非聚焦超聲生物學效應應用研究

代皓天 任濤

摘要：近年來，隨著聲動力療法等新技術的興起，非聚焦超聲生物學效應在醫學治療方面的運用漸漸得到人們的關注。本文對非聚焦超聲生物學效應在腫瘤治療、打開人體免疫屏障、神經調節、創傷治療等醫學治療方面的應用進行了綜述，以期為非聚焦超聲生物學效應轉化為醫學治療應用提供參考。

關鍵詞：非聚焦超聲；腫瘤治療；免疫屏障；經顱超聲刺激；創傷治療

中圖分類號：R454.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.033

文章編號：1006-1959（2024）04-0168-06

Research on the Application of Biological Effects of Non-focused Ultrasound

DAI Hao-tian，REN Tao

（Department of Respiratory and Clinical Care Medicine，Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated

to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200233，China）

Abstract：In recent years， with the rise of new technologies such as sonodynamic therapy， the biological effects of non-focused ultrasound in medical treatment has gradually gained attention. This article reviews the application of biological effects of non-focused ultrasound in medical treatment such as tumor treatment， opening human immune barrier， neuromodulation， and trauma treatment， in order to provide a reference for the transformation of biological effects of non-focused ultrasound into medical treatment applications.

Key words：Non-focused ultrasound;Tumor treatment;Immune barrier;Transcranial ultrasound stimulation;Trauma treatment

超聲波是一種頻率高于20 000赫茲的聲波，因其頻率下限超過人的聽覺上限而得名。在生物體內傳播過程中，超聲波既會受到機體組織結構的影響而產生不同類型的回波，也可能會對機體組織的功能和結構產生不同程度的影響。后者被稱為超聲的生物學效應，是超聲應用于醫學治療的理論基礎。自1950年代首次應用于醫學以來，超聲已從傳感和診斷工具發展為具有廣泛應用的治療工具，例如調節組織電生理、打開人體免疫屏障、藥物輸送和組織消融。超聲分為聚焦超聲（focused ultrasound，FUS）和非聚焦超聲（unfocused ultrasound/non-focused ultrasound，UFUS/NFUS）。據報道[1]，聚焦超聲，尤其是高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）作為新興非侵入性治療手段，在實體腫瘤治療方面大放異彩，而非聚焦超聲生物學效應在醫學治療方面的運用也漸漸得到人們的關注。本文對近年來國內外有關UFUS生物學效應有關的研究進行了分析，綜述相關方法的原理及應用情況，以期為UFUS生物學效應轉化為醫學治療應用提供參考。

1腫瘤治療

近年來，隨著HIFU等非診斷性超聲技術的發展，人們開始關注非診斷性超聲的治療效果，UFUS腫瘤治療的研究也日益增多。以前認為UFUS對腫瘤治療作用主要是通過超聲熱效應，例如Samarbakhsh A等[2]報道了溫和的超聲熱效應可以選擇性地破壞快速分裂的細胞，阻止惡性腦腫瘤中的過度有絲分裂。聲動力療法（Sonodynamic therapy， SDT）是一種較新的微創抗腫瘤療法，涉及化學聲敏劑和UFUS。通過應用聲敏劑，UFUS干擾癌細胞功能的機制能得到進一步放大，并且聯用多種化學聲敏劑將產生顯著的協同效應，可以有效地破壞腫瘤生長，誘導細胞死亡，引發免疫反應。同時，SDT還能改善抗腫瘤藥物進入腫瘤細胞的效率。因此，SDT治療目前備受關注，未來可與靶向治療或免疫治療相結合形成雙靶向治療方案。

