半夏輪作土壤叢枝菌根真菌多樣性與環境因子相關性研究

張翔宇 陳曉芳 柳敏 成忠均 李恒謙 查欽

摘要： 解析不同輪作年限半夏土壤叢枝菌根真菌群落多樣性與環境因子的相關性，為利用土壤環境因子調控AMF組成與豐度，提高半夏栽培效益提供參考。采用不同年限輪作半夏種植土壤為材料，通過高通量測序和生物信息學分析土壤叢枝菌根真菌群落多樣性，并結合環境因子進行相關性分析。結果表明，AMF的多樣性和豐度均隨著輪作時間的延長而增加，5個樣地的15個土壤樣品中共注釋到了12個科、14個屬、63個種的AMF類群，球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）為優勢類群，占總序列數的91.65%；在優勢菌群中，球囊霉屬的相對豐度與ACP活性極顯著負相關，與TK含量顯著負相關，近明囊霉屬的相對豐度與OM含量顯著負相關，與TK含量、CAT活性、PPO活性顯著或極顯著正相關；非優勢菌群中，未分類的球囊霉門的相對豐度與URE活性極顯著正相關，與pH值極顯著負相關，多孢囊霉屬（Diversispora） 的相對豐度與pH值極顯著正相關，與AN含量極顯著負相關；不同菌群與土壤理化性質和酶活性的關聯性差異較大，不同輪作年限土壤環境因子對半夏土壤中AMF群落組成和多樣性影響較大。

關鍵詞： 半夏；輪作；叢枝根真菌；環境因子；多樣性；相關性

中圖分類號：S567.23+9.01；S182 ?文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）02-0213-08

中藥材半夏［Pinellia ternate（Thunb.）Breit.］具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效［1］。半夏在我國為廣泛分布種，自然居群不徑相同。產地沿革考證其產區有陜西、山東、江蘇、湖北等地［2］。如今我國半夏種植主產區為甘肅、河北、貴州、湖北等省，貴州赫章是主要半夏種植產區之一［3］，所產半夏個大粒圓、色白粉足［4-5］。

植物和土壤微生物之間的相互作用是連接生態系統的關鍵［6］。土壤微生物量是土壤活性的重要標志［7］。植物為土壤微生物提供一定的營養，促進兩者協同進化。土壤微生物可分解有機物并被植物吸收［6］。土壤微生物重要組成部分叢枝菌根真菌（以下簡稱“AMF”）廣泛分布于農田、森林等土壤環境［8］。國內已發現的AMF虛擬種有145個， 隸屬于8科12屬［9］，包括糧食作物、蔬菜和中藥材等90%以上陸地維管植物可與AMF形成菌根結構［10］。

AMF與植物根系形成互惠的根系系統［11］，增強植物營養和礦質吸收，提高光合速率和生物量［12］。其形成的菌絲網可增加病原菌侵染根系難度［13］，AMF可與病原菌競爭生態位抑制其繁殖從而防控土傳病害。AMF能誘導植物產生防御酶類，這些酶類是植物抗病性的重要指標［14-15］。免耕能促進AMF生長和提高土壤堿性磷酸酶活性，持續免耕4年的土壤AMF群落結構沒有退化［16］，提高大粒徑團聚體中AMF種群豐度可促進土壤團聚［17］，AMF增殖和活性的提高可增強抑病能力［18］。單一作物輪作會抑制根際AMF活性和數量［19］，而采用間作方式能夠有效提高土壤中AMF的豐富度和多樣性，促進AMF的侵染和菌根的形成［20］。

半夏的相關研究主要集中在栽培技術、病蟲害防治、輪作障礙因子等，有關半夏種植土壤AMF多樣性的研究雖有［21-24］，但對采用不同作物輪作土壤AMF多樣性與土壤環境因子的相關性研究卻鮮見報道。本研究通過高通量測序，對赫章半夏道地產區輪作樣地土壤AMF的群落組成及多樣性進行分析，并進一步探究不同輪作土壤AMF組成與土壤環境因子的關系，以期為土壤環境因子調控AMF提高半夏栽培效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用半夏種子采用貴州省赫章縣本地選育優勢品種赫麻芋1號（貴州省農業農村廳認證品種），挑選直徑為1.0～1.5 cm的健康半夏種子用 2 000 倍石灰水浸泡5 h進行消毒處理后漂洗3次，用62.5 g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑拌種晾干備用。

