周期較短，適合工業化生產，是其作為益生菌制劑的一個很大的優勢，為其作為飼料添加劑奠定了基礎。

2.5 動物安全性試驗結果

本研究試驗觀察期間，灌服屎腸球菌GXNN20210320-4的陽性對照組小鼠與灌服生理鹽水的空白對照組均無死亡情況，2組小鼠一般的體態特征如呼吸、運動、行為、皮毛光澤、精神狀態無明顯差異。 結果表明，屎腸球菌GXNN20210320-4 不具有致病性，對動物可能是安全的，但為了充分保證分離 菌株屎腸球菌 GXNN20210320-4在臨床使用上的安全性，下一步需進行動物的亞急性毒性試驗和慢性毒性試驗。

2.6 屎腸球菌耐受模擬人工胃、腸液能力測定結果

由表3可知，屎腸球菌GXNN20210320-4分別在模擬人工胃液（pH值3.0）和模擬人工腸液（pH值6.8）中孵育3 h后，存活率分別為76.85%、80.26%，說明屎腸球菌GXNN20210320-4無論對模擬人工胃液還是模擬人工腸液，均具有較好的耐受能力，該菌株能夠經受胃腸道消化液的抑制而發揮作用。

2.7 屎腸球菌耐膽鹽能力的測定結果

由表4可知，屎腸球菌GXNN20210320-4在膽鹽濃度為0.3%情況下分別孵育1、3 h的存活率分別為83.15%、70.74%；隨著膽鹽濃度由0.3%提高至0.5%，屎腸球菌GXNN20210320-4存活率分別下降至57.97%、46.78%。說明膽鹽可降低屎腸球菌GXNN20210320-4的存活率，膽鹽濃度越高影響越大，但同時也說明，屎腸球菌GXNN20210320-4對0.3%膽鹽具有較好的抵抗能力。

2.8 屎腸球菌耐高溫能力的測定結果

由表5可知，在不同高溫條件下處理15 min后，以37 ℃為對照，屎腸球菌GXNN20210320-4在50～80 ℃條件下，存活率由103.10%下降至0，但在60 ℃中處理15 min仍有82.35%的存活率，說明屎腸球菌GXNN20210320-4能在60 ℃環境下生長，而不能長時間耐受80 ℃的高溫。

2.9 屎腸球菌對致病菌的體外抑菌能力測定結果

由表6可知，屎腸球菌GXNN20210320-4對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為13.13、17.17、12.06 mm。結果表明，屎腸球菌GXNN20210320-4對鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制能力，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最好。

3 討論與結論

本研究從牛瘤胃內容物中分離到的分離菌株GXNN20210320-4菌落凸起呈圓形、革蘭氏染色呈單個、成對或短鏈狀排列的G+球菌。其抗逆性較好，能在6.5% NaCl中生長，七葉苷試驗、甘露醇產酸、精氨酸水解酶、馬尿酸鈉水解均呈陽性，觸酶試驗、運動性和V-P測定及山梨醇產酸陰性，可發酵糖類等主要生物學表型符合腸球菌屬特征。且分離菌GXNN20210320-4 16S rRNA測序結果與NCBI基因庫中收錄的屎腸球菌基因序列相似度高達99%以上，結合形態學鑒定、生理生化試驗和16S rRNA序列分析可判定GXNN20210320-4為屎腸球菌。

對分離菌株進行安全性評估，是篩選分離菌株作為益生菌或者微生態制劑基礎候選菌株的前提，而動物急性口服毒性試驗是作為細菌安全性評估的基本試驗［15］。本研究連續7 d灌服屎腸球菌GXNN20210320-4（1×109 CFU/mL）的陽性對照組小鼠與灌服生理鹽水的空白對照組小鼠在觀察期間，其一般的體態特征、運動、飲食飲水也未發生明顯變化，表明屎腸球菌GXNN20210320-4無致病性，對動物可能是安全的，但為充分保證屎腸球菌GXNN20210320-4在臨床使用上的安全性，下一步需進行動物亞急性毒性試驗和慢性毒性試驗，這結果與王朝等的試驗研究結果［16］一致。

理想的益生菌或微生態制劑生產用菌株不但應具有較好的生理功能還應具備良好的抗逆性，這不僅可滿足菌株在工業生產過程中需要大規模傳代復制的要求，也同時能保證菌株更容易在體內胃腸道中存活及定殖，特別是抵抗消化道中胃酸和膽鹽的侵襲［17］。體外試驗在益生菌的益生特性評判中，由于其準確性高、易于操作等優點，往往作為實驗室篩選優良菌株的基礎工作。本研究分離鑒定的屎腸球菌GXNN20210320-4從4 h開始進入對數增長期，并持續到14 h，14～18 h進入穩定期，說明該屎腸球菌生長繁殖速度較快，適合工業化生產，是其作為益生菌制劑的一個優勢。

