“Grafting from”法制備高載量大孔弱陽離子交換層析介質

郭 旺，姜澤平，馬 磊，喬 娟，莫文清，靳海波，何廣湘，黃永東，張榮月

（1. 北京石油化工學院新材料與化工學院，燃料清潔化及高效催化減排技術北京市重點實驗室, 北京 102617；2. 中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室, 北京 100190）

隨著生物制藥規模的不斷增大，對下游分離純化技術的要求越來越高［1］. 層析分離作為一種主流的分離純化技術，由于具有操作溫和、 易放大等特點而被廣泛應用于蛋白分離純化中［2］. 其中，層析介質性能是影響分離純化效率的關鍵，傳統多糖基質的層析介質的孔徑?。?0～50 nm）、 質地軟（耐壓＜0.3 MPa），在高通量分離純化應用中受到一定的限制，而有機聚合物基質的層析介質的機械強度高（可耐壓10 MPa以上）、 孔徑大（＞100 nm），因此能更好地滿足高通量分離的需求［3］. 聚合物層析介質孔徑大，有利于蛋白等大分子的快速傳質，但隨著孔徑增加其比表面積降低，致使蛋白吸附容量降低［4］，因此提高大孔聚合物層析介質的蛋白吸附容量具有重要意義.

接枝聚合物長鏈是提高層析介質容量的常用方法之一. 小分子配基偶聯的層析介質在二維平面吸附蛋白，其吸附容量有限； 而聚合物長鏈在介質表面的構象豐富且易伸展，形成的接枝層能夠在三維空間吸附蛋白質，極大地提高了蛋白結合容量［5］. 聚合物接枝方法主要有兩種： 聚合物直接接枝（“grafting to”）和小分子單體接枝聚合（“grafting from”）［6］. “Grafting to”法是在基質上偶聯具有一定分子量的聚合物［7］. 其中，在交聯瓊脂糖基質上分別接枝葡聚糖［8］或聚乙烯亞胺（PEI）［9］，經過表面修飾得到陽離子層析介質和陰離子層析介質，其蛋白吸附容量相比于非接枝型介質可提升1倍以上.“Grafting from” 方法是單體在基質表面引發接枝聚合形成聚合物長鏈［10，11］，其位阻較小易形成較為均勻的接枝層［12］. 其中，原子轉移自由基聚合（ATRP）是grafting from 經典的接枝方法，該方法由于接枝的聚合物易控［13］而便于研究接枝鏈長度和接枝密度對蛋白結合容量的影響. 如，在纖維素基質［14］和瓊脂糖基質［15］表面分別引發帶負電荷的功能單體接枝聚合，制得的強陽離子交換層析介質的蛋白結合容量大幅度提升. 采用ATRP引發接枝，通常需要先用2-溴異丁酰溴在基質表面引入具有引發活性的基團［16］，該反應需要嚴格的無水環境［17］，而對于多孔微球尤其親水性較好的基質，其除水過程復雜，且需要大量的無水有機溶劑，因此在大規模進行層析介質生產中受到一定限制. 氧化還原引發接枝聚合的操作條件相對較為溫和［18］，基質表面的羥基常用作還原劑與氧化劑組成引發體系. 如Wang等［19］用硝酸鈰銨作為氧化劑，在纖維素基質（—OH 作為還原劑）上制備了弱陰離子交換介質，對牛血清白蛋白（BSA）的靜態結合容量比未接枝介質提升2倍. Machado 等［20］在聚（丙烯酰胺）基質上通過氧化還原法制備了陽離子交換介質，對乳白蛋白的吸附容量達到210 mg/mL.

