納米塑料和酮康唑對霍甫水絲蚓腸道的影響

陸光華,喻葉庭,薛 琪,劉建超(河海大學環境學院,淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室,江蘇 南京 210098)

隨著個人護理品(PCPs)的生產和使用量與日俱增,其中添加的殺菌劑等活性成分和微塑料(MPs)等非活性成分引起了廣泛關注.在中國,每年因沐浴露和潔面乳的使用而釋放到環境中的微塑料分別為39 和307t[1-2].PCPs 中的活性成分和MPs 通過生活污水、工業廢水、污水處理廠尾水等排到自然水體中,并蓄積在沉積物系統.酮康唑(KCZ)是廣泛添加在PCPs 中的廣譜抗真菌劑,已在全球各地的沉積物系統中廣泛檢出.KCZ 急性暴露降低了蛋白核小球藻的細胞活性,并誘導細胞凋亡和氧化損傷[3].

在PCPs 中添加的MPs 可能在機械加工等過程中破碎形成潛在危害更大的納米塑料(NPs),環境MPs 也會不斷降解形成NPs[4-5].NPs 的高比表面積和疏水性使其容易吸附環境中的疏水性有機污染物,被底棲動物攝取進入腸道后,在各種消化酶的促進下可能發生解吸,已解吸的污染物和未解吸的污染物則繼續穿過各類生物屏障而轉移到各個組織和器官,進而產生毒理學效應[6].此外,納米粒子的表面功能化對其穩定性、在生物介質中的分散、生物相容性和生物分布至關重要[7].比如,氨基修飾聚苯乙烯納米塑料(PSNH2)接觸海膽胚胎會導致畸形并抑制胚胎的早期發育,而羧基修飾聚苯乙烯納米塑料(PSCOOH)對胚胎發育幾乎沒有影響[8].此外,由于帶電NPs 和質膜之間的靜電相互作用,如與受體蛋白、粘蛋白和磷脂結合,NPs 很容易跨越生物屏障并引起毒性[9].NPs 的表面官能團所帶的電荷是決定NPs 內化到上皮細胞和隨后的細胞毒性的關鍵因素[10].

本文以原始聚苯乙烯NPs、PSNH2、PSCOOH和環境相關濃度的KCZ 為目標污染物,以底棲環節動物霍甫水絲蚓(Limnodrilus hoffmeistteri)為模式生物,研究NPs 對KCZ 誘導的霍甫水絲蚓腸道損傷及腸道菌群失調的影響,以期為理解PCPs 相關污染物復合污染對底棲生物的交互作用提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

參照OECD 225 方法進行人工沉積物制備[11].酮康唑(≥98%)購自南京榮華科學器材有限公司,100nm 原始聚苯乙烯(PS)、PSNH2和PSCOOH綠色熒光微球購自天津賽爾群科技有限公司.HPLC級甲醇和丙酮購自德國 Merck 公司(Darmstadt,Germany),胃蛋白酶、纖維素酶、D-乳酸鹽和二胺氧化酶測定試劑盒購自滁州仕諾達生物科技公司.霍甫水絲蚓購自天津市花鳥魚蟲市場.

1.2 暴露實驗

設置4 個處理組(KCZ、KCZ+PS、KCZ+PSNH2、KCZ+PSCOOH)和1 個空白對照組,包括3 組平行.根據OECD 225 方法[11]將KCZ 和NPs 添加到人工沉積物中,混合均勻.KCZ 和NPs 的暴露濃度為100ng/gdw,不會對水絲蚓產生急性毒性[12].取加標沉積物50g 置于250mL 燒杯中,加入曝氣超純水,使沉積物與上覆水的體積比約為1:4.室溫下避光靜置7d,使水-沉積物系統中污染物達到平衡狀態.

挑選大小和成熟度一致的霍甫水絲蚓100mg(約40 條)加入到每個處理組中,避光連續暴露7d.每天用曝氣超純水補足蒸發掉的水分,使上覆水與沉積物比例穩定.

