中藥藥理學貫通性實驗的設計及應用 *
——以涼膈散為例

余景滔 姜 麗 方小川 盧子濱 余林中 陳育堯 曹惠慧 區錦瑩 劉俊珊

（南方醫科大學中醫藥學院廣東省中藥制劑重點實驗室，廣東 廣州 510515）

中藥藥理學是以傳統中藥學與現代藥理學為主體的實踐性新興交叉學科。實驗是本學科的基礎，通過實驗教學可強化學生對中藥藥理學科研思維及技能的掌握，提高教學質量［1］。教育部明確指出，實踐育人特別是實踐教學依然是高校人才培養中的薄弱環節，與培養拔尖創新人才的要求還有差距。因此切實開展中藥藥理實驗教學改革是非常必要的。貫通性實驗教學注重內容的連貫性，強調知識間的相互聯系與交叉，可以促進學科知識融合，加深學生對課程理論的理解，提高實驗教學質量。然而迄今國內尚未有完善的中藥藥理學貫通性實驗教學方案，因此文章聚焦于貫通性實驗，結合現有教學基礎條件及中藥藥理學教學團隊的教學改革實踐經驗，進行中藥藥理學實驗教學的改革。

涼膈散（LGS）為中醫溫病經典名方，首載于《太平惠民和劑局方》，由連翹、梔子、黃芩、甘草、薄荷、大黃、芒硝7 味藥組成，具有瀉火解毒、清上泄下的功效，主治中上二焦火熱證。除芒硝外，涼膈散中其余藥物均有抗氧化作用［2-7］，其中的大黃、芒硝為瀉下藥，具有瀉下通便作用，能改善腸運動［8，9］。本課題組研究結果［10，11］表明，涼膈散具有抗炎作用。此外，現代藥理研究［12-14］表明，涼膈散中部分中藥如梔子、黃芩、甘草及大黃，均具有鎮痛作用。因此本研究以涼膈散為核心，建立抗氧化、組織平滑肌運動調節、泄下、抗炎和鎮痛的貫通性實驗方案，系統地從細胞分子-器官-動物等不同層次對涼膈散進行藥效評價，探究其不同的藥理作用，從而進一步加深學生對中藥藥理學課程的理解。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器HW-400S 型恒溫平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司）；PCLAB-UE型生物醫學信號采集處理系統（北京微信斯達科技發展有限責任公司）；Thermo 酶標儀（賽默飛世爾科技公司）；JA3003N型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；N-1200B型旋轉蒸發儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DGX-9243BC-1型冷凍干燥器（中國上海?，攲嶒炘O備有限公司）。

1.2 藥材與試劑涼膈散所含中藥由廣州康美藥業有限公司提供，經南方醫科大學中醫藥學院張宏偉副教授鑒定；磷酸鈉鹽口服溶液（今辰清）［上海海虹實業（集團）巢湖今辰藥業有限公司］。

1.3 實驗動物SPF級昆明種（KM）雌性小鼠，體質量18～22 g，購于南方醫科大學實驗動物管理中心。

2 方法

2.1 涼膈散的制備依據文獻［15］煎煮方法，將涼膈散生藥制備成濃度為1 mg/mL的藥液。

2.2 涼膈散抗氧化實驗將50 μL 不同濃度凉膈散或50 μL 維生素C（Vitmin C，10 mg/mL）與150 μL DPPH溶液（0.2 mmol/L）混合，加入96 孔板中。共分為4 組，凉膈散組、維生素C 組、凉膈散空白組及維生素C 空白組，每組設3 個復孔。室溫下反應20 min，波長517 nm測量吸光度值，計算清除率。清除率=［1-（樣本OD值-空白OD值）/對照OD值］×100%。

2.3 涼膈散對小腸離體平滑肌的影響平滑肌槽中臺式液預溫至38 ℃；剪取小鼠1.5～2.0 cm離體空腸，線鉤勾住腸管兩端，調整前負荷約2 g，基線調零，穩定后記錄正常收縮曲線。給藥乙酰膽堿（10 μg/mL）、阿托品（50 μg/mL）、凉膈散（100 mg/mL），分別采集數據，計算給藥的張力增值，比較結果。張力增值=給藥后張力-給藥前張力。