綜上所述，當前研究多集中于以多糖微球為基質的離子交換介質，但多糖基質的孔徑較小，其孔道表面接枝聚合物長鏈后孔道尺寸會進一步降低，從而影響其對生物大分子的孔內傳質. 而以大孔聚合物微球為基質的孔道尺寸較大，表面接枝聚合物長鏈對孔道尺寸影響較小，能更好地提升該類介質的蛋白吸附容量. 基于此，本文以大孔聚丙烯酸酯類微球為基質，采用氧化還原引發體系在微球表面接枝甲基丙烯酸，研究了接枝聚合各因素對吸附容量的影響，建立了弱陽離子交換層析介質的制備方法，為該類層析介質的設計和應用提供了理論參考.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

大孔聚合物微球FastSep-epoxy（表面富含環氧基），北京博爾賽譜生物科技有限公司； 甲基丙烯酸（MAA），分析純，上海邁瑞爾化學技術有限公司； 考馬斯藍G-250、 過硫酸鉀（KPS）和三-（羥甲基） 氨基甲烷，分析純，北京伊諾凱科技有限公司； 溶菌酶（Lys），分析純，上海麥克林生化科技有限公司；CM Sepharose FF（瓊脂糖基質弱陽離子交換層析介質）購自于Cytiva公司； 十二烷基硫酸鈉，分析純，北京邁瑞達科技有限公司；N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，分析純，北京百靈威科技有限公司.

SHA-BA型水浴恒溫振蕩器（IS），金壇市榮華儀器制造有限公司； E1677型垂直混合儀（VM），寧波新芝生物科技股份有限公司； L5 型紫外-可見分光光度計（UV-Vis），上海儀電分析儀器有限公司；UPC10 AKTA 型自動純化系統（AKTA），美國GE 公司； 掃描電子顯微鏡（SEM），韓國COXEM 公司；TG16型臺式高速離心機（TMHSC），上海盧湘儀離心機儀器有限公司； Spectrum 100型傅里葉紅外光譜儀（FTIR），美國Perkin Elmer公司； Autopore IV 9500型壓汞儀（MIP），美國Micromeritics公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 弱陽離子交換層析介質的制備 大孔弱陽離子交換層析介質的制備過程如圖1所示. （1） Fast-Sep-epoxy 微球水解： 將 20 g 干燥恒重的大孔FastSep-epoxy 微球與200 mL 0.5 mol/L H2SO4加入500 mL錐形瓶中，反應10 h后，用去離子水洗滌至中性，標記為 FastSep-OH. （2） 接枝聚合甲基丙烯酸（MAA）單體： 取10 mL水解后的微球與一定量的甲基丙烯酸（MAA）混合并通入氮氣，加入一定量的過硫酸鉀（KPS），于35 ℃進行接枝聚合反應. 反應完畢將制得的微球用去離子水洗滌至中性，標記為 FastSep-PMAA.

Fig.1 Preparation of weak cation exchange chromatography medium

1.2.2 靜態結合容量測定 以Lys為模型蛋白，采用間歇式結合方法測定靜態結合容量（Static binding capacity，QSBC）［21］. 量取一定體積的FastSep-PMAA 微球，加入已知濃度蛋白溶液于離心管中（以170 r/min轉速吸附12 h），然后測定上層清液的吸光值（檢測波長280 nm），最后根據吸光值以及相應的標準曲線計算QSBC. 每組實驗重復3次取平均值.

式中：c0（mg/mL）為Lys溶液初始濃度；c1（mg/mL）為Lys溶液剩余濃度；V1（mL）為Lys溶液體積；V2（mL）為層析介質的體積.

1.2.3 離子交換容量測定 參照文獻［22］方法測定離子交換容量（Ion exchange capacity，QIC）. 取已知體積的介質用1.0 mol/L HCl 溶液進行轉型（30 min），然后將介質洗滌至中性，用標準NaOH 溶液中和介質，最后用標準HCl溶液滴定收集液，記錄體積. 采用下計算QIC. 每組實驗重復3次取平均值.

式中：cNaOH（mol/L）為NaOH 標準溶液濃度；cHCl（mol/L）為HCl 標準溶液濃度；VNaOH（mL）為NaOH 標準溶液體積；VHCl（mL）為HCl標準溶液體積；V球（mL）為微球體積.

1.2.4 動態結合容量測定 測定了不同介質的Lys動態結合容量（Dynamic binding capacity，QDBC）［3］，先用20 mmol/L PB緩沖溶液（pH=7.0）平衡層析柱（5.0 mm×30.0 mm）至基線平穩，設定流速為150 cm/h；然后開始進樣（3.0 mg/mL Lys溶液）并記錄橫坐標V1，待流穿10%時記錄橫坐標V2； 最后，用0.5 mol/L NaCl的PB緩沖溶液進行洗脫. 每組實驗重復3次取平均值.

