鵝骨鮮味肽的發酵工藝優化及多肽組學分析

馮芯蕊，王冉，章寶，張云凱，2，蔡克周*

（1.合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥 230031；2.安徽鵝門在鮮食品科技有限公司，安徽 合肥 231131）

中國是世界上較大的鵝養殖生產國之一，年產量達數百萬噸。同時，也會產生數量龐大的副產物如鵝骨、鵝血等。鵝骨，作為主要副產物含有肽、氨基酸和鈣、磷、鐵等豐富的礦物質，以及具有特殊風味的脂肪酸、人類所必需的維生素等其他營養物質[1]。然而，中國對骨資源的綜合利用起步較晚，多數還停留在傳統加工方式上，比如將鮮骨粉碎成骨粉當作飼料或肥料，甚至直接丟棄。這不僅造成了優質骨資源的浪費，還會造成一定程度的環境污染。因此，提取這些營養物質并充分利用是鵝骨高值化利用的重要途徑。

研究表明，鵝骨中富含多種可溶性蛋白質，具有提取生物活性肽的潛力。例如，Zhang 等[2]利用牛骨制備出的膠原蛋白肽-鈣螯合物（collagen peptide-calcium chelate，CPs-Ca）具有良好的熱加工穩定性，且在胃腸道中可以穩定消化，該研究為制備新型鈣補充劑提供了科學依據，提高了牛骨的高值化利用率；Ding 等[3]從鰹魚（Katsuwonuspelamis）骨中獲得了抗氧化膠原蛋白肽，其可有效清除DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和ABTS+自由基，能夠廣泛應用于食品、化妝品和制藥等行業；Luo 等[4]從大西洋鮭魚骨中提取出了膠原蛋白肽（CPs），其具有抗炎作用，可以有效阻止骨關節炎的進一步發展。然而，目前利用鵝骨加工鮮味肽的研究鮮見報道。

鮮味肽是近年來提出的一種新型鮮味物質，不僅呈鮮味，而且可以與NaCl、味精（monosodium glutamate，MSG）協同增鮮[5-6]，還可以通過美拉德反應增強食品原有風味[7]。由于鮮味肽具有誘人的口感、良好的加工屬性和營養價值，人們從豆類、菇類、發酵產品等不同食物來源中發現了大量鮮味肽。例如，Zhao等[8]通過乙醇沉淀和大孔樹脂法，結合感官評價，首次從腌制蠶豆中發現了7 種新型鮮味肽，增強了鮮味和咸味；Kong 等[9]從香菇水解液中分離、鑒定出2 個三肽和3 個二肽，并通過感官評價結合電子舌分析確定了肽的鮮味強度；Wang 等[10]從干腌西班牙鯖魚中分離出4 條有增鮮作用的鮮味肽。此外，鑒于攝入過量味精在一定程度上會對人體健康產生潛在的不利影響[11]，人們越來越意識到鮮味肽作為天然風味來源的重要性。因此，從不同食物中獲取有價值的鮮味肽成為研究的重點。

鮮味肽的常見制備方法有酶解法、化學合成法、基因工程法、微生物發酵法等。例如，Shen 等[12]利用風味蛋白酶和木瓜蛋白酶從豬骨中分離并鑒定出了5 種鮮味肽。酶解法在工業上應用廣泛，但產品會存在不良風味[13]；化學合成法不易控制，產品得率低，實際生產受限；基因工程法表達目標肽的技術尚未成熟，有待進一步研究。利用微生物發酵可以提供多種多樣的蛋白酶，而不僅僅是某個單一的酶發揮作用，且蛋白酶活性高，從而可以使前體蛋白分解成不同序列和大小的肽[14]，生產成本低、產量高、便于工業化生產和大規模推廣[15]，是制備鮮味物質的一種經濟有效且安全的方法[16]。乳酸菌屬和葡萄球菌屬都是蛋白酶分泌能力較強的菌種[17-18]，理論上會有較高的多肽得率，是理想的發酵菌種。發酵過程中還存在很多其他因素的影響，要得到更多鮮味肽就必須控制發酵條件。

