黑色素瘤外泌體基因的差異分析和ceRNA網絡構建

王嘯云 楊健康

摘要：目的? 分析黑色素瘤（MEL）和健康人外周血外泌體差異表達基因，構建競爭性內源RNA（CeRNA）網絡，尋找MEL新的分子機制。方法? 從exoRBase 2.0外泌體數據庫中下載21例黑色素瘤病人和118名健康人外周血RNA表達數據譜（包括mRNA、lncRNA和circRNA），利用R的limma包和Cytoscape軟件找出差異表達基因，預測miRNA后構建CeRNA網絡并可視化，并對CeRNA網絡中的mRNA進行GO富集分析。結果? 篩選出138個差異表達mRNA，135個差異表達lncRNA和33個差異表達circRNA。通過構建CeRNA網絡發現，mRNA、lncRNA和circRNA競爭性地結合miRNA，且與miRNA相結合的circRNA表達均下調，mRNA表達大多下調，而lncRNA的表達則大多數呈現上調的趨勢。CeRNA網絡中的差異表達mRNA GO富集分析顯示，這些基因主要與mRNA分解代謝過程的調節等相關。結論? 健康人群和MEL患者外周血外泌體具有顯著差異性，且mRNA、lncRNA和circRNA可以競爭性地與MEL相關的miRNA結合，實現相互調控。這些CeRNA基因為進一步研究MEL發生發展提供了分子基礎，為MEL早期檢查和治療提供新靶點。

關鍵詞：黑色素瘤；外泌體；差異表達基因

中圖分類號：R739.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.002

文章編號：1006-1959（2024）04-0008-06

Expression of Exosomal Genes in Melanoma and Construction of ceRNA Network

WANG Xiao-yun，YANG Jian-kang

（School of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

Abstract：Objective? To investigate the novel molecular mechanism of melanoma （MEL） exosomes by analyzing differentially expressed genes and constructing a competing endogenous RNA （CeRNA） network.Methods? The RNA expression profiles （including mRNA， lncRNA and circRNA） of peripheral blood from 21 melanoma patients and 118 healthy people were downloaded from the exoRBase 2.0 exosome database. The differentially expressed genes were identified by R's limma package and Cytoscape software. After predicting miRNAs， the CeRNA network was constructed and visualized， and the mRNAs in the CeRNA network were subjected to GO enrichment analysis.Results? A total of 138 differentially expressed mRNAs， 135 differentially expressed lncRNAs and 33 differentially expressed circRNAs were screened. Through the construction of CeRNA network， it was found that mRNA， lncRNA and circRNA competitively bind to miRNA， and the expression of circRNA combined with miRNA was down-regulated. The expression of mRNA was mostly down-regulated， while the expression of lncRNA was mostly up-regulated. GO enrichment analysis of differentially expressed mRNAs in the CeRNA network showed that these genes were mainly related to the regulation of mRNA catabolic processes.Conclusion? There are significant differences in peripheral blood exosomes between healthy people and MEL patients， and mRNA， lncRNA and circRNA can competitively bind to MEL-related miRNAs to achieve mutual regulation. These CeRNA genes provide a molecular basis for further study of the occurrence and development of MEL， and provide new targets for early detection and treatment of MEL.

Key words：Melanoma;Exosomes;Differentially expressed genes

黑色素瘤（melanoma）是一種由黑色素細胞發展而來的惡性腫瘤，多發于皮膚，存在年齡和人種差異，好發于成人，并在白種人中最為常見，男性發病率和死亡率均高于女性[1]。黑色素瘤有多種危險因素，長期日光暴露即暴露于紫外線會增加患黑色素瘤的風險，黑素細胞痣的數量、家族史和遺傳易感性也是黑色素瘤的重要風險因素[2]。組織活檢是黑色素瘤診斷的金標準。外科手術治療以及必要時配合術后靶向藥物及免疫治療是治療黑色素瘤的有效方法。外泌體（exosome）是由細胞內多泡體與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質中的膜性囊泡，可以將多種物質運送到靶細胞，包括蛋白質、DNA和RNA等，其在腫瘤發生發展階段起著重要的作用，如腫瘤微環境的形成、血管生成、腫瘤細胞遷移和侵襲等。本研究利用exoRBase 2.0數據庫、TargetScan數據庫、miRanda數據庫、miRcode數據庫和ENCORI數據庫，通過尋找黑色素瘤外泌體差異表達RNA、構建競爭性內源RNA（Competingendogenous RNA，ceRNA）網絡和功能分析，分析黑色素瘤外泌體相關信使RNA（mRNA）、長非編碼RNA（lncRNA）和環狀RNA（circRNA）以及三者之間的相互作用關系，以期為早期檢測和治療黑色素瘤提供更多參考數據。

