響應面法優化栗蘑多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

牛牧青　徐婉婷　龍麗芳　呂銳玲　徐碧林　鄭永良

摘要：為優化栗蘑多糖提取工藝，以栗蘑子實體為研究對象，通過硫酸-苯酚滴定法，結合紫外分光光度法測定栗蘑多糖提取率。在單因素多水平實驗的基礎上，采用響應面法，利用Design-Expert軟件，選取提取時間、提取溫度、提取液料比3個因素，設置三水平實驗方案優化提取工藝。結果表明，栗蘑多糖最佳提取工藝為提取時間1.9 h、提取溫度80 ℃、提取液料比37∶1（mL/g），此條件下栗蘑多糖提取率為14.45%?？寡趸钚匝芯拷Y果表明，栗蘑多糖對DPPH自由基和羥基自由基都具有較好的清除能力，在一定范圍內，抗氧化活性隨著多糖濃度的增加而提高。

關鍵詞：栗蘑；多糖；響應面法；提取工藝；優化；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.1文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0183-06

Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Grifola frondosa

by Response Surface Methodology and Study on Their Antioxidant Activity

NIU Mu-qingXU Wan-tingLONG Li-fangLYU Rui-ling

XU Bi-linZHENG Yong-liang1，3*

Abstract： In order to optimize the extraction process of Grifola frondosa polysaccharides， with Grifola frondosa fruit body as the research object， the extraction rate of polysaccharides from Grifola frondosa is determined by sulfuric acid-phenol titration method combined with ultraviolet spectrophotometry. On the basis of single-factor and multi-level experiment， response surface methodology and Design-Expert software are used to select three factors such as extraction time， extraction temperature and extraction liquid-solid ratio. A three-level experimental scheme is set up to optimize the extraction process. The results show that the optimum extraction conditions are as follows： extraction time is 1.9 h， extraction temperature is 80 ℃， extraction liquid-solid ratio is 37∶1（mL/g）， under such conditions， the extraction rate of polysaccharides is 14.45%. Antioxidant activity research results show that the polysaccharides from Grifola frondosa have good scavenging capacity on DPPH free radical and hydroxyl free radical. Within a certain range， the antioxidant activity increases with the increase of polysaccharides' concentration.

Key words： Grifola frondosa; polysaccharides; response surface methodology; extraction process; optimization; antioxidant activity

栗蘑（Grifola frondosa）俗稱灰樹花，又名舞茸、貝葉多孔菌，是一種十分珍貴的藥食同源蕈菌。野生栗蘑常見于板栗樹下，具有好氧、喜光的生長特性[1]。隨著栗蘑栽培技術的推廣，栗蘑產業在河北遷西、浙江慶元已經形成了一定規模，我國栗蘑產量得到了極大的提升[2-3]。栗蘑有著獨特的香味、脆嫩的口感，并且富含蛋白質、礦物質、維生素等物質，具有極高的營養價值。栗蘑除了可以食用外，還具有極高的藥用價值，這得益于栗蘑中的生物活性成分，其中多糖作為栗蘑中含有的一種重要活性成分具有提高人體免疫力、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等功效[4-5]。

多糖是一種具有復雜空間結構的天然大分子化合物[6]，目前關于多糖的提取主要采取水提法、酶提法、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法等[7]。水提法主要利用多糖易溶于水的特性，且操作簡單、方便快捷，因此是一種常用于提取多糖的方法[8-10]。響應面法可以用于分析提取條件各因素之間的相互作用，是一種精密度高、可行性強的方法。為了提高栗蘑多糖的提取率，確保多糖活性的穩定，本實驗選擇熱水浸提法對栗蘑多糖進行提取，運用Design-Expert 11軟件優化提取工藝，得到最佳提取條件，并測定栗蘑多糖的自由基清除能力，進行抗氧化活性研究，為栗蘑及其相關功能產品的研發提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

栗蘑菌種原種（Grifola frondosa JD01）：由本課題組分離保藏；栗蘑子實體：由課題組實驗基地生產提供。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（VC）、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、30%過氧化氫：滬試國藥集團化學試劑有限公司；以上化學試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

V-5600紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；AB204-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；3-18KS高速冷凍離心機 美國Sigma公司；MX-S渦旋振蕩器 美國Scilogex公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將所得栗蘑子實體表面清洗干凈，烘干、粉碎成粉末狀，備用。

1.3.2 栗蘑多糖提取工藝

稱取栗蘑粉末5.0 g于錐形瓶中，按液料比40∶1 （mL/g）加入去離子水浸泡，隨后放置在70 ℃的水浴鍋中提取2 h，抽濾，棄去栗蘑廢渣，保留上清液，并濃縮至1/3，醇沉，放于溫度設置為4 ℃的冰箱中靜置8 h。在轉速為6 500 r/min的條件下離心10 min，保留下層沉淀，棄去上清液，再用無水乙醇洗滌3次后，重復上述操作，合并沉淀物，即得到栗蘑多糖。

