UPF3B促進上消化道惡性腫瘤細胞增殖

侯卜文 舒敏 劉程豪 杜云峰 黎廣 姜慧嬌 吳向未

摘要：目的 探討UPF3B對上消化道惡性腫瘤細胞增殖的影響。方法 通過qRT-PCR和Western Blot技術驗證胃癌和食管癌細胞中UPF3B的敲低和過表達效率；CCK-8、EdU、平板克隆形成實驗評估細胞的增殖能力。結果 在胃癌和食管癌細胞中通過siRNA敲低UPF3B的表達水平，UPF3B的mRNA和蛋白表達水平顯著降低，且有統計學意義（P<0.001），CCK8、EdU、平板克隆形成實驗結果表明敲低UPF3B抑制胃癌和食管癌細胞的增殖；在胃癌和食管癌細胞中轉染UPF3B過表達質粒上調UPF3B的表達水平，UPF3B的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，且有統計學意義（P<0.001），CCK8、EdU、平板克隆形成實驗結果表明過表達UPF3B促進胃癌和食管癌細胞的增殖。結論 UPF3B促進上消化道惡性腫瘤細胞增殖。

關鍵詞：上消化道惡性腫瘤；食管癌；胃癌；UPF3B；增殖

中圖分類號：中圖分類號R735.7文獻標志碼：A文獻標識碼

UPF3B promotes proliferation of malignant tumor cells in upper gastrointestinal tract

HOU? Bowen1，SHU? Min1，LIU? Chenghao1，DU? Yunfeng1，LI? Guang1，JIANG? Huijiao1，WU? Xiangwei1，2*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 The First Affiliated Hospital/

Central Asia Key Laboratory for High Incidence Prevention and Control， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： Objective To investigate the effect of UPF3B on the proliferation of malignant cells inUpper gastrointestinal malignant tract. Methods Interference and overexpression efficiency of UPF3B in gastric and esophageal cancer cells verified by qRT-PCR and Western blot; the proliferation ability of cells was detected by CCK-8， EdU， and plate colony formation assay. Results siRNA knockdown of UPF3B expression levels in gastric and esophageal cancer cells significantly decreased the mRNA and protein expression levels of UPF3B， and was statistically significant （P<0.001）， and CCK8， EdU and plate colony formation assay showed that knockdown of UPF3B inhibited the proliferation of gastric and esophageal cancer cells; transfection of UPF3B overexpression plasmid in gastric and esophageal cancer cells up-regulated the expression levels of UPF3B， and the mRNA and protein expression levels of UPF3B were significantly increased， and was statistically significant （P<0.001）， and the results of CCK8， EdU and plate colony formation assay showed that overexpression of UPF3B promoted the proliferation of gastric and esophageal cancer cells. Conclusion UPF3B promotes the proliferation of malignant tumor cells in upper gastrointestinal tract.

Key words： Upper gastrointestinal malignant tract;Esophageal cancer;Gastric cancer;UPF3B;proliferation

0 前言

消化道惡性腫瘤是指發生于胃腸道及相關器官的一組異質性癌癥，其中上消化道惡性腫瘤主要包括食管癌和胃癌，是十大最常見癌癥和癌癥相關死亡原因之一。據統計，2020年上消化道惡性腫瘤（胃癌和食管癌）新增大約140萬病例，有約130萬死亡病例。中國上消化道惡性腫瘤發生率僅次于肺癌， 為惡性腫瘤發病和死亡的主要病因［1］。

RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBPs）是一類與轉錄本和非編碼 RNA相互作用的多樣化蛋白，通過其自身單個或多個RNA結合域與RNA結合，改變結合RNA的功能，調節生物體的許多細胞過程，創建復雜的動態多水平網絡控制核苷酸代謝和基因表達［2-3］。RNA結合蛋白在RNA調控方面發揮重要作用，包括轉錄、翻譯、剪接、多聚腺苷酸化、穩定性和定位［4-10］。RNA結合蛋白還可以通過與其它蛋白的直接相互作用或作為帶有編碼或非編碼RNA的支架，形成核糖核蛋白復合體。目前人類中有大約1 500種經過實驗驗證的RNA結合蛋白，約占編碼基因的7%［11］，其功能失調與多種人類疾病有關，包括肌肉萎縮、神經系統疾病和癌癥［4，12］，也因此成為多種癌癥潛在的生物標志物和治療靶點。