1資料與方法

1.1數據下載? 從exoRBase 2.0數據庫（http：//www.exorbase.org/）中下載21例黑色素瘤患者和118名健康人樣本外泌體RNA數據，其中包括circRNA，lncRNA和mRNA表達數據，所有的樣本均由人類血液外泌體的轉錄組測序技術（RNA sequencing，RNA-seq）數據分析所得，在此基礎上進行數據分析。

1.2差異表達基因（DEGs）篩選? 使用R 4.2.2軟件對表達譜數據進行分析，使用R中limma包和sva包篩選出DEGs。當log2FC>0且P<0.05時認為RNA是差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）（包括DEmRNAs、DElncRNAs和DEcircRNAs），當log2FC>2時為顯著差異基因。使用pheatmap包進行DEGs熱圖繪制。

1.3 miRNA預測及競爭性內源RNA網絡構建? 使用TargetScan數據庫（https：//www.targetscan.org/vert_80/）和miRanda數據庫（http：//cbio.mskcc.org/microrna_data/miRanda-aug2010.tar.gz）對mRNA對應的miRNA進行預測，使用miRcode數據庫（http：//www.mircode.org/）對lncRNA對應的miRNA進行預測，使用ENCORI數據庫（https：//rnasysu.com/encori/）對circRNA對應的miRNA進行預測。根據預測的miRNA結果使用Cytoscape 3.10.0軟件對所得到的對應結果進行競爭性內源RNA（CeRNA）網絡構建并將結果進行可視化。

1.4功能富集分析? 采用基因本體論（gene ontology，GO）分析對差異表達基因中的mRNA進行分析，其中包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）3個部分。利用R中clusterProfiler、enrichplot和ggplot2對差異mRNA進行顯著性分析和所得結果可視化。

2結果

2.1 DEGs篩選? 通過對比exoRBase 2.0數據庫中的黑色素瘤患者和健康人血液外泌體表達譜數據，篩選出差異表達mRNA 138個，其中35個基因下調，有3個基因顯著下調，包括PABPC1L2B、NR3C1、MTNR1A；103個基因上調，有50個基因顯著上調。分析得到135個差異lncRNA，15個下調，其中AC022596.1顯著下調；在120個上調lncRNA中有48個顯著上調。33個差異circRNA均下調但沒有顯著下調的circRNA。DEGs熱圖見圖1。

2.2競爭性內源RNA網絡構建? 使用TargetScan、miRanda、miRcode和ENCORI數據庫預測與miRNA結合的3種RNA，分別找到mRNA 9個、lncRNA 12個、circRNA 9個可以與miRNA結合。使用Cytoscape軟件對所得到的網絡進行構建（圖2），結果顯示與miRNA相關聯的circRNA表達均下調，mRNA大多下調，而相連的lncRNA則大多上調。

2.3功能富集分析結果? 由于mRNA結果較少，本研究只進行了GO富集分析，且結果顯示差異表達基因富集的生物學過程（BP）主要包括核轉錄mRNA分解代謝過程的調節（regulation of nuclear-transcribed mRNA catabolic process）、mRNA代謝過程的調控（regulation of mRNA metabolic process）和核轉錄mRNA分解代謝過程（nuclear-transcribed mRNA catabolic process）等；差異表達基因富集的細胞組分（CC）主要包括胞質核糖核蛋白顆粒（cytoplasmic ribonucleoprotein granule）、核糖核蛋白體（ribonucleoprotein granule）和胞質應激顆粒（cytoplasmic stress granule）等；差異表達基因富集的分子功能（MF）主要包括miRNA結合（miRNA binding）、核心啟動子序列特異性DNA結合（core promoter sequence-specific DNA binding）和RNA結合的調節（regulatory RNA binding）等，見圖3。

3討論

黑色素瘤是一種侵襲性強且預后較差的惡性腫瘤，亞洲人常見的黑色素瘤發病部位主要位于四肢，與基因突變相關的可能性較大[2，3]。有文獻報道稱[4]，黑色素瘤與BRAF、NRAS、NF1等基因突變相關。外泌體是由細胞分泌的外囊泡，內含有蛋白質、DNA、RNA等多種生物活性物質。外泌體與免疫反應、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞神經系統相關疾病和癌癥進展有關。信使RNA（mRNA）是蛋白質合成的模板，本研究通過GO富集分析發現，黑色素瘤差異表達mRNA主要與mRNA分解代謝和翻譯過程的調控等過程相關。長非編碼RNA（LncRNA）是一類轉錄長度超過200 nt的非編碼RNA，缺乏蛋白質編碼能力，但可以在轉錄和表觀遺傳方面調節基因表達。LncRNA已被證實是原癌基因、癌基因和轉移轉化的驅動因子[5]。作為內源RNA（ceRNA），lncRNA與海綿微小RNA（miRNA）競爭以調節基因表達。microRNA（miRNA）是包含21～23個核苷酸的小單鏈非編碼RNA分子，參與各種生物學過程，如細胞分化、炎癥反應和氧化應激[6，7]。此外，miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體降解mRNA或阻礙其翻譯來參與RNA沉默和基因表達的轉錄后調節[8，9]。