式中：c（mg/mL）為蛋白液濃度；V1（mL）為蛋白進樣體積；V2（mL）為10%流穿體積；V球（mL）為微球體積.

1.2.5 不同鹽濃度、 pH 值下的QSBC測定 配制含有不同濃度NaCl（0.1～0.5 mol/L）以及不同pH 值（6.0～10.0）的PB緩沖溶液. 量取1.0 mL微球與已知濃度的Lys溶液混合. 按 1.2.2節方法測定不同鹽濃度、 pH值下的QSBC. 每組實驗重復3次取平均值.

1.2.6 溶菌酶回收率測定 測定了不同介質的Lys 回收率. 安裝層析柱（5.0 mm×30.0 mm）并通過1.0 mL定量環上樣3.0 mg/mL 的Lys 溶液（流速為150 cm/h），吸附5 min后，用0.5 mol/L NaCl 的PB洗脫液進行梯度洗脫. 積分計算洗脫峰面積A1與不經過層析柱空載峰面積A0. 每組實驗重復3次取平均值. 計算回收率R的公式如下：

式中：A0（mAU·min）為空載峰面積；A1（mAU·min）為洗脫峰面積.

1.2.7 純化雞卵清中的溶菌酶 取新鮮雞蛋內膜置于PB 緩沖溶液（pH=8.0）中浸泡24 h，取濾液備用［23］. 用緩沖溶液平衡層析柱（5.0 mm×30.0 mm）至基線平穩，設定流速為150 cm/h. 用A 泵進樣20 mL雞蛋清溶液，收集流穿液. 切換至B泵（緩沖溶液）待基線平穩后換為0.5 mol/L NaCl 的PB 溶液進行洗脫，收集洗脫液.

2 結果與討論

2.1 弱陽離子交換層析介質制備條件的優化

接枝聚合物的密度及鏈長是影響層析介質載量的重要因素，通常通過控制單體（MAA）的濃度、 引發劑（KPS）的濃度和反應溫度來實現對該參數的調控［24，14］. 本研究以QSBC為衡量參數，采用單一變量法對影響QSBC的各因素進行了系統考察.

2.1.1 單體濃度對QSBC的影響QSBC隨單體濃度的增加呈現先增加后下降的趨勢，其具體變化規律如圖2所示. 當單體濃度為 0.5 mol/L時，QSBC達到最大值（174.77 mg/mL）. 這是因為隨單體濃度增加，其反應速率加快，接枝量增加，所以QSBC值增加； 隨著單體濃度繼續增加，其單體自身均聚反應速率增加，嚴重阻礙了接枝反應的進行［25］，致使介質表面接枝量減小. 類似規律在巰基-過硫酸鉀氧化還原引發體系中也被觀察到，Liu等［26］將甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）接枝到羽毛表面，其接枝量隨單體濃度呈先上升后下降趨勢. 為獲得較高的蛋白結合容量，選擇單體濃度為0.5 mol/L.

Fig.2 Effect of monomer concentration on QSBC(cKPS=36.8 mmol/L , T=35 ℃)

2.1.2 KPS 濃度對QSBC的影響 引發劑濃度影響自由基聚合反應速率［27］，實驗中考察了氧化劑KPS濃度對介質QSBC的影響. 如圖3 所示，QSBC隨KPS 濃度的增加出現先上升后下降的趨勢，KPS 濃度為18.5 mmol/L時介質的QSBC最高為252.21 mg/mL. 究其原因是隨著KPS的濃度升高，溶液中的自由基濃度也增加，反應速率加快，導致接枝量升高，QSBC值增加； 繼續升高KPS濃度，反應體系中自由基濃度繼續增加，會使單體本身均聚反應比例增加，導致其接枝效率下降，因而介質的QSBC值下降，這一現象符合普通自由基接枝聚合的一般規律［28，29］.