1.2 試驗地概況

田間試驗設在貴州省畢節市赫章縣雙坪鄉貴州山地高效農業公司半夏種植區域，選擇土層深厚肥沃、排灌良好的沙質土壤為試驗基地，劃分不同小區連續栽種半夏與不同蔬菜，形成不同輪作茬數的處理樣地。

1.3 土壤樣本采集

于貴州省赫章縣雙坪鎮赫章縣山地高效農業科技有限公司半夏種植基地內，按照隨機取樣方法，采集未種植（CK）、半夏—蔬菜（白菜）輪作1年（LZ1）、半夏—蔬菜（甘藍）輪作2年（LZ2）、半夏—蔬菜（蘿卜）輪作3年（LZ3）、半夏—蔬菜（玉米）輪作4年（LZ4）的不同樣地半夏根際土壤，每個樣地按照隨機取樣法取5份后混合為1個樣，每組3個生物學重復，采集的土壤過20目篩后一部分置于-80 ℃下保存，用于土壤微生物DNA提取測序；另一部分室內自然風干后用于土壤理化性質測定。

1.4 理化指標及酶活性測定

對不同樣本土壤理化性質和酶活性測定具體方法如下：土壤樣品經硫酸-加速劑消解后用凱氏法測定全氮（TN）含量；經NaOH堿熔后用鉬銻抗分光光度法測定全磷（TP）含量、用火焰光度計法測定全鉀（TK）含量；用玻璃電極法測定pH值；用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定有機質（OM）含量；用堿解擴散法測定堿解氮（AN）含量；用B-0.05 mol/L HCl-0.025 mol/L H2SO4（1/2 H2SO4） 法測定有效磷（OP）含量；用乙酸銨浸提-火焰光度計測定速效鉀（AK）含量； 用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（CAT）活性；用試劑盒測定脲酶（URE）、蔗糖酶（SC）、 酸性磷酸酶（ACP）、多酚氧化酶（PPO）活性。以上指標測定委托南京卡文思檢測技術有限公司負責。

1.5 DNA提取、擴增和高通量測序

根據 FastDNASpin Kit for Soil說明書進行土壤微生物群落總基因組 DNA 抽提。以提取的 DNA 為模板進行Nest-PCR 擴增，一輪引物為AML1F（5′-ATCAACTTTCGATGGT AGGATAGA-3′） 和AML2R（5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC- 3′）；二輪引物為AMV 4-5NF（5′- A A G C T C G T A G T T G A A T T T C G -3′）和AMDGR（5′- C C C A A C T A T C C C T A T T A A T C A T -3′）。PCR反應每個樣本3次重復。將同一樣本的PCR產物混合后回收，利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序。以上相關流程均委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.6 數據統計與分析

以97%相似度的 OTU為分類學水平，將所有樣本序列按最小樣本序列數進行抽平，利用 Mothur 計算α多樣性指數，并采用Wilxocon秩和檢驗進行α多樣性的組間差異分析；基于bray-curtis距離算法檢驗樣本間微生物群落結構的相似性；通過R（version 3.3.1）、pheatmap package軟件計算環境因子與物種之間的相關性系數（Spearman等級相關系數）數值矩陣獲得Heatmap圖；用Network軟件進行雙因素相關性網絡分析（相關系數類型：Spearman；相關系數絕對值≥0.5）；采用Excel 2017 軟件數據處理；使用 SPSS 22.0 進行數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質及酶活性分析

對5個采樣地半夏根際土壤基本理化性質和酶活性8項指標進行檢測（表1），不同樣地土壤理化性質及酶活性存在一定的顯著性或極顯著性差異。TN、TP、AN、ACP含量隨輪作時間的延長呈波浪式降低；TK含量隨輪作時間延長而增加；AK、CAT、URE、SC、PPO活性隨輪作的延長而先增后降；pH值在CK、LZ1、LZ2土壤呈強酸性，在LZ3呈弱堿性，在LZ4呈弱酸性。

