桂花色素的超聲輔助提取工藝及其抑菌效應分析

譚志梅　王晨戍　王淑培　杭方學　張靜　黃曉菲

摘要：桂花色素是一種性能優良的天然色素，在食品加工工業中具有廣闊的應用前景。試驗以浦城桂花為原料，通過單因素試驗考察了桂花品種、乙醇濃度、超聲功率、超聲時間、液料比對桂花色素得率的影響，進一步進行響應面試驗優化其提取工藝。同時通過牛津杯法驗證提取的桂花色素對7種菌株（4株細菌，2株絲狀真菌，1株酵母菌）的抑菌效應。試驗結果表明，超聲輔助法提取桂花色素的最佳提取條件為乙醇濃度60%、液料比25∶1 （mL/g）、超聲功率200 W、超聲時間30 min，在此條件下，桂花色素的得率最高，達到61.56%。此外，抑菌試驗證實桂花色素對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌、釀酒酵母具有顯著的抑制作用，而對桔青霉和米曲霉的抑制效應相對較弱。

關鍵詞：桂花；色素；超聲波；響應面分析法；抑菌效應

中圖分類號：TS264.4文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0177-06

Analysis of Ultrasonic-Assisted Extraction Process and Antibacterial Effect of Osmanthus fragrans Pigment

TAN Zhi-meiWANG Chen-shuWANG Shu-pei2*， HANG Fang-xue ? ZHANG Jing3， HUANG Xiao-fei3

Abstract： Osmanthus fragrans pigment is a kind of natural pigment with excellent performance， which has broad application prospect in the food processing industry. In this test， with Pucheng Osmanthus fragrans as the raw material， the effects of Osmanthus fragrans varieties， ethanol concentration， ultrasonic power， ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of Osmanthus fragrans pigment are investigated by single factor test， and the extraction process is further optimized by response surface test. At the same time， Oxford cup method is used to verify the antibacterial effects of Osmanthus fragrans pigment on seven strains （including four strains of bacteria， two strains of filamentous fungi and one strain of yeast）. The results show that the optimal extraction conditions of Osmanthus fragrans pigment by ultrasonic-assisted extraction method are ethanol concentration of 60%， liquid-solid ratio of 25∶1 （mL/g）， ultrasonic power of 200 W and ultrasonic time of 30 min. Under these conditions， the yield of Osmanthus fragrans pigment is the highest， reaching 61.56%. In addition， in the antibacterial test， it is confirmed that the Osmanthus fragrans pigment has significant inhibitory effects on Bacillus subtilis， Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Micrococcus luteus and Saccharomyces cerevisiae， while the inhibitory effects on Penicillium citrinum and Aspergillus oryzae are relatively weaker.

Key words： Osmanthus fragrans； pigment； ultrasonic wave; response surface analysis methodology； antibacterial effect

桂花（Osmanthus fragrans （Thunb.） Lour.），又名木犀、巖桂、九里香等，屬木犀科植物，原產于我國西南部，主要分布于中亞熱帶和北亞熱帶地區[1-2]。桂花品類繁多，且富含碳水化合物、蛋白質、維生素、花青素等，在世界上被稱為“全營養食品”[3-4]。桂花除用以鑒賞外，在化妝品、食品調香、藥品、天然色素提取等領域也有極廣闊的應用前景[5-8]。隨著人們生活水平的不斷提高，天然植物色素受到廣泛的關注，天然色素不僅安全性高，而且具有一定營養和保健作用。因此，開發和使用天然色素逐漸成為發展趨勢[9]。桂花色素因色調鮮明亮麗、性能穩定等優點被視為品質優良的色素提取來源，除了可用于食品著色外，還具有一定的藥用價值，劉東陽等[10]研究表明，桂果中提取的色素性能穩定，具有一定的抗氧化活性，可作為天然色素資源應用于食品領域；黃玲艷[11]以金桂花為原料，研究發現桂花提取物具有較好的抗氧化活性和抗衰老作用；馬森等[12]用石油醚從桂花中提取色素，結果表明桂花色素可顯著清除亞硝酸鹽；李志洲等[13]對桂花色素的穩定性進行研究，發現提取出的桂花色素在酸性條件下較穩定，常見的食品添加劑及抗氧化劑對其穩定性的影響不大。溶劑提取法、浸漬壓榨提取法、酶反應提取法、微生物發酵法等都是傳統的天然色素提取方法，為了更好地提取及利用色素，微波輔助提取、超聲輔助提取、分子蒸餾萃取等方法也被廣泛研究應用[14-16]。浦城縣位于福建省最北部，栽培桂花歷史悠久，品種多樣，全縣現有桂花林面積1 333 hm2以上，年產鮮桂花3×105 kg，綜合利用潛力巨大[17-18]。本試驗以浦城縣5種主要桂花品種浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂為原料，采用超聲輔助法從中提取天然食用色素，旨在選取色素提取率最高的桂花品種，并進一步優化工藝，提高色素產量；同時研究桂花色素提取物對代表性細菌和真菌的抑制效應，以期為桂花天然食用色素的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、大腸埃希菌（Escherichia coli，ATCC25922）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus，ATCC49732）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，ATCC9763）、桔青霉（Penicillium citrinum，ATCC9849）、米曲霉（Aspergillus oryzae，ATCC42149）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：廣東環凱微生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉、氯化鈉（AR）：上海展云化工有限公司；無水乙醇（AR）：三明市三圓化學試劑有限公司；浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂干花：浦城縣木樨園營養食品有限公司。