動物胃腸道內環境復雜，胃腸道中低pH值、高膽鹽環境能抑制微生物的生長，潛在的益生菌應具有較強的耐酸、耐膽鹽能力，還需要在腸道定殖并達到一定的濃度后才能發揮益生作用［18-19］。屎腸球菌作為動物腸道的一種常見兼性厭氧型乳酸菌，腸道黏附能力和抗逆性較強［20］，而乳酸菌在代謝過程中本身能產乳酸，對低pH值環境適應性強，一般均可抵抗較低pH值的環境［21］。而在動物十二指腸中，從肝臟中分泌出具有抑菌活性的膽鹽對細胞膜具有很強的破壞力，它的疏水作用可導致細胞膜破裂和膜蛋白離解［22-23］，而小腸中的膽鹽濃度一般為0.03%～0.30%［24］，所以益生菌要在腸道中黏附和定殖，不僅需要承受低pH值環境，還需要能夠耐受高滲透壓的膽鹽環境。徐淑琴等研究中藏羊源屎腸球菌EF1-mh最低能耐受pH值=2.0的酸性環境，在0.3%的膽鹽濃度下培養8 h后活菌數仍有100 CFU/mL［25］。

沈中艷等研究顯示，豬源屎腸球菌在pH值=3.0的合成胃液中可存活3 h，在pH值=1.5的合成胃液中可存活3 min，而最高耐膽鹽濃度為3.0%［26］。Zaghloul等的研究顯示，海洋源屎腸球菌EA9在pH值=3的條件下孵育4 h的存活率為83%，在0.1%、0.3%的膽鹽濃度中持續培養24 h后的存活率分別為79.7%、60.0%［27］。因此，屎腸球菌可通過胃存活下來的可能性較大，具有良好的耐酸性，耐膽鹽能力，從而順利進入腸道定殖發揮益生作用。本研究中，屎腸球菌GXNN20210320-4 分別在模擬胃液（pH值3.0） 和模擬腸液（pH值6.8） 中孵育3 h后， 存活率分別為76.85%、80.26%，其菌落形成單位活菌數從 108 CFU/mL降至106 CFU/mL， 說明本研究中的屎腸球菌GXNN20210320-4無論對模擬人工胃液還是模擬人工腸液，均具有較好的耐受能力，該菌株能夠經受胃腸道消化液的抑制而發揮作用，而在膽鹽濃度為0.3%情況下分別孵育1、3 h，存活率分別為83.15%、70.74%，其菌落形成單位活菌數從108 CFU/mL分別降至106 CFU/mL和105 CFU/mL，表明屎腸球菌GXNN20210320-4對0.3%膽鹽具有較好的抵抗能力。駱海龍等對細菌適應膽鹽脅迫的機制進行綜述，認為細菌可通過形成生物膜、修復受損的蛋白質、調整能量代謝途徑與方式、修復與維持細胞膜完整性，利用特定的泵出系統將進入細菌細胞內的膽鹽成分排至胞外等產生對膽鹽的抵抗能力［28］。

商品化的益生菌在生產、運輸過程中可能會面臨特殊的環境，如溫度變化等。作為飼用微生態制劑時，飼料制粒過程中的高溫對細菌的活菌數影響也很大，所以菌株的耐熱能力也需要被考慮。蔡爽等在5株豬源屎腸球菌對溫度的耐受性試驗研究中指出，不同屎腸球菌菌株對溫度的耐受具有差異性，經過60 ℃熱處理10 min后，5株菌株均可穩定的存在，經過80 ℃熱處理10 min后， 只有1株菌株穩定存在［29］。本試驗中屎腸球菌GXNN20210320-4 在60 ℃水浴中孵育15 min后仍有82.35%的菌株存活率，80 ℃水浴中孵育15 min后活菌數為0，說明屎腸球菌GXNN20210320-4可耐受60 ℃高溫，而不能長時間耐受80 ℃的高溫，在后期的益生菌制劑開發過程中可采用真空冷凍干燥或者膠囊包被技術可以提高活菌數。

屎腸球菌在生長過程中能產有機酸、細菌素等特殊物質，這些物質具有抑制其他細菌生長、繁殖的能力［30］。本研究利用牛津杯法測定屎腸球菌GXNN20210320-4對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為12.06、13.13、17.17 mm，表明屎腸球菌GXNN20210320-4對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制能力。其結果與王朝等的研究結果［16，26］一致。

綜上所述，本研究從牛瘤胃內容物中分離鑒定出1株益生性能良好的牛源屎腸球菌GXNN20210320-4，其生長性能良好，對動物無致病性，具有良好的益生特性和抑菌作用，可作為益生菌株進一步開發和應用。

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收 稿日期：2023-03-22

基金項目：廣西重點研發計劃（編號：AB21238003）；南寧市重點研發計劃（編號：20212023）；廣西基本科研業務費（編號：桂科專項 21-6）。

作者簡介：鐘舒紅（1986—），女，廣西臨桂人，碩士，高級獸醫師，主要從事動物疫病防控和病原分子生物學研究，E-mail：zhongshuhong11@163.com；共同第一作者：彭紅艷（1994—），女，青海西寧人，碩士研究生，主要從事獸醫藥理與病理學方面的研究，E-mail：2018393040@st.gxu.edu.cn。

通信作者：彭 昊，博士，高級獸醫師，主要從事動物疫病防控與病原分子生物學研究。E-mail：hpeng2006@163.com。