基于質譜的代謝組學、蛋白組學、多肽組學等分析研究在食品、生物、醫藥等各個領域發揮重要作用?；诙嚯慕M學制備食源性鮮味肽成為食品科學領域的熱點研究內容[19]。本研究以鵝骨為原料，利用乳酸菌屬和葡萄球菌屬進行液態發酵以制備鮮味肽，通過單因素試驗和響應面分析，探究底物添加量、菌株接種量、發酵溫度、發酵時間對可溶性肽含量和鮮味強度的影響，優化其發酵條件，并在最優工藝條件下對多肽進行鑒定及多肽組學分析，以期為鵝骨的精深加工與高值化應用、研發新型食品鮮味添加劑、畜禽副產物的綜合利用提供新思路，為多肽組學在食品研究中的應用提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌[（Lactobacillusplantarum，LP）LP-7、LP-9、LP-12]、木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylosus，SX）SX-14、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus，PP）：合肥工業大學食品與生物工程學院肉品加工與健康創新團隊微生物實驗室保藏；白鵝：安徽鵝門在鮮食品科技有限公司。

MRS 培養基、MRS 肉湯培養基、營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基、營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、甲醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四硼酸鈉、β-巰基乙醇（均為分析純）、乙腈（acetonitrile，ACN）、甲酸（formic acid，FA）（均為色譜級）：國藥集團化學試劑有限公司；絲氨酸（分析純）：北京索萊寶試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（AL204 型）、精確天平（GB/T 23111）：梅特勒托利多科技有限公司；華布斯藥材粉碎機（800C型）：東莞市華太電器有限公司；疊加式振蕩培養箱（單層Esci-2010 型）：安徽尚科質儀器有限公司；高速冷凍離心機（Sigma3-30N 型）：德國Christ 公司；酶標儀（H1型）：美國佛蒙特州維諾斯基博騰儀器公司；味覺傳感系統電子舌（SA402B 型）：日本智能傳感器技術有限公司；高效液相色譜儀（EASYnLC1200 型）、質譜儀（QExactive HFX）：美國Thermo 科技公司；超凈工作臺（KLCZ-880A 型）：北京亞泰科隆儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鵝骨預處理

將鵝骨洗凈后剁成小塊，去除肌肉、筋腱和軟骨等非骨成分。通過反復蒸煮去除上層油脂，然后在80 ℃條件下烘干至完全干燥。最后，使用高速粉碎機將骨頭粉碎，得到骨粉（發酵底物），并儲存在4 ℃冰箱中待用。

1.3.2 發酵菌株種子液的制備

在無菌超凈臺中將保存于甘油保藏管中的LP-7、LP-9、LP-12、SX-14 和PP 用無菌接種環取出，分別接種于對應的肉湯培養基（LP-MRS、SX-NB、PP-MRS）中，在35 ℃、130 r/min 條件下活化24 h，然后分別取出于相同條件下二次活化12 h，使培養基中的菌體濃度都達到109CFU/mL，得到各菌株的種子液。

1.3.3 鵝骨發酵液和粗肽的制備以及發酵菌株的選擇

將活化后的種子液在8 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，收集沉淀并用無菌生理鹽水洗滌2 次，然后將各菌株洗滌后的菌液依次接入發酵培養基，在35 ℃、150 r/min 條件下發酵24 h。發酵培養基配方：以100 mL 發酵液為基準，骨粉4%（4 g），蔗糖2%（2 g），種子液3%（3 mL）。發酵24 h 后取出發酵液，在85 ℃條件下水浴加熱15 min 以滅酶，然后在12 000×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液于-20 ℃條件下保存待用。

將各菌株的發酵液按上述方法處理后，分別測定其發酵液中的多肽濃度，選擇多肽濃度最高的菌株確定為發酵菌株。采用發酵菌株在上述條件下對鵝骨進行發酵并對發酵液進行滅酶、離心10 min（12 000×g，4 ℃）處理，取出上清液用0.45μm 微孔濾膜過濾，得到濾液即為鵝骨鮮味肽粗肽溶液，凍干后于-80 ℃儲存。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 多肽濃度

參考魯偉等[20]和Yu 等[21]的方法并略作修改，采用OPA 法測定多肽濃度。

溶液的配制：0.6 mol/L TCA 溶液：準確稱取9.8 g TCA 固體溶于100 mL 蒸餾水；OPA 試劑：A 液（40 mg OPA 溶于1 mL 甲醇）與B 液（100μL β-巰基乙醇、0.5 g SDS、0.95 g 四硼酸鈉溶于50 mL 蒸餾水）混合。

標準曲線的制作：依次配制濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的絲氨酸（Ser）標準溶液，分別按Ser∶OPA 為1∶20（體積比）混合，避光反應2 min 后于340 nm 下測定OD 值，以第一組（0 mg/mL Ser）為空白對照，Ser 濃度為橫坐標x（mg/mL），OD 值為縱坐標y，制作標準曲線。