1.3.3 標準曲線的繪制

按照苯酚-硫酸比色法[11]繪制出葡萄糖標準曲線。

1.3.4 栗蘑多糖提取率的測定

按照1.3.3中的方法，測定多糖溶液的吸光度值，以去離子水為對照，根據得到的回歸方程計算得出栗蘑多糖提取率，計算公式如下：

栗蘑多糖提取率（%）=[（C×V×N）/（M×106）]×100%。

式中：C為回歸曲線方程計算得到的栗蘑多糖的濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；N為稀釋倍數；M為栗蘑粉末的質量，g。

1.3.5 提取條件的單因素實驗

稱取栗蘑粉末5.0 g，分別以提取溫度、提取時間、提取液料比（去離子水體積與栗蘑粉末質量的比例）為因素，控制單一變量，進行單因素實驗，探究多糖提取的最佳條件。

1.3.6 響應面優化設計

根據單因素實驗結果，運用Design-Expert 11軟件設置響應面實驗設計方案，分析提取條件各因素之間的交互作用對多糖提取率的影響，響應面實驗因素及水平見表1。

1.3.7 栗蘑多糖抗氧化活性研究

1.3.7.1 DPPH自由基清除率測定

參考薛小蘭等[12]的方法，分別配制濃度為0.25，0.5，1，5 mg/mL的栗蘑多糖水溶液，計算栗蘑多糖的DPPH自由基清除率，同時以VC作陽性對照，計算公式如下：

DPPH自由基清除率（%）=A空白－（A樣品－A對照）A空白×100%。

式中：A空白為不含樣品的空白組的吸光度值；A樣品為栗蘑多糖溶液的吸光度值；A對照為不含DPPH的對照組的吸光度值。

1.3.7.2 羥基自由基清除率測定

采用水楊酸法測定[13-14]，分別配制濃度為0.25，0.5，1，5 mg/mL的栗蘑多糖水溶液，計算羥基自由基清除率，并以VC為陽性對照組，計算公式如下：

羥基自由基清除率（%）=A空白－（A樣品－A對照）A空白×100%。

式中：A空白為不含樣品的空白組的吸光度值；A樣品為栗蘑多糖溶液的吸光度值；A對照為不含過氧化氫的對照組的吸光度值。

1.4 數據處理

利用Design-Expert 11軟件對響應面實驗得出的結果進行處理和分析，采用Origin 2021軟件進行分析繪圖[15-16]。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

由圖1得到回歸曲線方程：Y=0.016 8X－0.016 6，R2=0.999 2，表明標準曲線線性關系良好。

2.2 栗蘑多糖提取的單因素實驗結果

選取提取溫度為70 ℃、提取液料比為40∶1 （mL/g），將提取時間分別設定為1， 4 h，每個條件各做3組平行對照[17-18]。由圖2中a可知，提取時間在1～2 h之間，栗蘑多糖提取率隨著時間的增加而升高，在2 h時得到最大提取率。2 h以后，提取率隨著時間的增加逐漸降低。因此，用于響應面優化的提取時間選擇 3 h。

選取提取時間為2 h、提取液料比為40∶1 （mL/g），將提取溫度分別設定為60，70，80，90 ℃，每個條件各做3組平行對照[19]。由圖2中b可知，提取溫度在60～70 ℃之間，栗蘑多糖提取率隨著溫度的增加而不斷升高，溫度較低時，多糖不易溶出，得率較少。當溫度上升至80～90 ℃時，體系中的栗蘑多糖結構受到破壞，造成含量減少，提取率逐漸降低，因此，用于響應面優化的提取溫度選擇60，70，80 ℃。

選取提取時間為2 h、提取溫度為70 ℃，將提取液料比分別設定為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，每個條件各做3組平行對照[20]。由圖2中c可知，提取液料比在20∶1～40∶1之間，栗蘑多糖提取率逐漸升高，當液料比從40∶1增加到50∶1時，多糖提取率隨著液料比的增加反而降低。說明前期溶液中溶劑較少，溶出的多糖較少，隨著液料比的增加，體系中溶劑增多，多糖溶出量也隨之增大，直至達到飽和狀態，栗蘑多糖不再繼續析出。因此，確定用于響應面優化的液料比選擇30∶1、40∶1、50∶1。

2.3 提取條件的響應面優化實驗結果

2.3.1 響應面模型擬合與顯著性分析檢驗

采用Box-Behnken設計，依據方案開展實驗，處理數據[21-22]，結果見表2。

對表2中數據進行多元回歸擬合分析，可得到方程：Y=13.80+0.79A+1.46B+0.61C－1.20AB－0.30AC－1.15BC－2.31A2－0.78B2－0.94C2。