1.2 儀器與設備

DHZ-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 23R臺式高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；UV-3200PC紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；RE52-99旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；2XZ-2旋片式真空泵 臺州市椒江宏興真空設備廠；YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ZD-85恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；LRH-150F生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 桂花色素提取液的制備

準確稱取1.000 g桂花粉置于燒杯內，按試驗設計的液料比（mL/g）加入乙醇溶液（體積比），移入超聲波細胞粉碎機中，在一定的超聲功率、超聲時間下進行桂花色素提取。對提取后的浸提液進行抽濾（－0.1 MPa），將抽濾后的提取液移入臺式高速冷凍離心機中進行離心（4 ℃，4 500 r/min，15 min），棄去沉淀后即得到桂花色素提取液。

1.3.2 桂花色素粗提物的制備

將上述提取液置于旋轉蒸發儀中進行濃縮（55 ℃，－0.1 MPa），濃縮至黏稠狀。將黏稠狀的濃縮液置于真空干燥箱中干燥（60 ℃）至恒重，即獲得桂花色素粗提物[19]。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準曲線的繪制

參考劉婭涵等[20]的方法，稱取0.110 g桂花色素粗提物，加入少量60%乙醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，以60%乙醇定容至刻度線，搖勻，得到1 000 μg/mL的桂花色素母液。用移液管分別移取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL的桂花色素溶液于100 mL容量瓶中，分別用60%乙醇定容至刻度線，搖勻，得到濃度分別為5，10，15，20，25，30，35，40 μg/mL的桂花色素工作液。以60%乙醇溶液調零，在保護層波長330 nm下測定其OD值，并繪制標準曲線，其標準曲線方程為y=0.116x－0.001（R2=0.999 8）。

1.4.2 得率的計算

經超聲輔助法提取得到的桂花色素溶液，經真空抽濾后離心，棄去沉淀定容至50 mL，稀釋適宜倍數得到樣品測試液，以相應濃度的乙醇溶液調零，在波長為330 nm條件下測定其OD值。根據繪制的桂花色素標準曲線所得的線性回歸方程計算出桂花色素樣品液濃度。

色素得率（%）=（C×d×50）/（m×106）×100。

式中：C為樣品測試液桂花色素溶液濃度，μg/mL；d為稀釋倍數；50為桂花色素提取液定容體積，mL；m為桂花質量，g；106為單位換算系數，1 g=106 μg。

1.4.3 單因素試驗

以OD330 nm值表征色素含量，分別考察了桂花品種、乙醇濃度、超聲功率、超聲時間、液料比對桂花色素得率的影響。各品種桂花分別篩選、去除雜質，低溫烘干，用超微粉碎機粉碎，過60目篩。準確稱取一定量桂花樣品，參考趙娟娟等[21]的方法，在液料比20∶1 （mL/g）、乙醇濃度70%、超聲功率200 W、提取溫度55 ℃、提取時間30 min的條件下提取桂花色素，研究不同桂花品種（浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂）對桂花色素提取率的影響。以四季桂為原料，研究不同乙醇溶液濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、超聲功率（80，120，160，200，240，280，320 W）、提取時間（10，20，30，40，50，60，70 min）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g）對桂花色素吸光度值的影響，取1 mL溶液稀釋至25 mL，測定其OD值，試驗重復3次。