多肽濃度的測定：取處理后的發酵上清液1 mL，加入2.2 mL 0.6 mol/L TCA 溶液，靜置10 min 后于16 200×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液與OPA 試劑按1∶20（體積比）（上清液∶OPA，1∶20）分別取出10μL、200μL 混合，并避光反應2 min，隨后于340 nm條件下測定OD 值，代入標準曲線即可求得樣品溶液中的多肽濃度。

1.3.4.2 鮮味強度

采用電子舌進行檢測分析，參考Zhang 等[22]的方法并稍作調整，測試前將鮮味（AAE）、澀味（AE1）、苦味（C00）、酸味（CA0）、咸味（CT0）和甜味（GL1）傳感器在參比溶液（含0.3 mmol/L 酒石酸的30 mmol/L KCl 溶液）中活化24 h。通過監測參比電極的相移來檢測味覺傳感器薄膜的電位，模擬電子傳感器信號被轉換成數字信號進行數據處理。每個樣品在25 ℃條件下分析5 次，記錄每種味道最后3 個數據點的平均值作為最終響應值。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 菌株接種量的選擇

固定2% 蔗糖，4% 底物添加量，設置接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，在35 ℃發酵24 h，測定各組的可溶性肽含量及其鮮味強度。

1.3.5.2 底物添加量的選擇

固定2% 蔗糖，3% 接種量，設置底物添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%，在35 ℃發酵24 h，測定各組的可溶性肽含量及其鮮味強度。

1.3.5.3 發酵時間的選擇

固定2% 蔗糖，3% 接種量，4% 底物添加量，在35 ℃分別發酵12、24、36、48、60 h，測定各組的可溶性肽含量及其鮮味強度。

1.3.5.4 發酵溫度的選擇

固定2% 蔗糖，3% 接種量，4% 底物添加量，分別在20、25、30、35、40 ℃發酵24 h，測定各組的可溶性肽含量及其鮮味強度。

1.3.6 響應面優化試驗

分析單因素試驗結果，在此基礎上，采用響應面設計的Box-Behnken 設計方法，運用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優化試驗。選擇對多肽濃度和鮮味強度影響顯著的3 個影響因子（接種量、底物添加量、發酵溫度），以的可溶性肽含量和鮮味強度為響應值，設計三因素三水平的Box-Behnken 響應面試驗，對發酵條件進行優化設計，各因素及水平見表1。

1.3.7 可溶性肽含量計算

可溶性肽含量按下列公式計算。

式中：M為可溶性肽含量，mg/g；c為依據標準曲線得到的多肽濃度，mg/mL；v為發酵液體積，mL；m為發酵液中底物的質量，g。

1.3.8 納米液相色譜-串聯質譜分析法（nano-liquid chromatography-mass spectrometry，nanoLC-MS/MS）鑒定發酵液中的多肽

在最優工藝條件下對鵝骨進行發酵，并將發酵液通過高效液相色譜儀進行鑒定和多肽組學分析。取4μL 樣品經高效液相系統進行分離后聯用配備納升離子源的質譜儀進行數據采集。流動相采用乙腈-水-甲酸體系，以0.1%甲酸-98%水溶液（乙腈為2%）為流動相A，以0.1% 甲酸-80% 乙腈溶液（水為20%）為流動相B。色譜柱以100% 的A 相平衡后，樣品由自動進樣器直接上樣到色譜柱，再經色譜柱梯度分離，流速300 nL/min，梯度時長60 min。洗脫程序見表2。

1.4 數據分析

數據結果采用平均值±標準差形式表示。試驗數據采用SPSS 19.0 軟件進行處理和單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著。響應面優化試驗設計及分析使用Design-Expert8.0.6。采用GraphPad Prism 8 和Origin 2018 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 多肽濃度的標準曲線

以Ser 標準溶液濃度為橫坐標，OD340值為縱坐標的標準曲線如圖1 所示，其回歸方程為y=1.043 9x+0.104，R2=0.994 7。

圖1 絲氨酸標準曲線Fig.1 The standard curve of serine

2.2 發酵菌株的確定

各菌株發酵液的可溶性肽含量如圖2 所示。

圖2 接種菌株對發酵液可溶性肽含量的影響Fig.2 Effect of inoculated strains on the soluble peptide content of fermentation broths

由圖2 可知，用LP-12 發酵鵝骨所得可溶性肽含量最高，達到41.75 mg/g（P＜0.05）。

2.3 鵝骨發酵條件的單因素試驗結果

2.3.1 接種量對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響

接種量對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響如圖3 所示。

圖3 接種量對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響Fig.3 Effects of the inoculation amount on the soluble peptide content and the umami intensity in fermentation broths