先前的研究發現，Up-Frameshift Suppressor 3 Homolog B（UPF3B）是NMD通路中的核心接頭蛋白，可直接與釋放因子相互作用，并作為 NMD放大器，使翻譯終止。UPF3B還可以直接與核糖體相互作用，并參與NMD途徑中mRNA的出核運輸和質量監督過程［13］。無義介導的mRNA降解途徑（Nonsense mediated decay，NMD）是一種保守的RNA降解途徑，能夠識別并降解攜帶有提前終止密碼子的異常mRNA，從而確?；虻臏蚀_表達。NMD通過下調抑癌基因的表達在腫瘤進展過程中發揮作用［14］。還有研究使用TCGA泛癌數據分析了33種癌癥相對于對應正常組織中UPF3B的表達，結果表明UPF3B在多種癌癥中呈高表達，且可作為基因預后模型因子，預測各種類型腫瘤的進展，包括肝癌、食管癌、胃癌、腎嫌色細胞癌、皮膚黑色素瘤等。在多種癌癥類型中，UPF3B基因的功能主要與泛素介導的蛋白水解、細胞周期和mRNA監視途徑有關，且其高表達與預后差顯著相關［15-17］。目前UPF3B在食管癌和胃癌中的作用尚未被研究。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與主要試劑

人胃癌細胞株SGC-7901和人食管癌細胞株KYSE450購自中國科學院細胞庫。SGC-7901和KYSE450常規培養在1%青霉素-鏈霉素和含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，放置于5% CO2、37 ℃培養箱中孵育。主要試劑詳見表1。

1.2 細胞轉染siRNA和過表達質粒

siRNA和過表達質粒均由上海吉瑪基因設計并構建合成，siRNA序列詳見表2。

將細胞SGC-7901和KYSE450分別鋪于12孔板中，確保每孔中含有1.2×105個細胞接種在1 mL無雙抗且含血清的完全培養基內，轉染時細胞匯合度達到60%～70%。使用LipofectamineRNAiMAX轉染siRNA，轉染24 h后進行后續實驗；使用Lipofectamine 3000轉染過表達UPF3B及其相應對照的質粒，轉染24 h后進行后續實驗。

1.3 RNA提取和實時熒光定量PCR

使用E.N.Z.A. Total RNA Kit I從轉染24 h的細胞中分離出總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計精確測定提取的RNA濃度。通過逆轉錄合成cDNA，利用qRT-PCR進行大量擴增。本實驗以 β-actin為內參，每組設置3個復孔。應用2-△△CT法分析實驗組和對照組的表達差異倍數。引物序列見表3。

引物稀釋：（1）10000 g，4 ℃離心2 min，按說明書配比加入相對應量的ddH2O用來溶解引物，渦旋振蕩混勻；按所需使用量分裝引物至無酶EP管中，放置于-20 ℃冰箱中保存；（2）使用時需將引物用無酶水稀釋10倍，即每10 μL的（1）溶液中加入90 μL的無酶水，若長期保存需置于-20 ℃冰箱中保存。

1.4 Western blot實驗

分別提取轉染siRNA和過表達質粒后48 h后的細胞蛋白。向1 mL預冷的Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和10 μL PMSF。將配制好的預冷的Lysis Buffer加入到12孔板中，每孔100 μL。用SDS PAGE膠分離蛋白，80 V 3 h。轉膜條件設置為80 V 60 min。在常溫下配置5%的封閉液，封閉120 min。按照一抗：GAPDH稀釋比1∶1 000，UPF3B稀釋比1∶2 000。于4 ℃冰箱過夜，第二天清洗一抗，在常溫條件下孵育二抗（稀釋比為1∶5 000），2.5 h，最后使用1×TBST洗3次（每次10 min）后進行曝光并檢測蛋白質。

1.5 Cell Counting Kit-8（CCK）實驗

CCK-8增殖實驗檢測分別轉染siRNA和過表達質粒后的細胞的增殖能力。將約2 000個細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后（約6 h），在不同時間點每孔加入10 μL CCK-8溶液，放于培37 ℃養箱中進行2 h的孵育。測定450 nm處吸光度，每孔檢測3次并進行記錄。使用GraphPad Prism進行數據統計和分析。

1.6 EdU實驗

將細胞SGC-7901和KYSE450分別鋪于12孔板，經過24 h的轉染處理，向每孔內加入1 mL EdU儲存液，標記細胞2 h，并用含3% BSA的PBS洗滌3次；每孔中加入1 mL 3.7%甲醛固定細胞15 min，并用含3% BSA的PBS洗滌3次；每孔加入1 mL 0.5% TritonX-100通透液，室溫孵育20 min，含3% BSA的PBS洗滌3次；每孔加入500 μL EdU Click反應液，室溫避光孵育30 min，含3% BSA的PBS洗滌3次；每孔中加入細胞核染色液，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌3次，最終每個孔保留1 mL的PBS，立刻進行熒光顯微鏡下觀察拍照。使用GraphPad Prism將得到的結果進行數據統計和分析。