1.4.4 響應面優化試驗

基于上述單因素試驗的結果，選定四季桂為提取原料，選取乙醇濃度、超聲功率、超聲時間、液料比為考察因素，按照Box-Behnken試驗設計原理，進行四因素三水平響應面試驗[22]，試驗因素和水平見表1。

1.4.5 抑菌試驗

將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌分別接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基斜面上，于37 ℃培養24～48 h，備用；將釀酒酵母、桔青霉、米曲霉接種到PDA培養基斜面上，于27 ℃培養2～5 d，備用。取活化好的菌種斜面，用滅菌生理鹽水制成107～108 CFU/mL的菌懸液，備用[23]。

將桂花色素粗提物用DMSO精確配成0（對照組），2.5，5，10，15，20，25 mg/mL系列濃度的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。參考陳光等[24]的方法，采用牛津杯法測試桂花色素對7種指示菌的抑菌作用。每個處理4個重復。

1.4.6 數據處理與分析

運用Excel 2019統計所有數據，數據分析采用SPSS 20軟件。方差分析采用ANOVA，采用Duncan's多重比較進行差異顯著性分析。圖表繪制采用Origin 9.0軟件。正交試驗設計及分析使用Design-Expert 8.0.6.1軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 桂花品種對得率的影響

試驗選擇了浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂5個品種的桂花進行色素的提取，桂花品種對桂花色素得率的影響見圖1。

由圖1可知，在相同的提取工藝條件下，四季桂的色素得率最高（49.52%），銀桂、金桂、狀元紅次之，浦城丹桂的色素得率較低。故后續色素提取原料選定四季桂。

2.1.2 乙醇濃度對得率的影響

乙醇濃度對桂花色素得率的影響見圖2。

由圖2可知，乙醇濃度在30%～60%范圍內，色素得率不斷上升，且在乙醇濃度為60%時取得極值51.38%。其原因可能是隨著乙醇濃度的增加，色素分子與乙醇充分接觸，色素溶出率增加，提取初期桂花色素-乙醇溶液中色素濃度差異大，利于提取。乙醇濃度繼續增大，得率下降，當乙醇濃度大于80%時，得率陡然下降，可能是隨著乙醇濃度的增加，提取劑的極性增大，使醇溶性、脂溶性的物質析出，而這些物質與色素形成競爭，并與乙醇-水分子結合而導致的[25]。乙醇濃度達到80%后，色素分子結構被分解破壞，導致得率下降，故乙醇濃度選取60%為宜。

2.1.3 超聲功率對得率的影響

超聲功率對桂花色素得率的影響見圖3。

由圖3可知，超聲功率在80～200 W范圍內，隨著超聲功率的增大，桂花色素得率上升，在超聲功率為200 W時，得率達到最大值51.36%。其原因可能是色素提取需要適宜的超聲功率，超聲功率較低時，植物細胞壁破壞不充分，提取速率較慢，隨著功率的增大，色素分子在乙醇中的溶解度提升，使得率提升。而當超聲功率增加到200 W以后，超聲產生的空化效應增強，提取體系中超聲波的物理振蕩作用進一步加強，致使色素的分子結構被破壞[26]，同時隨著超聲功率的增大，提取體系溫度上升也不可避免地造成了提取劑的揮發，最終導致得率下降，故超聲功率選取200 W為宜。

2.1.4 超聲時間對得率的影響

超聲時間對桂花色素得率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著超聲時間的延長，桂花色素得率整體呈先上升后下降的趨勢。在超聲時間為30 min時達到極值57.87%。超聲時間為10～20 min時，得率上升緩慢，這是因為桂花色素與乙醇溶劑需要一定時間的充分接觸才能被提取出來，超聲時間過短，超聲提取的作用沒有充分發揮，得率較低。當超聲時間達到30 min時，更多溶劑滲入細胞內部，促進色素的溶出，使得桂花色素取得最大得率[27]。超聲時間繼續增加，得率明顯下降，可能是因為提取體系長時間超聲處理以及一直處于較高溫度加速了色素的分解，使得色素得率下降，故超聲時間選擇30 min為宜。

2.1.5 液料比對得率的影響

由圖5可知，液料比由10∶1（mL/g）上升到25∶1（mL/g）的過程中，桂花色素的得率也隨之上升，在液料比為25∶1（mL/g）時取得最大值61.53%，可能是因為隨著溶劑的增加，滲透壓增加，利于提取。隨著液料比繼續增加，得率顯著下降，其原因可能是液料比增加后，有機溶劑添加過多使得其他雜質溶出，影響了色素本身的溶出，因此液料比過高并不利于色素浸提[28]，故液料比選擇25∶1（mL/g）為宜。