Fig.3 Effect of KPS concentration on QSBC(cMAA=0.5 mol/L, T=35 ℃)

2.1.3 反應溫度對QSBC的影響 圖4為QSBC隨反應溫度增加的變化趨勢圖，可見QSBC隨溫度增加出現先增大后減少的趨勢. Mondal等［30］在研究棉纖維接枝聚合甲基丙烯酸（MAA）時也報道了這種趨勢. 在較低溫度（T＜35 ℃）時，隨著反應溫度的升高，其自由基濃度增加導致其接枝量增加，所以QSBC升高［31］；而當溫度繼續升高到一定程度（＞35 ℃）時，單體自身均聚的速率則會高于接枝聚合速率，導致接枝到基質上的聚合物數量減少，配基密度下降，進而致使SBC下降. 為獲得較高的蛋白吸附容量，選擇反應溫度為35 ℃.

Fig.4 Effect of reaction temperature on QSBCcMAA=0.5 mol/L, cKPS=18.5 mmol/L.

2.2 接枝前后微球的紅外光譜

通過紅外光譜表征了FastSep-epoxy 微球接枝前后的化學組成，結果如圖5 所示. FastSep-epoxy 微球在2966.3 cm-1處的吸收峰為C—H伸縮振動峰，1733.3和1201.7 cm-1處的吸收峰分別為C=O以及C—O特征吸收峰； FastSep-epoxy的環氧基經過水解后生成鄰羥基，從而制得FastSep-OH. 紅外譜圖中FastSep-OH 與FastSep-epoxy 相比，除了繼續保留FastSep-epoxy 的1733.3 cm-1（C=O）和1201.7 cm-1（C—O）特征吸收峰外，在3544.5 cm-1處出現新的羥基特征峰，證明已發生了開環反應； FastSep-PMAA與FastSep-OH 比較發現，在3544.5，1733.3 和1201.7 cm-1處的特征吸收峰均有所增強，主要來源于FastSep-PMAA 微球接枝PMAA 的大量—COOH，證明接枝聚合反應發生. 另外，由于羧基基團的締合作用［32］，使得羥基峰向低波數方向位移，導致3544.5～3200 cm-1處出現寬而散的特征峰，均為—COOH的典型特征吸收峰.

Fig.5 FTIR spectra of microspheres before and after methacrylic acid grafting

2.3 接枝前后介質的表面形貌及孔徑表征

通過SEM 觀察了大孔聚合物微球接枝前后表面形貌的變化，結果如圖6 所示. 圖6（A）～（C）為FastSep-OH微球的表面形貌照片，可見微球表面孔間連通性較好，孔徑尺寸為700～1000 nm. 圖6（D）～（F）示出了接枝后FastSep-PMAA微球的表面形貌，接枝后微球中的聚合物骨架尺寸增加，骨架間空隙增大，一方面表明已接枝聚甲基丙烯酸（PMAA），另一方面顯示出接枝的PMAA 對原微球的骨架有融合或增強作用. 接枝后的介質仍具有大孔結構，采用壓汞法對其平均孔徑尺寸變化情況進行了表征，結果如圖7 所示. 接枝后的FastSep-PMAA 與接枝前FastSep-OH 相比，其＜700 nm 的孔容部分明顯下降，孔隙率由88.5%下降至83.0%，同時其平均孔徑尺寸從（731.2±10） nm 增加到（978.14±10） nm，表明接枝PMAA 對孔徑尺寸較小的部分孔道影響較明顯，而對于＞700 nm 的孔道影響較小，該數據與SEM 表征結果一致. 介質中保留的大孔有利于大分子快速傳質，進而提高純化效率［33］.

Fig.6 Microsphere morphologies before(A—C) and after(D—F) grafting methacrylic acid

Fig.7 Distribution of pore size of medium before(a)and after(b) grafting

2.4 弱陽離子交換層析介質的色譜性能評價

離子交換容量（QIC）、 蛋白結合容量及分離效能等均為離子交換層析介質的重要表征參數，實驗中進行了詳細評價，考察了不同QIC的層析介質的色譜行為. 為便于分析，統一將評價介質命名為Fast-Sep-PMAA-n，其中n代表QIC.