該模型方差分析結果見表3。

由表3中方差分析結果可知，模型P<0.000 1，表明栗蘑多糖的提取率與各提取因素的回歸方程關系極顯著[23]；失擬項的P=0.149 2>0.05，不顯著，表明實驗結果與該模型的擬合度良好。由可信度分析可知R2=0.984 5， RAdj2=0.964 6，二者的差值小于0.2，表明實際值與預測值十分接近，且C.V.為3.28%，表明可信度高，因此可以用該模型來進行栗蘑多糖提取工藝的優化。

一次項分析表明，各因素對多糖提取率的影響大小為提取溫度>提取時間>提取液料比，由方差分析還可知，模型中AB、BC、A2、B2、C2對栗蘑多糖提取率的影響顯著，AC對栗蘑多糖提取率的影響不顯著。

2.3.2 響應面三維模型分析

根據該回歸模型方程，繪制三維曲面圖及等高線圖，見圖3。

在三維曲面圖中可以得到一個開口向下的凸面，表明栗蘑多糖提取率存在一個極大值。圖3中曲面坡度可以反映出所探究的因素對栗蘑多糖提取率影響的顯著性大小，曲面坡度越陡，表明影響越顯著；反之，曲面坡度越平緩，表明影響越不顯著[24]。

由圖3可知，3個實驗因素中對栗蘑多糖提取率的影響大小為提取溫度>提取時間>提取液料比，與方差分析結論一致。通過等高線圖分析可以得到兩個因素交互作用的程度大小，圖3中d和f圖更接近橢圓形，因此AB和BC的交互作用顯著。

2.4 最佳提取工藝及驗證實驗

采用Design-Expert 11軟件，以栗蘑多糖提取率最大值作為指標，根據所得擬合模型進行分析計算，可得到理論上最優提取條件為提取時間1.93 h、提取溫度80 ℃、提取液料比37∶1 （mL/g），此時栗蘑多糖提取率為14.57%。為驗證模型預測的可靠性，依據實際條件將提取條件優化為提取時間1.9 h、提取溫度80 ℃、提取液料比37∶1 （mL/g），進行驗證實驗和重復實驗，得到平均提取率為14.45%，與預測得出的栗蘑多糖提取率相差較小，表明通過優化后得到的提取工藝穩定可行。

2.5 栗蘑多糖抗氧化性研究

2.5.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率越大，說明還原性越強，栗蘑多糖具有較好的抗氧化能力。不同濃度栗蘑多糖溶液的DPPH自由基清除率見圖4。

在一定的濃度范圍內，栗蘑多糖具有較好的DPPH自由基清除能力，且與多糖溶液的濃度呈現出量效關系。由圖4可知，當栗蘑多糖溶液濃度為5 mg/mL時，其DPPH自由基清除率存在最大值，為87.5%，與陽性對照組VC的清除能力相差較小。綜上所述，栗蘑多糖有較好的抗氧化活性。

2.5.2 羥基自由基清除率

還原劑的能力越強，對羥基自由基的清除效果越好，不同濃度栗蘑多糖溶液的羥基自由基清除率見圖5。

由圖5可知，低濃度的多糖溶液羥基自由基清除率較小，且與VC陽性對照組相差較大，但隨著濃度的不斷增加，栗蘑多糖的羥基自由基清除率呈現升高的趨勢，且在濃度為5 mg/mL時達到94.36%，與VC的清除率逐漸接近，說明栗蘑多糖具有較好的羥基自由基清除能力。

3 結果與討論

本實驗利用水提醇沉法提取栗蘑多糖，在單因素實驗結果的基礎上，采用Box-Behnken方法對多糖提取條件進行響應面優化，得到最佳提取工藝，即在提取時間1.9 h、提取溫度80 ℃、提取液料比37∶1 （mL/g）的條件下，栗蘑多糖提取率達到14.45%，且該工藝穩定可行。此外，抗氧化實驗結果表明，栗蘑多糖具有較好的DPPH自由基、羥基自由基清除率，且在栗蘑多糖濃度為5 mg/mL時抗氧化能力最強，栗蘑多糖具有較好的抗氧化活性，是一種優質的天然抗氧化劑。

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收稿日期：2023-07-12

基金項目：國家自然科學基金青年項目（32001207）；湖北省中央引導地方科技發展專項資金（2019zyyd044）；湖北省重點研發計劃項目（2020BBB091）

作者簡介：牛牧青（1997－），女，碩士，研究方向：食藥用菌活性物質。

*通信作者：鄭永良（1969－），男，教授，博士，研究方向：食藥用菌及其功能。