1.7 平板克隆實驗

將細胞SGC-7901和KYSE450分別鋪于12孔板，轉染處理24 h后，根據實驗分組分別取2 000個細胞鋪于6孔板中，并輕輕晃動，使細胞均勻分布于孔板中。在37 ℃，5％CO2條件下的孵箱中培養2～3周，每組設置3個孔。期間根據培養液及細胞狀態情況，更換完全培養基。當六孔板中出現肉眼可見的克隆時，應立即終止培養。將上清液棄去，使用PBS輕柔清洗2次。每孔加入4%多聚甲醛600 μL，并將其放置于4 ℃冰箱中固定細胞20 min。棄固定液，加入1%結晶紫染色液600 μL，在室溫下染色30分鐘，用流水緩慢將染色液洗去。將六孔板倒扣在吸水紙上，待自然風干后拍照記錄，使用ImageJ軟件對細胞數超過50個的集落進行計數。使用GraphPad Prism進行數據統計和分析。

1.8 醫學統計方法

本實驗涉及的數據均為3次獨立實驗結果，使用Graphpad Prism 8.0進行數據分析及統計，結果符合正態分布的以均數±標準差（±S）的格式表示，不滿足正態分布的結果用中位數和四分位間距表示。使用unpaired two-tailed Student′s t-test統計學方法進行實驗組和對照組之間的統計分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義，用*表示；若P＜0.01，用**表示；若P＜0.001，用***表示。使用Graphpad Prism 8.0軟件作圖。

2 結果

2.1 胃癌和食管癌細胞中UPF3B的干擾和過表達情況

將針對UPF3B的siRNA，對SGC-7901和KYSE450細胞進行體外干擾UPF3B表達，且通過qRT-PCR和WB技術檢測UPF3B的敲低效率。實驗結果顯示對于SGC-7901和KYSE450細胞，3種不同序列的siUPF3B均能顯著下調UPF3B的轉錄和蛋白水平（圖1A、1B）。同樣對SGC-7901和KYSE450細胞體外轉染含UPF3B的質粒載體上調UPF3B表達量，將空的pEX-4載體作為空白對照。通過qRT-PCR和WB技術檢測UPF3B發現，與空白對照組相比，轉染含UPF3B的質粒載體均能顯著上調UPF3B的轉錄和蛋白水平（圖1C、1D）。

A.qRT-PCR分析證實siRNA在SGC-7901和KYSE450細胞中下調UPF3B mRNA水平;B.WB分析證實siRNA在SGC-7901和KYSE450細胞中下調UPF3B蛋白水平;C.qRT-PCR分析證實過表達質粒在SGC-7901和KYSE450細胞中上調UPF3B mRNA水平;D.WB分析證實過表達質粒在SGC-7901和KYSE450細胞中上調UPF3B蛋白水平。差異的顯著性由unpaired two-tailed Student′s t-test確定。* P＜0.05；** P＜0.01；*** P＜0.001。

2.2 CCK8實驗分析UPF3B干擾和過表達后細胞的增殖情況

轉染siRNA至SGC-7901和KYSE450細胞72 h后進行CCK8實驗檢測發現，轉染siUPF3B組的OD值與對照組相比均明顯降低且具有統計學意義（圖2A、2B）。轉染質粒載體于SGC-7901和KYSE450細胞72 h后進行CCK8實驗結果發現，轉染過表達質粒組的OD值與對照組相比明顯降低且具有統計學意義（圖2C、2D）。CCK8實驗表明下調UPF3B后，細胞的增殖能力減弱；UPF3B過表達后其增殖能力顯著增強。CCK8實驗證明在食管癌和胃癌細胞中，UPF3B可促進其增殖。

A.敲低UPF3B抑制SGC-7901和KYSE450細胞增殖能力。B.過表達UPF3B促進SGC-7901和KYSE450細胞增殖能力。差異的顯著性由unpaired two-tailed Student′s t-test確定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。圖2 CCK8實驗：UPF3B促進胃癌和食管癌細胞的增殖