2.4.1QIC對QSBC的影響QIC是離子交換層析介質的重要參數，其取決于介質表面的離子交換基團數量，本文中即介質上的羧基數量，通常該類介質的蛋白結合容量與其數量有直接關系. 對具有不同QIC的介質進行了評價，結果如圖8所示. 在0.429～0.461 mmol/mL的QIC范圍內，介質QSBC隨著QIC的增加而升高，主要原因是介質表面與蛋白質的結合位點隨著羧基的數量增加而增多，從而可以結合更多的蛋白. Sun 等［34］在瓊脂糖基質的微球上接枝PMAA 時，在QIC為0.130～0.680 mmol/mL 范圍內，蛋白吸附能力同樣隨QIC值增加而增大. FastSep-PMAA-0.461 的平均孔徑為（978.14±10） nm，QSBC為252.21 mg/mL，而聚合物基質的商品Fractogel?EMD COO-（M）［35］的平均孔徑為（80±10） nm，QSBC為100 mg/mL，自制介質平均孔徑遠大于Fractogel?EMD COO-（M），但其QSBC仍大于同類商品介質2.5 倍之多.

Fig.8 Effects of QIC on QSBC

2.4.2QIC對QDBC的影響QDBC是衡量離子交換層析介質蛋白吸附能力的重要參數［4，9］，該參數與QIC之間的關系如圖9 所示. 在0.429～0.461 mmol/mL 的IC 范圍內，QDBC隨著QIC的增加而增大. 通常QIC越高，介質上可供結合的吸附位點越多，則DBC 也隨之增加［20］. 這一規律與Zhao 等［36］制備的弱陽層析介質表現相似（相同IC 范圍），且在QIC近似的條件下，FastSep-PMAA-0.461 對溶菌酶的QDBC（157.25 mg/mL）略高于該文獻報道值（140 mg/mL）. 還發現存在臨界離子交換容量（cIC）現象（當QIC超過0.443 mmol/mL，其QDBC有很大程度的提升），其原因是當QIC值小于QcIC時，聚合物長鏈之間的距離較遠“鏈傳遞”現象難以發生，鏈的靈活性受到限制，所以QDBC較低； 當QIC超過QcIC值時，鏈間的距離縮短，有效促進“鏈傳遞”行為的發生，使得溶菌酶在層析介質的傳質速率極大提升，所以QDBC高［37，38］.

Fig.9 Effects of QIC on QDBC

另外，在相同流速下（150 cm/h）測試了FastSep-PMAA-0.461和商品 CM Sepharose FF［39］（該介質在交聯瓊脂糖基質上偶聯羧酸基團制備獲得）的QDBC，結果如圖10 所示，FastSep-PMAA-0.461 的QDBC值為157.25 mg/mL，與商品CM Sepharose FF（94.74 mg/mL）相比，QDBC高出65.9%.

Fig.10 Comparison of QDBC between CM Sepharose FF and FastSep-PMAA-0.461

2.4.3 鹽濃度對QSBC的影響 耐鹽型離子交換層析在高鹽濃度下保持較高的蛋白結合容量，可以免去對蛋白原料液稀釋的操作，不僅可以節約蛋白純化成本，還可最大化地保持蛋白的活性［40］.

改變平衡液的鹽濃度，測定了具有不同QIC的介質的QSBC，結果如圖11所示. 隨著鹽濃度的增加，介質FastSep-PMAA-0.429和FastSep-PMAA-0.443的QSBC呈現先增加后降低的趨勢，在PMAA接枝型介質對Lys的吸附中也有類似的現象［34］. 其增加的可能原因是隨著離子強度的增加，Lys進入層析介質的可利用孔體積也增加，蛋白質的空間位阻隨之明顯減弱［4］，所以在中低離子強度下SBC 有所提升； 在高鹽濃度下，其QSBC下降，可歸因于高離子強度的電荷屏蔽作用，從而降低了蛋白質與固定相上反應位點的靜電相互作用［41］，導致靜態結合量降低. 介質FastSep-PMAA-0.436，FastSep-PMAA-0.451 和FastSep-PMAA-0.461的QSBC隨著鹽濃度的升高而下降，其原因是離子強度增加其電荷屏蔽作用為主要影響因素，故未顯示出先增加后降低的規律. 總體來說，在QIC為0.429～0.461 mmol/mL 時，介質在0.2 mol/L的NaCl緩沖溶液中能保持100 mg/mL的蛋白結合容量，具有一定的耐鹽性能.