1.3 KCZ 和NPs 的定量分析

在暴露第1,3,7d,收集沉積物和水絲蚓樣品,經冷凍干燥后,采用加速溶劑萃取儀(Dionex ASE 350,Sunnyvale,美國)萃取,將提取物通過旋轉蒸發至干燥,用2mL 甲醇超聲溶解,用0.22μm 有機濾膜(尼龍66)過濾.采用Waters AcquityTMUPLC-MS/MS(Waters,Miford,MA,USA)高效液相色譜-三重四極桿質譜系統測定KCZ 的濃度.沉積物和水絲蚓中KCZ 的檢測限(LOD)分別為2.5ng/g dw 和0.045ng/g ww(濕重),定量限(LOQ)分別為 8.3ng/g dw 和0.15ng/g ww.沉積物加標回收率為90.49%～112.59%,水絲蚓加標回收率為85.95%～122.13%[12].

在暴露第7d,將每個處理組中所有水絲蚓挑出,用超純水清洗干凈,吸干表面水分,稱重.然后取50mg 樣品并用10mL 的KOH(10% W/V,60°C)進行消化處理24h.參考Zhou 等[13]的方法,采用日立F-7000 熒光分光度計對NPs 進行定量,激發波長為488nm,發射波長為518nm.KOH 消解提取NPs 的熒光強度回收率在97%～109%.

1.4 腸道組織病理學分析和消化酶活性測定

暴露結束后,取水絲蚓1cm 腸道在4%多聚甲醛溶液中固定24h 以上.切片脫蠟至水,用蘇木精-伊紅染色,脫水封片,在顯微鏡下進行組織病理學觀察.

取水絲蚓腸道組織,按照1:9(m:V)的比例加入生理鹽水,制備組織勻漿液,3000r/min 離心10min,取上清液.根據試劑盒的操作步驟進行胃蛋白酶、纖維素酶、二胺氧化酶活性和D-乳酸鹽含量的測定.

1.5 腸道菌群16S rRNA 擴增子測序分析

暴露結束后,使用磁珠DNA 提取試劑盒從腸道內容物中提取微生物群的基因組DNA.通過ABI GeneAmp?9700PCR 熱循環儀(ABI, CA)擴增細菌16S rRNA 基因的高可變V3-V4 區域,采用的引物為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3').將同一樣本的PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.參照電泳初步定量結果, 將 PCR 產物用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統(Promega 公司)進行定量.然后建立MiSeq 文庫,進行Illumina 測序.

1.6 數據處理與分析

采用SPSS(ver. 26.0)對數據進行統計分析.各組之間的差異通過單因素方差分析和Tukey 檢驗進行評估,顯著性水平設定為P<0.05.生物信息分析采用QIIME(ver. 1.6.0)完成.通過 UPARSE(7.1, http://drive5.com/uparse/)對具有97%相似性截止的操作分類單元(OTU)進行聚類、識別和刪除擬合序列.通過RDP 分類器(http://rdp.cme.msu.edu/)用16S rRNA數據庫(SILVA SSU 128)的置信閾值分析每個OTU代表序列的分類.

2 結果與討論

2.1 KCZ 和NPs 在水絲蚓體內的累積

如圖1 所示,在單獨暴露組,蚓體內KCZ 的濃度隨暴露時間的增加而增加,但是第3d 和第7d 沒有顯著性差異.在聯合暴露組,KCZ 的濃度隨時間的增加逐漸降低.與KCZ 單獨暴露相比,除了共存的PSNH2在第1d 顯著增加了KCZ 的生物累積(P<0.05)外,NPs 的存在都顯著降低了KCZ 的生物累積水平(P<0.05).3 種NPs 對KCZ 生物累積的抑制率在第7d 達到最高(88.9%～94.8%).