在SDT中，聲敏劑被相對低強度的UFUS激活，發揮細胞殺傷作用?？栈饔檬荢DT的主要機制[3]，是指存在于液體中的微氣核空化泡在聲波的作用下振動，當聲壓達到一定值時發生的生長和崩潰的動力學過程?？栈饔脷[瘤細胞主要依靠微泡震蕩坍塌產生的活性氧、高熱作用和機械剪切力[4]?？栈饔卯a生的高水平活性氧可使細胞不同水平氧化應激，繼而引起細胞凋亡等進程?？栈饔冒l生時，處于膨脹階段的微泡劇烈振蕩。當達到共振大小時，微泡快速擴大并最終爆破崩潰，微環境中會產生高壓高溫的沖擊波。由于空化作用中微泡的振蕩運動，在微泡附近流體的快速運動可產生高剪切力，從而對細胞膜造成瞬時損傷。

聲孔作用/聲基因轉染（sonoporation/sonotransfection）是一種腫瘤基因治療物理方法，被認為是SDT改善藥物細胞轉移效率的關鍵機制。超聲波能刺激細胞半透膜的彌散過程，有利于目標物質進入細胞內部。超聲轉染因良好的效果可以替代基因轉染的其他非病毒方法（例如電穿孔轉染、脂質體轉染）。通過基因轉移，基因在沒有細胞損傷的情況下被傳遞。超聲誘導的細胞膜通透性變化與空化作用密切相關?？栈饔檬辜毎ど闲纬煽赡姘伎?，從而使基因、藥物和大分子進入細胞，并可因此引起細胞對轉染分子的轉胞吞作用。如Rizzitelli S等[5，6]在MRI下通過SDT引爆脂質微泡，將阿霉素送入腫瘤組織中。Karki A等[7]通過UFUS成功將siRNA轉染入傳統轉染難度大的原代T細胞。Feril LB Jr等[8]對HeLa、PC-3、U937，Meth A、T-24這5種細胞系使用UFUS進行基因轉染發現，不論細胞系轉染效率高低，超聲轉染效率均優于電穿孔轉染和脂質體轉染。腫瘤組織中的間質液壓力（interstitial fluid pressure，IFP）明顯高于正常組織，從而阻礙了藥物進入腫瘤組織。Zhang Q等[9]發現，通過SDT治療可降低腫瘤組織的IFP，使藥物更好進入腫瘤組織。

SDT可以通過靶向腫瘤微環境和腫瘤細胞，作用于浸潤的免疫細胞和腫瘤細胞來增強免疫原性；通過多種機制增強抗腫瘤活性，促進腫瘤中M2巨噬細胞向M1巨噬細胞的轉變[10]。M1巨噬細胞通過分泌促炎細胞因子負責炎癥過程，并在抗腫瘤活性中發揮作用。M2巨噬細胞抑制炎癥反應，促進免疫抑制并參與腫瘤進展。惡性神經膠質瘤被M2小膠質細胞/巨噬細胞浸潤，SDT能使M2巨噬細胞轉化為M1巨噬細胞，延緩腫瘤進展。也有報道稱[11]，SDT處理的小鼠體內樹突狀細胞成熟標志物CD68和CD80的表達水平顯著升高，表明SDT可能促進樹突狀細胞成熟并增強抗腫瘤免疫力。

通過微泡和UFUS的協同作用，已有研究表明[4]，SDT對前列腺癌、膠質瘤、胰管腺癌等疾病療效顯著，這表明SDT可以成為一些目前尚無足夠治療方法的腫瘤的新備選方案。然而，UFUS的生物效應機制非常復雜，局限性在于尚未明晰只將必要有益的效應應用到目標治療區域的方法。因此，有必要對UFUS治療腫瘤的療法進行進一步的研究，開發新的UFUS控制技術。這些新療法有可能在改善當前治療策略的同時保證癌癥患者的生活質量，未來有望與靶向治療、免疫治療等其他療法聯合使用，成為治療目前無法治愈的腫瘤的支柱療法。