Fig.11 Effects of salt concentrations on QSBC

2.4.4 蛋白回收率的測定 回收率是評價層析介質的一個重要參數，尤其對于聚合物基質的層析介質而言，其骨架本身有一定的疏水性，如聚苯乙烯微球通常需要親水修飾后才可用于層析介質［42］. 而本文以聚丙烯酸酯類微球為基質，其基質本身具有較好的親水性，經過表面接枝水溶性的PMAA后，其對蛋白的非特異性吸附量達到了多糖基質水平. 不同QIC介質對蛋白回收率的測定結果如表1所示. 該類介質對Lys 回收率均在96%以上，稍高于商品瓊脂糖基質層析介質（CM Sepharose FF）的回收率（95.1±3.2）%［43］.

Table 1 Recoveries of Lys by different media

2.4.5 緩沖溶液pH值對QSBC的影響 pH值的變化不僅影響蛋白分子表面電荷數量，而且影響弱陽層析介質中功能基團（—COOH）的解離程度. 以FastSep-PMAA-0.436介質為研究對象，測定了其在不同pH緩沖溶液中的QSBC. 結果表明，QSBC隨pH升高先增加后保持不變（圖12）. 究其原因是： 在水溶液中，隨pH值增加—COOH的解離程度提高［21］，當pH值=8時，—COOH的解離程度達到99%，解離程度越高則蛋白吸附能力增加，所以其QSBC隨pH值升高而增加，隨著pH值繼續升高，此時羧酸分子全部解離，蛋白吸附位點數量并未繼續增加，同時緩沖溶液pH值越接近溶菌酶的等電點（pI=10.7），其表面凈電荷量相應減少，二者均影響SBC，故QSBC隨pH增加不再繼續增加.

Fig.12 Effect of pH on QSBC

2.4.6 分離性能評價 溶菌酶作為一種抗菌蛋白在食品貯藏等方面發揮著重要作用，它在雞卵清中含量豐富（占蛋清總量的3.5%）［44］. 在雞卵清中除溶菌酶（pI=10.7）為堿性蛋白外，其它蛋白多為酸性蛋白，如卵蛋白（pI=4.0）、 雞蛋白蛋白（pI=4.6）和卵轉鐵蛋白（pI=6.6），可通過陽離子交換層析介質容易將其與溶菌酶分離［45］.實驗中以FastSep-PMAA-0.461 作為研究對象，分離純化了雞蛋清溶液中的溶菌酶，其分離譜圖如圖13 所示. 對圖13 中的流穿峰和洗脫峰分別進行收集，采用12%的SDSPAGE 凝膠電泳［46］對其成分進行分析，結果如圖14所示，可見流穿峰中不含有溶菌酶，洗脫峰中除溶菌酶外不含有其它雜蛋白，表明利用制備的弱陽離子層析介質完成了對雞蛋清溶液中溶菌酶的分離，具有較好的分離純化能力.

Fig.13 Chromatographic diagram of egg white by FastSep-PMAA-0.461

Fig.14 SDS-PAGE analysis of lysozyme isolated from egg white using FastSep-PMAA-0.461Lane 1. molecular weight marker； lane 2. bovine serum albumin（BSA）；lane 3. lysozyme（Lys）； lane 4. egg white solution； lane 5. flow- through；lane 6. elution； lane 7. molecular weight marker.

3 結 論

以大孔聚丙烯酸酯類微球為基質，通過氧化還原引發表面接枝聚合，制備了大孔弱陽離子交換層析介質. 系統研究了接枝聚合的各影響因素，包括單體濃度、 引發劑濃度及反應溫度等因素，發現該類介質的蛋白結合容量與IC密切相關.QSBC和QDBC均隨QIC的增加而增加.QIC達到0.461 mmol/mL 時，QSBC為252.21 mg/mL，QDBC為157.25 mg/mL.QIC對介質的耐鹽性有一定影響，在QIC為0.429～0.461 mmol/mL 時，介質在0.2 mol/L 的NaCl 緩沖溶液中能保持100 mg/mL 的蛋白結合容量. 另外，QSBC值隨蛋白緩沖液的pH值增加先增加后保持不變以及不同QIC的弱陽層析介質蛋白回收率均大于96%. 將制備的介質用于雞蛋清中溶菌酶的分離純化，一步純化即可獲得較高純度，該類介質在蛋白等生物大分子分離純化領域具有較好的應用前景.