塑料顆粒的尺寸是MPs 影響KCZ 生物有效性的主要因素之一,本實驗室以前的研究表明,100μm的PS 共暴露7d 顯著增加了KCZ 的累積[12],而本研究100nm PS 共存顯著降低了KCZ 的累積.NPs 的載體效應可能會增加污染物在生物體內的積累水平和毒性,表現出明顯的污染物增敏效應[14];也可能因為NPs 表面吸附了污染物后使團聚速率增加,從而降低了污染物在生物體內的生物有效性,表現出稀釋和抑制作用[15].研究發現,100nm 和1μm 的PS 在第7d 時顯著降低了菲在蚯蚓體內的累積,而10μm和100μm 的PS 在第7d 時顯著增加了菲在蚯蚓體內的累積[16].此外,污染物在NPs 表面與生物體之間的逸度梯度是影響其生物有效性的重要因素[17].隨著體內KCZ 濃度增加,使NPs 上負載的污染物濃度與生物體脂質中的污染物濃度之間存在負向的濃度逸度梯度,未吸附飽和的NPs 可以從生物體內競爭吸附污染物并排出[18],這可能是導致共暴露組生物體內KCZ 濃度逐漸降低的原因.

對比3 個共暴露組,PSNH2組在第1d 和3d 時KCZ 的累積水平顯著高于原始PS 和PSCOOH 組.這可能與它們在水中不同的聚集水平有關.有研究表明,PSCOOH 在水中傾向于形成微米尺寸的聚集體,而PSNH2在水中形成納米尺寸的聚集體[19],PSNH2聚集體具有更大的比表面積,使其吸附更多KCZ 進入生物體內,從而增加KCZ 的生物累積.

通過檢測第7d 時NPs 在生物體內的濃度,發現PSNH2的累積水平最低(2.78±0.86)ng/mg, 而PSCOOH 的累積水平最高(22.85±0.97)ng/mg,PS 次之(20.03±1.38)ng/mg.這一方面說明PS 的表面官能團影響了其自身的生物累積性[20];另一方面,對KCZ生物有效性的影響也不同,PSNH2的影響更大.

2.2 NPs 和KCZ 誘導的組織損傷

PS-KCZ 和PSNH2-KCZ 共暴露7d,水絲蚓的體重比對照組顯著降低,其他處理組與對照組沒有明顯差異.腸道組織形態的嚴重變化可能導致消化系統功能障礙以及能量代謝和營養攝入的改變[21],從而影響生物的生長發育.如圖2 所示,KCZ 和NPs 對表皮和腸道有損傷作用,可觀察到各種不連續的病理變化,包括表皮和腸細胞退化、表皮和腸細胞增生、表皮表面不規則和產氯組織變性.

圖2 不同暴露組水絲蚓腸道的組織切片Fig.2 Histopathology of the worm on Day 7 in different exposure groups

細胞的退化可隨著污染物濃度的增加而增加[22].KCZ 單獨暴露組和PSNH2與KCZ 共暴露組中水絲蚓表現出嚴重的細胞退化,可能與這兩組KCZ 的累積水平較高有關.此外,PSNH2與KCZ 共暴露組中水絲蚓腸道組織破環相比于其他暴露組更加嚴重.由于PSNH2比PSCOOH 穿過細胞的運輸率更高[23],PSNH2-KCZ 更容易進入腸細胞,誘導炎癥反應.另一個明顯的組織損傷是產氯組織變性,產氯組織是經過修飾的腹膜細胞,通過捕獲和儲存毒物來發揮解毒系統的功能,從而降低污染物的毒性作用[22].帶不同電荷的NPs 通過差異控制腸道穩態相關分子的表達,導致腸道屏障缺失,從而使KCZ 分子更容易直接作用于腸細胞,引發組織損傷.