2人體免疫屏障

UFUS最特別的生物學效應是開放人體免疫屏障，如血腦屏障（blood brain barrier，BBB）、血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）等。BBB和BTB雖然能防止自體免疫反應的發生、維持組織內環境穩定，但在疾病發生時同樣能成為藥物進入組織的阻礙。在任何特定頻率下，熱能或熱量，以及任何生理或病理效應都取決于所傳遞的超聲波的強度、持續時間和脈沖寬度，以及超聲波通過的組織的特定特性。在極端水平下，超聲波導致的過度熱效應和空化作用會損壞細胞和組織。穩定的空化作用產生的機械力是安全有效地打開BBB的關鍵因素[12]?？栈饔每蓪е卵鼙诘臋C械拉伸，并因此使免疫屏障開放。與聚焦超聲不同，借助微泡造影劑的UFUS可以打開整個大腦的BBB，使大腦成像和廣泛腦部藥物輸送作用更強大。

目前利用UFUS打開免疫屏障的技術主要為超聲介導載藥微泡靶向藥物釋放（ultrasound-targeted drug-loaded microbubbles destruction，UTMD）。UTMD利用了微泡保護藥物有效載荷不被酶破壞的特性，能實現靶向局部給藥和緩釋的作用，幫助藥物進入免疫屏障。Howles GP等[13]使用小鼠作為模型，在UTMD的幫助下成功打開了BBB。另外，Beccaria K等[14]使用新西蘭白兔和比格犬作為模型，在動物顱骨鉆孔、植入超聲換能器，同樣使用UTMD的方法，短暫而多次地打開了BBB。雖然UFUS照射的組織產生了中度水腫，但組織并沒有出血或缺血的癥狀。而Kyle A[15]則使用靈長類動物非洲綠猴作為模型、無輔助劑的非聚焦超聲技術完成了此項研究，并提出了此項技術潛在的風險——出血增加。用于打開血腦屏障的超聲處理可能會導致紅細胞外滲，進一步導致組織瘀斑出血、大面積出血、壞死和凋亡。該研究認為，出血是由BBB破壞和神經毒性劑組織纖溶酶原激活劑（tissue Plasminogen Activator，tPA）傳遞至腦實質引起的。Li Y等[16，17]使用UFUS打開小鼠的BTB，并將其效果與陰囊熱應激效果作對比。在43 ℃熱應激條件下觀測到輸送至輸精小管的大分子數量增加。雖然在UFUS組尚未觀測到上述結果，但UFUS是更溫和、更快速的血睪屏障開放方法。在這些研究基礎上，Beccaria K等[18]、Yao L等[19]不僅利用UFUS打開小鼠血腦屏障，并且對進入血腦屏障的藥物濃度進行進一步監測。結果顯示，負載熒光探針的納米顆粒在血腦屏障被打開后在腦部的富集上升非常顯著。

傳統通過滲透壓或緩激肽、細胞因子介導全局BBB開放的方法需要侵入性頸動脈內注射，并且BBB緊密連接被破壞，只有小于20 nm的藥物能通過打開的BBB。UTMD可通過類似聲基因轉染的轉胞吞作用促進較大的納米顆粒穿過BBB。綜上所述，UTMD技術的特點在于經顱執行、用時短、組件易于準備、打開范圍廣、組織學損傷小、可逆（4 h內可恢復）、不需要危險的頸動脈內注射。UFUS可以有效地打開BBB，改善納米粒子的腦遞送效率?？梢灶A見，UTMD將成為有前途的納米級腦疾病治療應用技術。

3經顱超聲刺激

經顱超聲刺激（transcranial ultrasound stimulation，TUS）是近年開始流行的一種非侵入性神經調節形式。有研究顯示[20，21]，針對動物特定大腦區域的低水平超聲會改變動物行為、電生理學和突觸可塑性。例如針對小鼠運動皮層，超聲刺激會引起小鼠爪運動，而皮層結構或功能沒有檢測到變化[20]。經顱UFUS反復暴露可以影響視覺皮層誘導人體產生光幻視[22]?；诖丝梢哉J為，超聲波能調節神經元活動，可能包括高級認知和意識相關的大腦活動。