2.2 土壤AMF高通量測序結果及多樣性分析

序列經抽平后，采用反映物種豐富度的Shannon指數繪制稀釋曲線，隨著樣品測序深度的增加，15個樣品的OTU稀釋曲線趨于平緩（圖1），表明其測序深度足夠，而且各樣品測序覆蓋度均在99.95%以上，說明本次檢測的結果能夠客觀地代表樣本中AMF的多樣性。

所有樣本共聚類到155個OTU，圖2韋恩圖為樣本間獨有、共有OTU數量， ?下方柱狀圖為每一樣本OTU總數。在輪作年限中，OTU數量上表現為LZ4> LZ3>LZ2>LZ1，輪作越長土壤中AMF的OTU種類越多，輪作4年AMF的OTU達90種（圖2）。

對不同樣地的α多樣性指數分析（表2）表明：LZ4的AMF群落多樣性和豐富度均為最高，其次為CK，而輪作一年LZ1為最低。 反映土壤AMF豐富度的ACE 和 Chao 指數分別在（27.501 7±9.118 3）～ （70.624 8±3.566 6）和（18.666 7±3.055 1）～（68.566 7±3.156 5） 之間，反映AMF群落多樣性的 Shannon指數在（1.337 5±0.404 3）～（3.055 2± 0.103 5）之間，其中，LZ4樣地半夏根際土壤AMF多樣性最豐富，Shannon 指數和Chao指數分別為3.055 2±0.103 5和68.566 7±3.156 5。與之相反，LZ1樣地AMF多樣性最低，Shannon指 數、Chao指數分別為1.337 5±0.404 3和18.666 7± 3.055 1。 反映土壤AMF優勢度的 Simpson 指數在（0.074 7± 0.006 1）～（0.346 3±0.169 5）之間，LZ1樣地的AMF優勢度最高，輪作土壤中AMF群落的優勢度均高于對照組（CK）。

由樣本土壤AMF群落組間差異檢驗（圖3）可知，不同組間存在一定顯著性差異。其中CK與LZ1、LZ2、LZ3之間有極顯著差異（P<0.01），CK與LZ4之間無顯著差異；LZ1與LZ2之間有顯著差異（P<0.05），與LZ3、LZ4之間有極顯著差異（P<0.01）；LZ2與LZ3之間無顯著差異，與LZ4有極顯著差異（P<0.01）；LZ3與LZ4之間有極顯著差異（P<0.01）。以上表明，輪作時間越長土壤中AMF越趨于穩定，與未種植（CK）基本接近，但由于種植半夏與蔬菜的輪作，從而導致土壤中AMF比未種植過半夏的土壤更豐富；半夏土壤AMF的多樣性和豐度均隨著輪作時間的延長而增加。

2.3 土壤AMF組成及豐度分析

在科的水平，15個樣品中共注釋到了12個科的AMF類群，將物種豐度占比小于0.01的歸入其他（others）（圖4），球囊霉科（Glomeraceae）、近明球囊霉科（Claroideoglomeraceae）在5個樣地中均有，為主要的優勢類群，豐度總占比達91.65%，其中球囊霉科占比63.06%；球囊霉科在CK、LZ1、LZ3中為絕對優勢類群，球囊霉科和近明球囊霉科在LZ2、LZ4中的豐度基本接近；而類球囊霉科（Paraglomeraceae）在CK、LZ1、LZ2、LZ4中占有一定的比例，在LZ3土壤樣品中未被檢出。在屬的水平，15 個樣品中共注釋到了14個屬的AMF菌類群（圖5），球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）為主要的優勢類群，占總序列數的91.65%，其中球囊霉屬占比達63.06%，2個優勢屬在各樣本中的分布規律與科水平一致。在種的水平，15個樣品中共注釋到了63個種（圖6），遺憾的是AMF在種水平很多未被具體分類，說明AMF在種水平的研究還有較大的空間。