由圖3 可知，接種量的增加導致發酵液的鮮味強度顯著降低（P＜0.05），這是由于植物乳桿菌在發酵過程中會產酸，酸味積累會直接影響鮮味強度，接種過多則使鮮味強度降低?？扇苄噪暮侩S著接種量的增加先上升后下降，這是因為在底物濃度一定時，接種量較低使微生物分泌的蛋白酶較少，導致蛋白分解速率慢，從而使得可溶性肽含量較低[23]；而隨著接種量的繼續增加，底物不足以提供微生物生長的營養條件，同時，之前生成的多肽被繼續水解成氨基酸，都會導致可溶性肽含量的降低。當接種量大于7% 時，可溶性肽含量沒有顯著變化（P＞0.05），這一趨勢與蓋夢[24]的研究結果一致。在接種量為5% 時，可溶性肽含量達到了最大值39.84 mg/g，但此時的鮮味強度值較低。綜合考慮，選擇接種量3%為最佳水平。

2.3.2 底物添加量對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響

底物添加量對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響如圖4 所示。

圖4 底物添加量對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響Fig.4 Effects of the substrate addition amount on the soluble peptide content and the umami intensity in fermentation broths

由圖4 可知，當底物添加量為4%時，可溶性肽含量達到了最大值43.19 mg/g，但此時的鮮味強度較低。隨著底物添加量的增加，發酵液的鮮味強度顯著增大（P＜0.05），當底物添加量高于8%時，鮮味強度無顯著變化（P＞0.05），而此時的可溶性肽含量迅速下降且降低幅度大，這是由于接種量一定時，在適宜底物濃度范圍內，微生物生長條件適宜，可以產生較多的肽，而在高底物濃度下，酶已經達到飽和，菌體代謝速率降低，且前期生成的多肽水解為氨基酸，從而導致可溶性肽含量下降。綜合考慮，選擇底物添加量8%為最佳水平。

2.3.3 發酵時間對發酵液中多肽濃度及鮮味強度的影響

發酵時間對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響如圖5 所示。

圖5 發酵時間對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響Fig.5 Effects of the fermentation time on the soluble peptide content and the umami intensity in fermentation broths

由圖5 可知，發酵12 h 時鮮味強度最高（P＜0.05），在24～60 h 時，發酵液的鮮味強度均低于12 h且無顯著差異（P＞0.05），這是由于隨著發酵時間延長，乳酸積累導致鮮味強度降低。而多肽濃度隨發酵時間的延長先上升后下降，這是由于在發酵初期，發酵產物少，蛋白分解慢，可溶性肽含量低[25]，隨著發酵時間的延長，微生物大量增殖，產生了更多的可溶性肽。在發酵36 h 達到最大值42.43 mg/g。綜合以上分析并考慮時間成本，將發酵時間定為24 h，不列入響應面試驗中的因素。

2.3.4 發酵溫度對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響

發酵溫度對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響如圖6 所示。

圖6 發酵溫度對發酵液中可溶性肽含量及鮮味強度的影響Fig.6 Effects of the fermentation temperature on the soluble peptide content and the umami intensity in fermentation broths

由圖6 可知，在20 ℃下發酵，鮮味強度達到最高值11.48，而此時可溶性肽含量也較少；其次是35 ℃，鮮味強度為10.72，此時可溶性肽含量最多，達到50.05 mg/g。由于發酵溫度過低會導致微生物生長緩慢，而溫度過高會使菌體死亡[26]，均不利于微生物的生長[27]，所以綜合考慮，選擇發酵溫度35 ℃為最佳水平。

2.4 響應面Box-Behnken 試驗設計優化

2.4.1 響應面優化結果和方差分析

根據單因素試驗結果，三因素三水平Box-Behnken響應面試驗的設計方案及結果如表3 所示。

表3 響應面設計方案及結果Table 3 Design scheme and the results of Box-Behnken response surface experimental

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗數據進行二次多元回歸擬合，得到發酵液的可溶性肽含量（Y1）與鮮味強度（Y2）對編碼自變量A（接種量）、B（底物添加量）、C（發酵溫度）的回歸方程為Y1=47.08+0.61A+3.23B+0.068C+0.28AB-0.37AC-0.48BC-5.13A2-6.11B2-2.42C2；Y2=13.66+0.44A-0.25B+1.07C-0.5AB-0.81AC+0.17BC-1.38A2-0.36B2-2.82C2。對上述回歸模型進行方差分析，結果見表4 和表5。