2.4 涼膈散對小鼠小腸運動的影響將36 只小鼠隨機分為6 組，每組6 只，即空白組、凉膈散最高劑量組（40 g/kg）、凉膈散高劑量組（20 g/kg）、凉膈散中劑量組（10 g/kg）、凉膈散低劑量組（5 g/kg）、今辰清（SPOS）組（2.64 g/kg），準確稱量小鼠體質量并記錄。以3%印度墨水為指示劑，與涼膈散藥物混合，依據小鼠體質量，按0.2 mL/10 g 給藥劑量灌胃，給予相應藥液。灌胃給藥20 min 后，立即頸椎脫臼處死動物，打開腹腔，分離腸系膜，剪下小腸，置于實驗桌報紙上。拉直小腸，測量總長度（cm）和墨水推進距離（cm），計算墨水推進百分率，比較各組結果。墨水推進百分率=（墨水推進距離/小腸總長度）×100%。

2.5 涼膈散抗炎鎮痛實驗

2.5.1 抗硫酸銅誘導斑馬魚炎癥實驗斑馬魚養殖于南方醫科大學人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選實驗室。隨機選取受精后3 d 的健康斑馬魚幼魚60 條，分為6 組，每組10條。給藥方式為浸泡給藥，分組如下。

空白組：浸泡在egg water中2 h，不予任何處理。硫酸銅模型組：浸泡在含硫酸銅（20 μmol/L）2 mL 的egg water中2 h。陽性對照組：浸泡在含有硫酸銅（20 μmol/L）2 mL 和地塞米松（DEX，10 μg/mL）的egg water 中2 h。凉膈散組：浸泡在含有硫酸銅（20 μmol/L）2 mL 和凉膈散藥液高、中、低濃度（300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL）的egg water中2 h。

2 h 后，用0.02%三卡因麻醉斑馬魚并置于瓊脂板上固定，在熒光顯微鏡下觀察魚腹主動脈處中性粒細胞的數量并拍照。

2.5.2 小鼠熱板實驗取小鼠120 只，隨機分為6 組，每組20 只，即空白組、凉膈散最高劑量組（40 g/kg）、凉膈散高劑量組（20 g/kg）、凉膈散中劑量組（10 g/kg）、凉膈散低劑量組（5 g/kg）、扶他林組（0.5 g/kg）；準確稱量小鼠體質量并記錄。將熱板鎮痛儀調節至55 ℃，加熱后作為熱刺激；記錄小鼠自投入熱板至舔后足的時間，作為該鼠痛閾值。給藥前，測定每只小鼠痛閾，5 s≤痛閾值≤30 s為合格；灌胃給藥（0.2 mL/10 g）30 min后，再次測定痛閾值并記錄。若給藥后小鼠60 s 內無舔后足反應，按60 s 記。計算每只小鼠計算痛閾提高百分率，比較各組的結果。痛閾提高百分率（%）=（給藥后痛閾值-給藥前痛閾值）/給藥前痛閾值×100%。

2.5.3 小鼠醋酸扭體實驗取小鼠120 只，隨機分為6組，每組20 只，分組給藥與小鼠熱板實驗相同。給藥30 min 后，每只小鼠腹腔注射醋酸（0.1 mL/10 g），觀察并記錄每只小鼠20 min內出現扭體反應的次數。

2.6 數據處理及統計采用Graphpad Prism 8.0統計軟件處理數據，計量資料以（±s）表示，組間比較行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 設計實驗結果

3.1 涼膈散具有抗氧化作用凉膈散對DPPH·自由基的清除率隨劑量的增加逐漸提高，當其濃度在700 μg/mL以上時，對DPPH·自由基的清除率為76%，到達平臺期。這表明凉膈散可有效清除DPPH·自由基，發揮抗氧化作用，以藥物濃度700 μg/mL 及以上效果明顯，因此將該濃度用于本科中藥藥理實驗課教學中。見圖1。

圖1 涼膈散抗氧化實驗結果

3.2 涼膈散對小鼠離體腸平滑肌運動具有舒張作用鑒于未見涼膈散全方對小鼠腸平滑肌的作用研究，并且基于凉膈散組方中含大黃、芒硝及甘草等組分可發揮瀉下作用，為探索其對小鼠離體腸平滑肌運動是否有舒張或收縮作用，作者通過記錄凉膈散、乙酰膽堿及阿托品對小鼠小腸平滑肌運動的影響曲線，并計算平均張力增值、最大張力增值以及最小張力增值。結果顯示，乙酰膽堿對小鼠離體腸平滑肌具有收縮作用，凉膈散與阿托品均對小鼠離體腸平滑肌具有舒張作用，且凉膈散松弛作用較阿托品大。見表1。