2.3 NPs 和KCZ 對腸道消化酶活性的影響

暴露7d 后,如圖3 所示,所有暴露組中水絲蚓的胃蛋白酶活性都顯著低于對照組,KCZ 單獨暴露的抑制效應最強,抑制率為44.4%.KCZ 單獨暴露時顯著抑制了纖維素酶的活性,而共暴露增加了纖維素酶的活性,盡管官能團修飾的NPs 與KCZ 共暴露組纖維素酶活性與對照組沒有顯著性差異.PSNH2與KCZ 共暴露組D 乳酸鹽含量顯著下降,PSCOOH 與KCZ 共暴露組二胺氧化酶活性顯著降低,而其他處理組D 乳酸鹽含量和二胺氧化酶活性與對照組沒有顯著性差異.

圖3 不同暴露組水絲蚓胃蛋白酶(a)、纖維素酶(b)、二胺氧化酶(c)活性和D 乳酸鹽含量(d)Fig.3 Activities of pepsin(a), cellulose(b), D-lactate(c) and diamine oxidase(d) in different exposed groups on day 7

胃蛋白酶是一種由軟體動物肝胰腺分泌的蛋白水解酶,可將蛋白質分解為小片段肽和氨基酸,由細胞吸收.研究發現,一些藥物進入胃腸道會與胃蛋白酶相互作用,影響其結構和活性[24];聚丙烯MPs 膳食暴露顯著增加了淡水底棲軟體動物(Pomacea paludosa)胃蛋白酶活性[25].本文中共存NPs 減輕了KCZ 對胃蛋白酶的抑制效應,一方面可能與塑料顆粒對胃蛋白酶活性的誘導效應有關,另一方面與共暴露組水絲蚓體內KCZ 的累積水平顯著降低有關.

纖維素酶活性變化直接反映底棲生物分解有機質的能力[26].乙草胺暴露顯著降低了蚯蚓體內的纖維素酶活性[27],而PS-NPs暴露顯著增加了貽貝纖維素酶活性[28],底棲動物可能通過提高纖維素酶活性部分生物降解PS[29].

D 乳酸鹽作為細菌發酵的代謝產物可以由腸道中的各種細菌產生.當腸黏膜通透性增加時,腸道細菌產生的大量D 乳酸鹽會通過受損的黏膜進入血液,然后血清中D 乳酸鹽水平增加,腸組織中相應減少[30].二胺氧化酶也是腸道屏障通透性指標,其在腸粘膜中比在其他細胞中更高度活化[31].當腸道受損時,二胺氧化酶會以更高的速度釋放到血液中,從而導致組織中二胺氧化酶含量降低[32].與顆粒物的接觸可引起腸道通透性的改變,塑料顆粒更傾向于與脂質膜相互作用并改變生物膜的性質[33].腸道通透性改變是消化道受損的跡象[34],而消化道損傷將阻礙營養吸收和能量平衡,最終惡化機體健康.

2.4 NPs 和KCZ 對腸道微生物多樣性的影響

在水絲蚓腸道內容物中鑒定出1170 個OTUs.與對照組相比,KCZ 單獨處理組增加了 323 個OTUs,PS-KCZ 組增加了637 個OTUs,PSNH2-KCZ組增加了52 個OTUs,PSCOOH-KCZ 組增加了176個OTUs(圖4).與KCZ 單獨處理相比,原始NPs 的共存進一步增加了OTUs,而官能團修飾的NPs 的共存降低了OTUs.

圖4 不同處理組腸道微生物群的共有和特有OTUs 數量Fig.4 Shared and unique OTUs numbers in the different groups

如圖5 所示,厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidota)為優勢菌門,其相對豐度分別占總體的3.1%～86%,4.9%～64%和1.6%～20%.與對照組相比,KCZ 單獨暴露顯著提高了厚壁菌門相對豐度,降低了變形菌門和擬桿菌門的豐度;而共暴露降低了厚壁菌門的豐度,增加了變形菌門和擬桿菌門的豐度,尤其PSNH2與KCZ 共暴露組,變化最為顯著.