表4 可溶性肽含量方差分析Table 4 Analysis of variance（ANOVA）for the soluble peptide content

表5 鮮味強度方差分析Table 5 Analysis of variance（ANOVA）for the umami intensity

由表4 可知，可溶性肽含量的回歸模型達到極顯著水平（P＜0.000 1），方程的失擬項不顯著（P=0.159 4＞0.05），說明該模型擬合度良好，回歸方程的可信度高，適用于發酵工藝的優化。信噪比為19.357（＞4），R2=0.983 3，說明多肽濃度的預測值與實際值直接有很好的擬合度；由表5 可知，鮮味強度的回歸模型達到極顯著水平（P＜0.000 1），方程的失擬項不顯著（P=0.107 3＞0.05），信噪比為20.932（＞4），R2=0.981 0，說明鮮味強度的預測值與實際值直接有很好的擬合度。綜上，可以用此模型預測和分析微生物發酵鵝骨制備鮮味肽的發酵工藝。各因素交互作用對可溶性肽含量及鮮味強度的影響見圖7。

圖7 各因素交互作用對可溶性肽含量和鮮味強度影響的等高線圖和響應曲面圖Fig.7 Contour maps and response surface plots of the effects of factor interactions on the soluble peptide content and the umami intensity

2.4.2 模型驗證

利用Design-Expert 8.0.6 軟件預測出鵝骨鮮味肽的最佳發酵工藝條件為菌株接種量3.14%、底物添加量8.38%、發酵溫度35.67 ℃，預測可溶性肽含量為47.444 1 mg/g，鮮味強度為13.712 5。根據試驗的實際操作條件，對發酵的工藝參數調整為接種量3%、底物添加量8.5%、發酵溫度36 ℃，在此條件下對模型進行驗證，得到實際的可溶性肽含量為45.86 mg/g（誤差3.34%）；鮮味強度為14.03（誤差2.32%）。因此，基于響應面法得到的優化工藝參數準確、可靠，可用于實際運用。

2.5 多肽鑒定及組學分析

根據文獻報道，大多數鮮味肽所含的氨基酸數量通常在10 個以內，如Gao 等[28]從蛋黃中分離出的六肽APYSGY、七肽AGFMPLP 和十肽VAMNPVDHPH；Li等[29]從蛤蜊水提物中分離出的八肽RPNPFENR；Xie等[30]從火腿中分離出的九肽GPAGPAGPR 等。利用這一特點，對質譜鑒定出的肽進行了初步簡單的篩選，共篩選出147 條氨基酸數量在10 個及10 個以下的肽，如圖8 所示。

圖8 初篩后所得潛在鮮味肽的長度分布Fig.8 The kength distribution of potential umami peptides obtained after primary screening

由圖8 可知，本研究得到的發酵液中潛在的鮮味肽集中在六到十肽，其中六肽最多，達到67 條，占比45.58%，其次是七肽（34 條，占比23.13%），這可能是由于分子量較小的肽具有更強的鮮味強度[31]。

對初篩得到的肽的來源蛋白進行分析，結果如圖9 所示。

圖9 初篩后所得潛在鮮味肽的來源蛋白統計Fig.9 Source protein statistics of potential umami peptides obtained after primary screening

由圖9 可知，鵝骨發酵所得的潛在鮮味肽來自膠原蛋白（31.97%）、鋅指蛋白（3.4%）及其他雜蛋白，其中主要來源是膠原蛋白。

3 結論

本研究以可溶性肽含量為指標，篩選出植物乳桿菌LP-12 用來發酵鵝骨，制備了鮮味肽粗提物。對影響發酵的接種量、底物添加量、發酵時間、發酵溫度進行了單因素試驗，并在此基礎上設計了Box-Behnken試驗進行響應面優化，以可溶性肽含量和鮮味強度為響應值，優化出最佳發酵工藝條件：LP-12 接種量3%、底物添加量8.5%、發酵溫度36 ℃、發酵時間24 h，此時，可溶性肽含量為45.86 mg/g，鮮味強度為14.03。對鮮味粗肽鑒定及篩選后得到147 條氨基酸數量在10 以下的潛在鮮味肽，通過多肽組學分析得知，其中大多數肽來源于膠原蛋白。本研究為鵝骨的高值化應用及鮮味肽的開發利用提供了理論支撐與試驗依據，并為膠原蛋白的應用開辟了新的研究方向。

綜上所述，通過微生物發酵鵝骨可以有效獲得潛在的鮮味肽，但是成分依然繁雜不純，且鮮味特征和呈鮮機制并不明晰。后續的研究應致力于建立一條快速的鮮味肽純化及篩選路線，盡可能得到較純的鮮味肽，并探明其具體的味覺特征，闡明其鮮味作用機制。