2.2 響應面試驗結果

響應面試驗設計與結果見表2。采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對色素得率的結果進行回歸分析，以桂花色素得率為響應值，乙醇濃度（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）、液料比（D）為自變量，得到二次多項回歸模型：Y桂花色素得率 =61.47－1.04A+1.37B－0.43C+0.67D+0.11AB+0.59AC－1.51AD+0.08BC－1.21BD+0.30CD－3.61A2－5.60B2－4.93C2－5.06D2。

由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，模型極顯著，失擬項不顯著，表明該方程擬合性較好， RAdj2=0.986 5，說明數據可靠性較高。試驗中A（乙醇濃度）、B（超聲功率）、C（超聲時間）、D（液料比）對色素得率的影響極顯著；交互項中，AD、BD極顯著，AC顯著。由F值可知，各試驗因素影響順序為超聲功率（B）＞乙醇濃度（A）＞液料比（D）＞超聲時間（C）。

2.3 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件對回歸方程進行解析，得到最優的桂花色素提取工藝參數為乙醇濃度58.39%、超聲功率204.47 W、超聲時間29.49 min、液料比25.37∶1 （mL/g），在此條件下桂花色素預測得率為61.66%。結合實際操作的可行性，將最優工藝參數修正為乙醇濃度60%、超聲功率200 W、超聲時間30 min、液料比25∶1 （mL/g）。在修正工藝條件下進行3次驗證試驗，桂花色素得率平均值為61.56%，與預測值的相對誤差為0.16%，說明利用響應面法優化后得到的色素提取參數具有實際指導意義，且所得工藝參數可信，預測的回歸模型對優化超聲波細胞破碎輔助法提取桂花色素的工藝是可行的。

2.4 桂花色素抑菌效果的研究

桂花色素粗提液對不同指示菌的抑菌效果見表4。

由表4可知，相對于對照組（DMSO），當桂花色素粗提液的濃度大于5 mg/mL時，對所選的7種指示菌均具有一定的抑制作用，其抑制程度為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞藤黃微球菌＞大腸埃希菌＞釀酒酵母，整體上對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優于陰性菌，對霉菌中的桔青霉和米曲霉均具有抑菌作用，抑菌效果與色素的質量濃度呈正相關。這可能與桂花色素主要成分為類黃酮化合物以及類胡蘿卜素有關，有研究表明，黃酮類物質可以阻礙細胞膜和細胞壁的生成，抑制ATP的合成，影響菌體代謝[29]。此外，黃酮類物質可與金屬形成螯合物，抑制細菌金屬酶的活性[30]。李念等[31]發現類胡蘿卜素可抑制細胞膜的生成。目前，對于色素中具體的抑菌物質和機理還有待進一步研究。

3 結論

試驗選取浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂這5個浦城桂花產量較高的品種提取色素，其中四季桂的色素得率最高，為49.52%。以四季桂為原料，在單因素試驗的基礎上，選取乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲時間4個因素進一步進行響應面優化試驗，得到桂花色素的最佳提取工藝為乙醇濃度60%、超聲功率200 W、超聲時間30 min、液料比25∶1 （mL/g）。在此條件下，桂花色素提取率最高，為61.56%，與預測值（61.66%）的相對誤差為0.16%，表明響應面優化超聲輔助法提取桂花色素的工藝是可行的。桂花色素的抑菌試驗結果表明，桂花色素的抑菌效果顯著，整體上，桂花色素對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優于陰性菌。試驗中色素的抑菌程度為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞藤黃微球菌＞大腸埃希菌＞釀酒酵母，對桔青霉和米曲霉的抑制作用較弱。桂花色素除了可用于食品著色外，還具有顯著的抑菌效應，在食品、藥品和化妝品領域中具有極大的開發潛力和廣闊的應用前景。

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收稿日期：2023-07-14

基金項目：廣西自然科學基金項目（2022GXNSFBA035561）；南寧師范大學博士科研啟動基金項目（20210502）；福建省科技廳社會發展引導性項目（2020N0036）

作者簡介：譚志梅（1998－），女，碩士，研究方向：食品微生物。

*通信作者：王淑培（1986－），女，講師，博士，研究方向：食品微生物及生物技術。