近年來，聚焦于TUS的人體研究數迅速增加。例如，慢性疼痛患者接受TUS后10 min和40 min的主觀情緒相較于接受安慰劑的對照組有所改善[23]。TUS對于人體的安全性已經得到證實，研究者招募健康受試者以及罹患神經和精神疾?。òㄒ钟舭Y、癲癇、癡呆、慢性疼痛）的患者進行TUS研究，僅有3%的個體報告了輕度或中度癥狀，包括頭痛、情緒惡化、頭皮發熱、認知問題、頸部疼痛、肌肉抽搐、焦慮、嗜睡和瘙癢，沒有受試者報告嚴重副作用[24]。

TUS的神經調節作用可能是興奮性或抑制性的，具體取決于UFUS的參數。對于外周神經元，具有較短脈沖時間的超聲波傾向于激活動作電位速度和幅度，而較長的脈沖則傾向于抑制[25]。在較低水平下，例如在參數為5.7 MHz和280 mW/cm2的超聲暴露下，超聲波可以通過機械振動刺激或抑制可興奮組織，而不會檢測到機械損傷或加熱效應[23]。類似的研究有Fomenko A等[26]以低強度500 kHz的頻率UFUS進行TUS，抑制了健康受試者大腦運動皮層的運動誘發電位，而Gibson BC等[27]以1～5 MHz的頻率TUS使時健康受試者運動皮層興奮性增加了33.7%（P=0.009），11 min后興奮性與基線不再有顯著差異。這表明TUS系統可用作改變初級運動皮層活動的神經調節工具。

UFUS調節神經元活動的機制尚不清楚。目前主流的觀點涉及神經元膜和周圍流體環境的粘彈性特性[28]，通過對電壓門控通道和拉伸敏感受體的影響改變膜動作電位[29]以及TUS直接作用于細胞骨架的主要成分，即固態神經元內微管[23]。微管與突觸可塑性密切相關，且神經可塑性是許多神經行為過程的基礎，包括學習和記憶[27]。因此，TUS可能可以成為安全的調節治療多種精神和神經系統疾病的非侵入性工具。未來需要更多的研究探究TUS的神經生理機制，改進靶向限制以及優化TUS協議。

4創傷治療

UFUS的另一大治療應用是利用熱學作用治療創傷。超聲的熱學作用既能殺死目標細胞，也能改善病灶部位的血液循環，加快細胞的新陳代謝，改善局部組織營養，增強酶活力，從而加快病灶的愈合。肝創傷止血治療研究中有HIFU、射頻或微波熱凝固止血等方法。然而，盡管這些方法效果確切，但也存在一些缺點，比如電離輻射、熱損傷正常組織、儀器設備體積大等。受HIFU焦點的影響，HIFU治療時采用點狀連續治療，耗時相對較長，對正常肝組織也會因熱效應和空化效應造成損傷甚至壞死。而UFUS作用溫和，治療副作用更小，治療速度更快。Zhao DW等[30]報道，在較低功率時，微泡增強的UFUS即可實現肝臟創傷的快速和有效止血，并且治療后血流灌注恢復快；微泡增強的UFUS不會對機體自身的凝血系統造成明顯影響，但凝血系統的存在起到了增強止血效果的作用；微泡增強的UFUS對肝小葉微血管以及肝細胞的內部結構會造成了一定的損傷，并可導致治療區及周圍肝細胞的凋亡，但并未對血清肝酶造成長期的影響，在病理損傷上也較HIFU治療輕。Luo Y等[31]使用UFUS照射SD大鼠胃潰瘍，結果表明經超聲輻照組的大鼠潰瘍消失率更高，平均潰瘍指數更小。病理切片顯示經超聲輻照后的大鼠潰瘍愈合更好，經超聲輻照后防御因子血清NO含量更快達到峰值，說明低強度非聚焦脈沖超聲波能夠促進鼠胃潰瘍的愈合，其效果甚至優于雷尼替丁。