表1 凉膈散對小鼠離體腸平滑肌運動的影響實驗結果 （± s）

表1 凉膈散對小鼠離體腸平滑肌運動的影響實驗結果 （± s）

注：與乙酰膽堿組比較，1）P＜0.001，2）P＜0.01，3）P＜0.005。

組別凉膈散乙酰膽堿阿托品最小張力增值-0.178±0.1183)0.074±0.015-0.219±0.033鼠數8 8 8藥液濃度100 mg/mL 10 μg/mL 50 μg/mL給藥量800 μL 100 μL 100 μL平均張力增值-0.208±0.0641）0.451±0.022-0.210±0.0221）最大張力增值-0.121±0.1562）0.648±0.030-0.190±0.1612）

3.3 涼膈散具有瀉下作用基于凉膈散組方中大黃、芒硝等具有瀉下作用的藥材，進一步通過小鼠腸道推進實驗探究其是否能夠促進小鼠腸道運動。結果顯示，與空白組相比，凉膈散與陽性藥SPOS 均可提高墨水在小鼠腸道中推進的距離，給予凉膈散中劑量10 g/kg、高劑量20 g/kg及最高劑量40 g/kg后，墨水推進百分率分別提高至91.8%、92.0%及88.0%，且效果均優于陽性藥，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。其中，凉膈散中劑量（10 g/kg）效果較好。見圖2。

圖2 涼膈散對小鼠小腸運動的影響實驗結果

3.4 涼膈散可減輕炎癥反應為建立以凉膈散為核心的貫通式實驗教學體系，通過構建斑馬魚硫酸銅炎癥模型，對其抗炎作用進行評價。結果顯示，與空白組相比，硫酸銅模型組斑馬魚神經柱區域（白色線框內）聚集大量中性粒細胞，表明斑馬魚出現急性炎癥；凉膈散及陽性藥DEX 均可顯著減少中性粒細胞向中央彌散，且凉膈散的抑制作用隨濃度增大而顯著提高。由此說明，凉膈散可抑制硫酸銅誘導斑馬魚中性粒細胞遷移，減輕炎癥反應，以濃度300 μg/mL效果最明顯。見圖3。

圖3 涼膈散抗硫酸銅誘導斑馬魚炎癥實驗結果

3.5 涼膈散具有鎮痛作用現代藥理研究［14］表明，涼膈散復方中大黃、黃芩、甘草和梔子具有鎮痛作用。因此，作者運用熱板法和醋酸扭體法探索凉膈散全方對小鼠痛閾值是否有提高。結果顯示，與空白組相比，凉膈散中劑量（10 g/kg）組可減少小鼠的舔足和扭體反應次數，與陽性藥扶他林效果相當，其在醋酸扭體動物模型上表現出的鎮痛作用更為明顯。見圖4。

圖4 涼膈散鎮痛實驗結果

4 貫通性實驗改革的應用

上述研究結果表明，涼膈散能實現分子-器官-動物不同層次的藥理作用，滿足貫通性實驗的要求，故選取凉膈散設計貫通性實驗具有合理性和可行性?；诖?，作者選取2019 級中藥學和中藥制藥2 個專業學生進行貫通性實驗教學實踐。收集本科教學實驗課結果進行統計分析，結果與上述設計實驗一致，表明該實驗設計具有較好的可重復性。此外，基于貫通性實驗教學實踐結果，作者對該教學模式應用于中藥學和中藥制藥2 個專業的實踐情況進行調查分析，共收集中藥學和中藥制藥2 個專業學生填寫的有效問卷72 份。學生認為該貫通性實驗具有下述優點，即實驗課參與度高，實驗原理及操作掌握程度好；課堂滿意度高，能力提升顯著。學生對實驗課綜合評價高，同行評教效果優異，課程講授評分成績名列前茅。

5 討論

中藥藥理學是中醫藥高等教育中藥學類專業的核心課程，也是中醫學及中西醫學類專業的基礎課程，對于培養學生“理論與實踐”相結合的能力有重要意義［16］。實踐教學在中藥藥理學的教學過程中發揮了舉足輕重的作用，其方法改革是推動實踐教學改革和人才培養模式改革的關鍵。本研究采用經典名方涼膈散探索實踐教學方法改革，并充分利用其具有多重功效的優勢，設計了抗氧化、離體平滑肌運動、小鼠腸推進、抗炎、醋酸扭體法和熱板法等實驗。上述實驗從分子、器官、動物不同層次進行中藥藥理研究，形成比較完善的貫通式實驗教學體系，不僅覆蓋中藥藥理學實驗課程中的大部分實驗內容，還引入了本團隊建立的斑馬魚炎癥模型，實現了科研和教學的有機融合，取得較好的教學效果。本項目為中醫藥院校及綜合性院校的中藥學專業學生進行實驗教學提供改革模板及改革思路，具有較高的實踐應用價值。