2.3 EdU實驗分析UPF3B干擾和過表達后細胞的增殖情況

SGC-7901和KYSE450細胞下調UPF3B后，EdU-摻入細胞的比例明顯下降（圖3A）；過表達UPF3B后，EdU-摻入細胞的比例顯著上升（圖3B）。EdU實驗結果表明下調UPF3B后，細胞的增殖能力減弱；過表達UPF3B后，增強了這2種細胞的增殖能力。EdU實驗再次驗證，在食管癌和胃癌細胞中，UPF3B均可促進其增殖。

2.4 平板克隆實驗分析UPF3B干擾和過表達后細胞的增殖情況

轉染siRNA下調UPF3B后，SGC-7901和KYSE450細胞克隆形成團數較對照組顯著減少（圖4A）。轉染含UPF3B的質粒載體上調UPF3B表達量后，其克隆形成團數較對照組顯著增多且具有統計學意義（圖4B）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，下調UPF3B后，細胞的增殖能力會減弱；當過表達UPF3B后，細胞的增殖能力會增強。

A.SGC-7901和KYSE450細胞下調UPF3B后，摻入EdU的代表性熒光照片（左）和量化圖（右）；B.SGC-7901和KYSE450細胞過表達UPF3B后，摻入EdU的代表性熒光照片（左）和量化圖（右）。

差異的顯著性由unpaired two-tailed Student′s t-test確定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。圖3 EdU實驗：UPF3B促進胃癌和食管癌細胞的增殖

A.敲低UPF3B抑制SGC-7901和KYSE450細胞集落形成能力；B.過表達UPF3B促進SGC-7901和KYSE450細胞集落形成能力。差異的顯著性由unpaired two-tailed Student′s t-test確定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。圖4 平板克隆實驗：UPF3B促進胃癌和食管癌細胞的增殖

3 討論

近年來，隨著早期診斷和治療技術的飛躍提升，許多患者的生存情況得到改善，但上消化道惡性腫瘤仍保持極高的發病率和致死率。據2020年全球癌癥統計數據報告顯示，目前上消化道惡性腫瘤仍然是全球高度難治性且高發性惡性腫瘤之一，每年約有140萬新增病例和130萬例死亡病例［1］。細胞穩態失調導致細胞生長和增殖失控是腫瘤典型特征之一，但其中復雜的調控網絡尚未完全明了。

越來越多的報道稱UPF3B可作為候選RNA結合蛋白基因預測各種類型腫瘤的進展，包括肝癌、食管癌、腎嫌色細胞癌、皮膚黑色素瘤［15］。有文獻報道UPF3B參與無義介導的mRNA降解途徑（NMD），且作為該途徑中的核心接頭蛋白，參與mRNA的出核運輸和質量監督［13］。NMD通路是一種重要的RNA監視機制，能識別和降解含有提前終止密碼子的異常mRNA，以確?；虻臏蚀_表達［14］。癌癥中突變的腫瘤抑制基因可以通過NMD降解，因此通常認為此途徑參與腫瘤的發生［18-19］。既往研究表明UPF3B突變可引起多種精神疾病，如智力殘疾和精神分裂癥。UPF3B 是多蛋白復合物的一部分，參與mRNA核輸出和無感覺介導的NMD途徑的啟動。約11%的人類遺傳病是由于NMD途徑的改變。UPF3B已被確定為NMD誘導疾?。òò┌Y）的潛在治療方法［12］。有研究通過綜合分析癌癥基因組圖譜 （TCGA），開發出一種 DNA 修復相關基因標志物，其中包括UPF3B，來預測食管癌患者的預后［13］。目前UPF3B在上消化道腫瘤中還未得到研究。

本研究選擇上消化道腫瘤中主要的癌癥類型即胃癌和食管癌，進行體外驗證UPF3B對胃癌和食管癌細胞系的生物學功能影響。通過CCK8、EdU和平板克隆形成實驗驗證siRNA敲低UPF3B后兩種癌細胞的增殖能力受到顯著抑制，而質粒過表達UPF3B后增殖能力明顯增強。

綜上所述，本研究發現UPF3B促進上消化道惡性腫瘤細胞增殖，提示UPF3B可能參與了上消化道惡性腫瘤的發生發展，但其作為RNA結合蛋白影響上消化道惡性腫瘤的作用機制需要進一步的分析和實驗驗證。腫瘤細胞的侵襲和遷移也是其惡性表型的重要特征，UPF3B對上消化道腫瘤細胞侵襲和遷移的影響還需要進一步實驗驗證，為更全面的了解其促癌作用提供實驗依據。

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（責任編輯：編輯唐慧）