本研究篩選出9個mRNA參與構建CeRNA網絡，異質核糖核蛋白K（hnRNPK）是編碼核酸結合蛋白的mRNA。有研究表明[10]，在黑色素瘤細胞中hnRNPK的過表達可以增強細胞侵襲和遷移的能力，hnRNPK調節的LINC 00263通過充當miR-147a誘餌并因此上調CAPN2，從而影響黑色素瘤的惡性程度。真核翻譯起始因子4B（EIF4B）編碼的蛋白質參與真核翻譯起始因子4F復合物的組裝和翻譯預起始復合物的形成，在BRAF突變的黑色素瘤中，EIF4B通過翻譯促進ATF4表達，從而影響黑色素瘤細胞的存活[11，12]。Y盒結合蛋白1可編碼同時具有DNA和RNA結合蛋白功能的蛋白質，并且與許多細胞過程有關，包括轉錄和翻譯的調節、前mRNA剪接、DNA修復和mRNA包裝。有研究發現[13]，敲低YBX1可以降低NOTCH3的表達，從而抑制黑色素瘤細胞的遷移和侵襲能力，而BASP1-AS1與YBX1相互作用可以啟動NOTCH3轉錄過程，從而導致多個癌基因的轉錄（c-MYC、PCNA等），進而促進黑色素瘤發展。

KCNQ1重疊轉錄本1（KCNQ1OT1）是在KCNQ1位點中發現的長非編碼RNA基因，在結直腸癌、卵巢癌、膠質瘤等多種癌癥中表達水平發生變化，導致腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和耐藥性等變化[14]。有文獻報道稱[15]，KCNQ1OT1在黑色素瘤患者組織中表達增加，可促進黑色素瘤細胞的增殖和遷移；KCNQ1OT1通過與miR-153直接結合充當競爭性內源RNA以抑制MET原癌基因表達；KCNQ1OT1表達水平高的患者的總體生存率低于表達水平低的患者。本研究通過分析lncRNA-miRNA網絡發現，KCNQ1OT1可與miR-125b-5p和miR-137結合。miR-125b-5p在各種腫瘤組織中低表達并充當腫瘤抑制劑。Chen P等[16]研究表明，在卵巢組織中KCNQ1OT1高表達，miR-125b-5p低表達，KCNQ1OT1通過結合miR-125b-5p促進卵巢癌細胞增殖和轉移，且KCNQ1OT1通過miR-125b-5p/CD147軸促進卵巢癌進展。miR-137位于人類染色體1p22上，通過細胞周期控制在幾種癌癥類型中充當腫瘤抑制因子，包括鼻咽癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌和黑色素瘤[17-19]。研究表明[20]，敲低KCNQ1OT1可增加巨噬細胞miR-137水平，降低腫瘤壞死因子α誘導蛋白1表達，抑制炎癥反應，減輕氧化應激。

母系表達基因3（MEG3）是一種母系表達的印跡長非編碼RNA基因，其作為腫瘤細胞中的生長抑制因子，如MEG3的過表達通過調節miR-184的表達顯著抑制慢性粒細胞白血病細胞的生長和侵襲[21-23]。在黑色素瘤中，MEG3表達明顯減少；MEG3上調可誘導黑色素瘤細胞凋亡，抑制侵襲和遷移能力，阻斷Wnt信號通路抑制黑色素瘤的發展[24]。MEG3可直接調節以下軸：miR-499- 5 p/CYLD賴氨酸63去泛素酶和miR-21/E-鈣粘蛋白[23，25]。CYLD是多種致癌途徑的負調節因子，E-鈣粘蛋白增強細胞間相互作用，從而預防轉移[26-29]。miR-27a水平的增加抑制Th 1和Th 17細胞的分化并促進黑素瘤細胞的生長[30]。本研究通過分析lncRNA-miRNA網絡發現，MEG3可以與miR-27a-3p結合。MEG3-miRNA-27a-3p在癌癥中的作用尚未報道，但有研究發現[31]，MEG3的過表達可以增強IGF1的表達、抑制miRNA-27a-3p的表達，進而促進成骨分化。

綜上所述，與健康人相比，黑色素瘤患者外周血外泌體中多種RNA具有顯著差異，并且可與miRNA相互作用，從而影響黑色素瘤發生發展的生物學過程，這些發現為進一步研究黑色素瘤發生發展提供了分子生物學基礎。

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收稿日期：2023-08-22；修回日期：2023-09-06

編輯/杜帆