化濕敗毒方干預COVID-19細胞因子風暴的網絡藥理學研究 *

李崇將 鄒小凡 周 茜

（吉安市中心人民醫院呼吸與危重癥醫學科，江西 吉安 343000）

自新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情發生以來，截至目前我國累計確診超過100 000 人次，累計死亡超過4800人次，目前國內疫情得到了有效控制。除了現代醫學以及醫藥的支持，傳統中醫藥也起了非常大的作用。國家衛生健康委員會先后發布了8 版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》并推薦中藥方劑，其中化濕敗毒方為重癥患者推薦使用方案［1］。

細胞因子可以分為白細胞介素（IL）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）等，其在機體內相互促進或相互制約，形成復雜的細胞因子免疫調節網絡［2-5］。細胞因子既可發揮免疫調節作用，在一定條件下也可以參與多種疾病的發生，甚至引發細胞因子風暴即細胞因子風暴綜合征，導致多器官損害、功能衰竭。細胞因子風暴多為感染、藥物等多種因素誘發的全身系統性炎癥反應。在病毒感染機體時，急性炎癥引起促炎細胞因子或趨化因子釋放，T 淋巴細胞活化，引起免疫效應細胞釋放促炎因子和趨化因子，隨著病程發展產生失控的過激反應，使得促炎因子和趨化因子暴增，并通過自分泌、旁分泌等級聯反應活化更多的免疫細胞，造成免疫調控網絡失衡，形成細胞因子風暴［4，5］。細胞因子風暴在疾病迅速進展中起重要作用。

本研究使用網絡藥理學的方法，篩選出化濕敗毒方作用靶點與COVID-19 病理靶點，通過基因本體（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，研究化濕敗毒方干預細胞因子通路、關鍵基因進而達到治療效果的機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件TCMSP 數據庫（http：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）、Drugbank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）、OMIM 數 據 庫（https：//www.omim.org/）、GeneCard 數 據 庫（https：//www.uniprot.org/database/DB-0030）及GEO 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。

1.2 研究方法

1.2.1 中藥復方作用靶點的篩選利用TCMSP 對生麻黃、杏仁、甘草、藿香等復方中藥的藥物作用靶點進行了研究。其中礦物藥生石膏的靶標從Drugbank 數據庫獲得。此外，用OMIM 數據庫、GeneCard 數據庫以及GEO數據庫篩選COVID-19的病理靶點。

1.2.2 篩選復方中藥治療COVID-19的最佳靶點將化濕敗毒方的潛在活性成分及作用靶點通過Cytoscape 建立“活性成分-靶點-疾病”網絡。網絡中節點表示化合物及靶點，節點之間的互作用關系由邊表示。節點的重要性可以通過自由度來評估。

1.2.3GO和KEGG功能注析使用R 包“ClusterProfiler”對目標基因進行功能注釋，以全面探討這些目標基因的功能相關性。GO和KEGG 被用來評估相關的功能類別。P值和Q值均小于0.05 的GO 和KEGG 富集通路被認為是顯著性類別。

1.3 統計學方法所有統計分析均采用R 語言（Version 3.6）進行。所有統計檢驗均為雙側，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

通過網絡藥理學的方法對目標進行分析的過程如圖所示，用于幫助確定生麻黃、杏仁、生石膏、甘草、藿香等中藥對COVID-19 的作用。本研究首先通過OMIM數據庫以及GeneCard 數據庫（Relevance score≥1）探討COVID-19 的相關靶點1130 個。隨后，我們對TCMSP 數據庫分別基于生麻黃、杏仁、甘草、藿香等13 種中藥，以生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為閾值進行篩選，獲取所含藥物有效成分以及有效成分所作用的靶點。此外礦物藥生石膏的靶標從Drugbank 數據庫獲得，最終得到258 個藥物靶點。使用Cytoscape 通過網絡圖的形式展示中藥成分與靶點的作用關系。然后將藥物靶點與前者的1130 個疾病靶點取交集，得到47 個交集靶點。見圖1。

圖1 化濕敗毒方和COVID-19的靶點維恩圖

為進一步探討中藥復方影響COVID-19的潛在機制，利用R 包“Clusterprofiler”對47 個靶點基因進行GO 富集和KEGG 通路分析。GO富集結果顯示，基因主要涉及的通路為對脂多糖的反應、膜筏、受體-配體活性、細胞因子活性。見圖2。KEGG富集結果顯示，基因主要涉及的通路為脂質與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、輔助性T 細胞17（Th17）分化等信號通路。見圖3。我們進一步使用Cytoscape 軟件，生成了中藥對抗COVID-19靶點的網絡可視化和核心靶點相關通路的交互圖，圖表能清晰地顯示復方中藥調控靶點的分子機制以及其對COVID-19的調控作用。見圖4。

圖2 GO富集分析氣泡圖

圖3 KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

中醫學在傳染病的防治中積累了豐富的學術理論和臨床經驗，國家衛生健康委員會針對重型疫毒閉肺證的治療推薦使用化濕敗毒方，化濕敗毒方由《傷寒論》中麻杏石甘湯、《金匱要略》中葶藶大棗瀉肺湯、《溫病條辨》中宣白承氣湯、《醫原·濕氣論》中藿樸夏苓湯4首方劑組合化裁而制，該方清肺平喘、泄熱開閉、燥濕健脾、活血祛瘀、扶正祛邪。

本研究共篩選出47 個化濕敗毒方治療COVID-19 的潛在靶點，中藥作用于治療的核心成分有169 種，包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、谷甾醇、兒茶素等。研究［6］顯示槲皮素在降低COVID-19 重癥患者重要標記物血清堿性磷酸酶（ALP）、快速C 反應蛋白（q-CRP）和血清乳酸脫氫酶（LDH）水平方面是安全有效的，并可縮短住院治療時間。多個研究顯示山柰酚具有抗炎、抗病毒的作用［7］。

有研究［8］顯示，重型COVID-19 患者一旦出現急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），則病死率接近50%。細胞因子風暴是發生重癥COVID-19 的重要原因，也是加重患者病情甚至造成患者死亡的重要因素［9，10］。研究［11，12］顯示化濕敗毒方中所包含的麻杏甘石湯具有調節IL-6、人干擾素誘導蛋白10（IP-10）、TNF-α 等細胞因子作用。本研究發現化濕敗毒方可調節受體-配體活性、細胞因子活性、IL-17 信號通路、Th17 細胞分化等信號通路。

研究提示化濕敗毒方在干預COVID-19 重型、危重型患者的作用機制可能與清除病原體、抑制炎癥反應、阻斷炎癥風暴及改善肺組織損傷有關［13］。研究［14，15］發現，小鼠感染流感后，可以引起炎癥因子水平升高，其機制可能與活動依賴神經特異啟動子（c-FOS）基因表達相關，在放射性肺炎中也有類似表現，其機制可能與HSB 基因相關?；瘽駭《痉娇梢愿深A細胞因子、調節細胞因子風暴，進而起到治療重癥COVID-19 的效果。

綜上所述，本研究通過運用網絡藥理學方法探究化濕敗毒方治療重癥COVID-19 的潛在作用機制，總結出化濕敗毒方改善細胞因子、調節免疫微環境可能的主要靶點、信號通路及核心基因。本研究也體現了中藥治療COVID 具備多成分、多靶點、多通路的特點，為化濕敗毒方治療重癥COVID-19 提供理論依據。但文章僅從理論和網絡預測角度分析，后期需對核心成分、靶點、核心基因及通路進行驗證。