2.4 土壤AMF群落結構與土壤環境因子相關性分析

對豐度排名Top10的AMF科與環境因子進行相關性聚類熱圖分析。結果（圖7）表明，無梗囊霉屬（Acaulospora）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）的相對豐度與OM含量顯著正相關，與TP含量、OP含量、PPO活性極顯著負相關（P<0.01）；球囊菌門（Glomeromycota）未分類屬的相對豐度與OM含量顯著正相關，與TN含量、AN含量、URE活性極顯著正相關，與pH值（P<0.001）、OP含量（P<0.01）極顯著負相關，與PPO活性顯著負相關；盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、原囊霉屬（Archaeospora）的相對豐度與URE活性顯著正相關，與pH值、OP含量顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負相關；近明囊霉屬的相對豐度與OM含量顯著負相關，與TK含量、CAT活性、PPO活性顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）正相關；類球囊霉屬（Paraglomus）、球囊霉目（Glomerales）的未分類屬的相對豐度與AK含量、SC活性顯著（P<0.05）或極顯著（P≤0.01）負相關；球囊霉目（Glomerales）未分類屬的相對豐度與OP含量顯著正相關；球囊霉屬的相對豐度與ACP活性極顯著負相關，與TK含量顯著負相關；多孢囊霉屬（Diversispora）的相對豐度與ACP活性、OM含量、TN含量、AN含量、URE活性顯著或極顯著負相關，與pH值、OP含量、CAT活性、PPO活性顯著或極顯著正相關。

對AMF屬水平群落與環境因子進行雙因素Network網絡分析。結果（圖8）表明，未分類的球囊霉門的相對豐度與URE極顯著正相關，與pH值極顯著負相關；多孢囊霉屬的相對豐度與pH值極顯著正相關，與AN極顯著負相關。以上結果與聚類熱圖（圖7）相互印證。AMF群落與環境因子的連線為：多孢囊霉屬為9條、未分類的球囊霉門為6條、巨孢囊霉屬為4條、無梗囊霉屬為4條、近明球囊霉屬為4條、雙型囊霉屬（Ambispora）為4條、原囊霉屬為3條、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）為3條，與環境因子的連線越多，表明該群落與環境因子的關系越密切，受影響因素越多。綜上所述，對AMF菌群的生長調節需要考慮多因素環境因子的相互關系，這為采用施肥調整土壤結構從而有目的增加某屬AMF菌群的豐度具有指導意義。

3 討論與結論

土壤pH值、OM含量、TN含量、TP含量、 TK含量等能直觀反映土壤肥力，對植物和微生物的生長具有重要影響。安艷發現，半夏連作根際土壤中TN、 TP、 OP、OM含量和CAT、URE活性等降低，AK含量、PPO活性升高［25］。杭燁等發現，單作半夏土壤細菌數量和放線菌數量低于其余6種間作組合，間作可以提高土壤綜合肥力［26］。王禮科等發現，隨半夏連作年限增加，AK、OP含量下降［27］。本研究結果與上述既相似又有所不同，即均為TN含量、TP含量、OM含量、URE活性下降，但AK含量、OP含量、CAT活性結果不同，其原因可能是不同栽培模式導致土壤環境因子發生規律不一致，本研究連續輪作與連作的區別在于在半夏采收過后種植一茬蔬菜，從而改變了土壤理化性質的變化規律。本研究結果表明，輪作情況下半夏根際土壤TN含量、TP含量、AK含量、AN含量、URE活性、SC活性、ACP活性、OM含量隨著輪作時間的延長最終降低；TK含量、OP含量、CAT活性、PPO活性隨著輪作時間的延長而增加。

唐成林等發現，種植半夏后土壤中微生物數量增加［28］。施曉峰等發現，大量的 AMF 孢子存在于半夏根際土中，經鑒定得到20種3屬，其中球囊霉屬16種（80.0%），無梗囊霉屬3種（15.0%），盾巨孢囊霉屬1種（5.0%）［24］。何志貴發現，不同種植方式土壤真菌群落結構各自聚類，與種植時限無明顯關系。種植方式的變換可顯著抑制病原真菌而提升有益真菌豐度［29］。劉詩蓉等發現，隨著半夏連茬次數的增加，根際土有益微生物豐度減少、有害微生物豐度增加，多樣性降低，并認為這是連作障礙形成的重要原因［30］。本研究發現，連續輪作情況下土壤AMF的種類和豐度均上升，Shannon指數從LZ1的（1.337 5±0.404 3）上升LZ4的（3.055 2±0.103 5），說明隨著輪作時間的延長，種植半夏土壤中AMF群落多樣性越高；球囊霉科、近明球囊霉科為主要的優勢菌群，不管是在科水平還是屬水平的，所占總序列數比例均為91.65%。