圖5 各處理組腸道微生物組成在門水平的相對豐度Fig.5 Relative abundance of intestinal microbial composition at phylum level in each treatment group

圖6 各處理組腸道微生物組成在屬水平的相對豐度Fig.6 Relative abundance of intestinal microbial composition at genus level in each treatment group

不同處理組水絲蚓腸道前50 個優勢菌屬的變化見圖 6.空白組優勢菌屬為促生乳桿菌屬(Levilactobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和鯨桿菌屬(Cetobacterium),KCZ 單獨暴露組優勢菌屬為促生乳桿菌屬(Levilactobacillus) 、 片球菌屬(Pediococcus)和腐敗乳桿菌屬(Loigolactobacillus).NPs 的共存改變了優勢菌屬的組成,除了促生乳桿菌屬仍是優勢菌屬外,羅河桿菌屬(Rhodanobacter)和弧菌屬(Vibrionimona)成為所有共暴露的優勢菌屬,而噬幾丁質菌屬(Chitinophaga)和分支桿菌屬(Mycobacterium)成為KCZ-PSNH2共暴露組特有的優勢菌屬.

腸道微生物群在維持腸道上皮的屏障功能中起著至關重要的作用,并參與調節宿主生物的許多生理功能[35].近年來,不同的動物模型研究都報道了抗真菌劑對腸道微生物群的影響.抑霉唑和多菌靈暴露28d 可能通過改變厚壁菌、變形桿菌和放線菌豐度誘導小鼠結腸炎癥和腸道微生物群失調[36-37].1000μg/L 的抑霉唑暴露21d 誘導了成年斑馬魚腸道微生物群失調,變形桿菌和擬桿菌豐度減少,而梭桿菌和厚壁菌豐度增加[38],這與本研究 KCZ 單獨暴露結果一致.研究發現,150μm PS-MPs 會引起水生生物腸道菌群失調[39].化學修飾可能加劇NPs 對腸道微生物多樣性的影響,Qiao等[40]發現不同官能團修飾的NPs 對小鼠腸道細菌的影響順序為氨基修飾NPs>羧基修飾NPs>未修飾的NPs.

在門水平上,變形菌門和擬桿菌門與機體的免疫防御功能有關,其豐度下降不利于生物體防御外源污染[38].厚壁菌門/擬桿菌門的比例與營養攝入和健康狀況呈正相關[41].而NPs 的共存導致厚壁菌門豐度降低,擬桿菌門豐度增加,表明水絲蚓腸道中能量攝入減少,這可能是導致共暴露組水絲蚓體重顯著下降的原因之一.變形菌是一種已知的包含多種條件致病菌的門[40],NPs 共存不利于KCZ 對致病菌的消除.擬桿菌與纖維素的消化密切相關[41],前述共存的NPs 緩解了KCZ 對纖維素酶活性的抑制效應,這可能與擬桿菌豐度增加有關.

在屬水平上,羅河桿菌屬、弧菌屬、噬幾丁質菌屬和分支桿菌屬都屬于革蘭氏陰性菌,含有多種致病菌,由革蘭氏陰性菌產生的脂多糖是對腸道屏障功能有害的物質[42],因此其過度生長往往伴隨著腸道屏障功能的惡化[43].這表明NPs 的共存降低了 KCZ 對致病菌的抑制效應,特別是與PSNH2共存使優勢菌屬全部變成致病菌,增加了水絲蚓感染的風險.

3 結論

3.1 3 種NPs 在霍甫水絲蚓體內的累積水平不同,PSNH2的生物累積性最低;除了PSNH2在共暴露第1d 促進了KCZ 的生物累積,其他情況下共存NPs 均降低了KCZ 的生物累積水平.

3.2 3 種NPs 的共存顯著降低了KCZ 對胃蛋白酶和纖維素酶活性的抑制;官能團修飾NPs 增加了水絲蚓腸道通透性,加重了KCZ 誘導的腸道損傷.

3.3 KCZ 單獨暴露顯著增加了水絲蚓腸道微生物的多樣性,官能團修飾NPs 的共存使微生物多樣性降低,并改變了門水平的豐度和優勢菌屬,尤其是PSNH2共存時優勢菌屬均為致病菌,增加了水絲蚓感染的風險.