UFUS止血的作用主要來源于空化效應和機械效應損傷和阻斷微血管，還可能與凝血系統有關?？栈梢允怪委焻^域的血流灌注明顯受阻，但是也造成細胞發生超微結構損傷，這種損傷可能啟動凝血機制，而進一步阻斷血流灌注而增強止血效應[32]。Zhao DW等[30]的研究中，微泡加強UFUS組的APTT和R值較其余各組明顯延長，說明機體自身的凝血系統被成功激活。單純UFUS組、單純微泡組和對照組之間的APTT和R值無明顯差異，說明機體全身的凝血功能沒有因超聲微泡的引入和空化效應對血管的損傷而出現明顯的變化。單純微泡組和對照組在治療后仍可見創傷灶有明顯活動性出血，說明單純的微泡注射治療和機體自身凝血系統的單純作用都不能達到有效的創傷止血目的。

UFUS可與HIFU等技術聯用以尋求更好的治療效果，因為UFUS可以通過微泡造影劑輔助作為檢測創傷出血口的工具從而指導HIFU技術治療，減少HIFU暴露時間。綜上所述，UFUS是治療創傷的一大有力備選工具，具有簡單、快速、安全、作用溫和的特點，期待未來有更多的研究關注UFUS的治療創傷作用，闡明UFUS的治療機制。

5非聚焦超聲在其他方面治療的應用

除去上述非聚焦超聲的主要研究的4個方向，非聚焦超聲在許多其他方面有應用，盡管部分研究仍處于起步階段。UFUS傳統就用于美容，Levi A等[33]、Verner I等[34]報道顯示，UFUS可以安全地治療頑固的皮下脂肪沉積、脂肪瘤。UFUS通過對脂肪細胞膜的反復拉伸-放松作用，改變膜的通透性從而使脂肪釋放。治療30日后，受試者除游離脂肪酸水平外，未檢測到血液和尿液分析物中生化標志物的明顯變化以及炎癥和組織修復的跡象，這表明從治療部位釋放的脂肪是通過身體自然代謝清除的。UFUS可以安全地通過人體自然代謝達到美容的效果。

Suares Castellanos I等[35]報道顯示，UFUS能刺激大鼠胰島β細胞分泌胰島素。800 kHz的UFUS引起的β細胞釋放的胰島素與天然促分泌素葡萄糖的釋放程度相當，說明UFUS的促分泌作用在細胞的生理分泌能力范圍內。這個過程可能是超聲波引起的鈣瞬變和隨后觸發胰島素囊泡胞吐作用的結果。胰島素以鈣依賴性方式從胰腺β細胞分泌，其中鈣流入是葡萄糖刺激的胰島素分泌中含胰島素小泡胞吐作用之前的最后一個觸發步驟。在較早的研究中[36]，超聲波應用于牛腎上腺嗜鉻細胞，導致鈣的瞬時流入，引發兒茶酚胺的胞吐作用。胰島素與兒茶酚胺的胞吐作用的機制有相似之處。UFUS促進胰島素分泌或許可以作為治療二型糖尿病的潛在療法。

6總結

UFUS相較于其他治療方法具有便捷快速、作用范圍大、作用溫和等優勢，在腫瘤治療、免疫屏障開放、經顱超聲刺激等方面都具有巨大的開發潛力。然而，治療性超聲在臨床上的應用進展仍處于初步階段。如何在保證UFUS作用范圍廣的同時提高治療效果，避免出血、非特異性損傷等副作用將是下一步研究者們待解決的難題。同時，期待將來有更多靈長類動物模型、臨床前的UFUS研究，以保證其治療效果對于人類安全且可靠。

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收稿日期：2023-02-17；修回日期：2023-03-26

編輯/肖婷婷