本研究中無梗囊霉屬、巨孢囊霉屬、球囊菌門未分類屬、盾巨孢囊霉屬、原囊霉屬等的相對豐度與土壤有效磷之間呈現顯著或極顯著負相關性，說明隨著土壤有效磷含量的增加，以上AMF菌群的物種豐度下降，這與Tawaraya等的研究結果類似，即較低的OP會促進 AMF的生長［31］。張海波等發現，在偏堿性石灰土中的AMF多樣性高于偏酸性黃壤［32］。本研究LZ3的土壤pH值偏堿性，其土壤中AMF多樣性高于偏酸性的LZ1、LZ2，但又低于偏酸性的LZ4，說明偏堿性的土壤中AMF多樣性要高于偏酸性土壤并不絕對，還與耕作模式、種植年限等相關。Liang等發現，喀斯特地區AMF多樣性與土壤pH值呈負相關，本研究中雖然部分AMF群落與pH值呈現負相關性，但多孢囊霉屬卻與pH值呈極顯著正相關，說明該屬的生長更偏向于堿性土壤［33］。在pH值為 5～9的喀斯特地區，土壤堿性與球囊霉屬比例正相關，該屬可能處于更重要的生態位［34］。本研究中球囊霉屬為主要優勢菌群，近明球囊霉屬次之，這與上述研究結果類似。

土壤微生物和土壤酶共同參與土壤的生物生化過程，土壤酶活性反映其生化反應過程的方向和強度［35-39］。AMF能夠增強寄主植物根系中相關酶活提高抗鹽能力［40］。菌根能改善土壤OM含量、團粒結構和透氣性［41］，增強脲酶、蔗糖酶等酶活性而減緩輪作危害［42-43］。AMF通過調節植物根系分泌物降解酚酸類物質［44］。AMF能與土壤其他有益微生物協同作用增強植株抵御能力，其誘發的防御反應可提高植物對病原菌抗性，促進養分、水分的吸收，改善輪作土壤生境狀況，緩解輪作障礙的危害［44］。近明球囊霉、根內球囊霉、摩西斗管囊霉等能夠促進宿主對營養元素的吸收和促進植物生長和生物量積累，根內根孢囊霉在高溫脅迫下顯著提高蒼術根莖鮮質量、含水量、根干質量、地下總干質量、揮發油組分數，根內根孢囊霉在鹽脅迫下可以增加羅勒對鉀的吸收、降低對鈉和氯化物的吸收［45-46］。本研究的土壤酶活性與樣本AMF群落相關性表明，AMF群落與過氧化氫酶、脲酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性之間具有一定的相關性。而不同AMF與土壤酶活性之間的相關性有較大區別，如無梗囊霉屬、巨孢囊霉屬與PPO活性極顯著負相關；球囊菌門的未分類屬與URE活性極顯著正相關，與PPO活性顯著負相關；盾巨孢囊霉屬、原囊霉屬與URE顯著正相關；近明囊霉屬與CAT、PPO活性顯著或極顯著正相關；類球囊霉屬、球囊霉目的未分類屬與SC活性顯著負相關；球囊霉屬與ACP活性極顯著負相關；多孢囊霉屬與ACP、URE活性顯著或極顯著負相關，與CAT、PPO活性顯著或極顯著正相關。

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收 稿日期：2023-02-08

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2015BAI05B03）；貴州省人才基地項目（編號：RCJD2020-21）；貴州省高層次創新型人才項目（編號：畢科人才合字［2021］05號）；畢節市揭榜掛帥項目（編號：畢科合重大專項字［2021］3號）；畢節市科技局聯合基金項目（編號：畢科聯合字yz［2021］5號）。

作者簡介：張翔宇（1986—），男，貴州道真人，碩士，副研究員，研究方向為藥用植物資源工程。E-mail：304626335@qq.com。

通信作者：陳曉芳，碩士，副教授，研究方向為特色資源分子生物學，E-mail：672409415@qq.com；查 欽，碩士，副研究員，研究方向為藥用植物資源開發與利用，E-mail：914282286@qq.com。