慢性鼻竇炎患者MMP-9的表達及與上皮間質轉化的相關性研究

宋喜 葛益林 李殷 宋輝 成嘉明

摘要：目的 探討基質金屬蛋白酶（MMP）-9參與慢性鼻竇炎（CRS）上皮間質轉化（EMT）的過程及機制。方法 收集42例需手術治療的CRS患者息肉樣變的中鼻甲組織以及8例行鼻中隔成形術患者的中鼻甲組織，免疫組織化學染色、qPCR和Western blot檢測MMP-9的表達。體外培養原代人鼻上皮細胞HNEpc，分為Control組、TGF-β1組（5 μg/L TGF-β1干預）和TGF-β1+si-MMP-9組（轉染si-MMP-9和5 μg/L TGF-β1干預）。細胞免疫熒光染色檢測MMP-9表達，Western blot檢測TGF-β1、MMP-9和EMT相關蛋白E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達。結果 （1）CRS伴鼻息肉（CRSwNP）組患者鼻黏膜組織中MMP-9表達陽性率（54.5%，12/22）明顯高于CRS不伴息肉（CRSsNP）組（25.0%，5/20）和對照組（12.8%，1/8）。CRSwNP組患者鼻黏膜中MMP-9 mRNA和蛋白相對表達水平均高于CRSsNP組和對照組（P＜0.05）。（2）與Control組相比，TGF-β1組TGF-β1、MMP-9、vimentin、α-SMA表達升高，E-cadherin表達下降（P＜0.05）。與TGF-β1組相比，TGF-β1+si-MMP-9組TGF-β1、MMP-9、vimentin、α-SMA表達下降，E-cadherin表達升高（P＜0.05）。結論 CRS患者MMP-9表達升高，其可能通過調控EMT來參與CRS發生發展。

關鍵詞：慢性鼻竇炎；MMP-9；TGF-β1；上皮間質轉化；組織重塑

中圖分類號：R765.4文獻標志碼：ADOI：10.11958/20231439

Expression of MMP-9 in patients with chronic rhinosinusitis and its correlation with

epithelial-mesenchymal transition

SONG Xi， GE Yilin△， LI Yin， SONG Hui， CHENG Jiaming

Department of Otolaryngology， Head and Neck Surgery， Changsha First Hospital， Changsha 410005， China

△Corresponding Author E-mail： paigug@163.com

Abstract： Objective To investigate the mechanism of matrix metalloproteinase （MMP）-9 involved in epithelial mesenchymal transformation （EMT） in chronic sinusitis （CRS）. Methods The expression of MMP-9 from polypoid middle turbinate tissue was detected by immunohistochemical staining qPCR and Western blot assay in 42 patients with CRS and 8 patients underwent septoplasty. Primary human nasal epithelial cells HNEpc were cultured in vitro and divided into the control group， the TGF-β1 group （5 μg/L TGF-β1 intervention） and the TGF-β1+si-MMP-9 group （transfected with si-MMP-9 and 5 μg/L TGF-β1 intervention）. The expression of MMP-9 was detected by cell immunofluorescence staining. Expression levels of TGF-β1， MMP-9 and EMT-related proteins E-cadherin， vimentin and α-SMA were detected by Western blot assay. Results （1） The positive expression rate of MMP-9 was significantly higher in the nasal mucosa of CRS with nasal polyps （CRSwNP） group （54.5%， 12/22） than that of the CRS without polyps （25.0%， 5/20） group and the control group （12.8%， 1/8）. The relative expression levels of MMP-9 mRNA and protein in nasal mucosa were higher in the CRSwNP group than those in the CRSsNP group and the control group （P＜0.05）. （2） Compared with the control group， the expressions levels of TGF-β1， MMP-9， vimentin and α-SMA were increased in the TGF-β1 group， while the expression of E-cadherin was decreased （P＜0.05）. Compared with the TGF-β1 group， expression levels of TGF-β1， MMP-9， vimentin and α-SMA were decreased in the TGF-β1+si-MMP-9 group， and the expression of E-cadherin was increased （P＜0.05）. Conclusion The expression of MMP-9 is increased in CRS patients， which may be involved in the development of CRS through the regulation of EMT.

Key words： chronic sinusitis; MMP-9; TGF-β1; epithelial mesenchymal transformation; tissue remodeling

慢性鼻竇炎（CRS）是一種由多種因素導致的鼻竇黏膜疾病，其特征是炎性細胞浸潤、上皮細胞分化改變和組織重塑［1］。該病治療效果不理想，發作頻繁，需反復手術治療，是耳鼻喉科棘手的問題之一［2］。根據鼻內鏡檢查結果將CRS分為2種表型：CRS伴鼻息肉（CRSwNP）和CRS不伴息肉（CRSsNP），兩者臨床表現有較大的異質性。近年來研究發現，細胞外基質（ECM）的沉積是鼻竇炎從慢性炎癥進展為息肉的主要因素［3］?；|金屬蛋白酶9（MMP-9）是基質金屬蛋白酶家族成員之一，其在調節ECM平衡中起著關鍵的作用，不僅直接影響ECM成分的降解、合成和轉運，還可以募集炎性細胞分泌炎性因子，調節ECM性狀［4-5］。雖然具體的發病機制尚不明確，但目前認為上皮間質轉化（EMT）在其中發揮了重要的作用。在此過程中，上皮細胞的極性消失，同時出現具有間質細胞特征的蛋白表達升高、ECM成分改變、細胞遷移和運動能力增加的現象。MMP-9能否通過EMT影響CRS的病理生理過程，具體機制暫未闡明。本研究擬通過體內和體外研究探討CRS患者鼻黏膜組織中MMP-9的表達及MMP-9參與調節EMT來影響CRS的作用機制，為CRS的診治提供新的治療靶點及理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年5月—2022年5月長沙市第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科就診的CRS患者42例。包括22例CRSwNP患者［CRSwNP組，男12例，女10例，平均年齡（40.5±4.1）歲］和20例CRSsNP患者［CRSsNP組，男12例，女8例，平均年齡（40.2±4.1）歲］。另收集同期8例行鼻中隔成形術患者作為對照組，男4例，女4例，平均年齡（41.3±3.5）歲。病例組納入標準：（1）病程大于3個月，經藥物治療后無改善，包括全身抗生素和局部類固醇至少14 d。在篩竇和（或）上頜竇手術期間收集所有CRS患者的鼻黏膜或息肉組織；對照組取中鼻甲黏膜組織，取材后于-80 ℃冰箱保存。本研究經過長沙市第一醫院倫理委員會批準（批準號：KX-20200079），所有患者知情同意。

1.2 主要試劑 原代人鼻上皮細胞HNEpc購自中國北京BeNa細胞培養庫，接種于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養。Lipofectamine 2000細胞轉染試劑購自美國Invitrogen公司，人MMP-9免疫組化染色試劑盒購自上海圻明生物科技有限公司。人MMP-9酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。兔抗人MMP-9、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和β-actin一抗購自南京建成生物工程研究所，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗購自上海研卉生物科技有限公司。

1.3 免疫組化染色檢測MMP-9表達 將3組鼻息肉或黏膜組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚度5 μm）。脫蠟處理后滴加MMP-9（1∶500）一抗。PBS洗3次后，滴加辣根過氧化物酶偶聯的IgG二抗（1∶1 000），37 ℃孵育45 min，然后再次在PBS中洗滌，并與親和素-孵育生物素過氧化物酶孵育30 min。水洗后用蘇木精染色，水洗后甘油封片，顯微鏡下觀察。由2名病理學醫師評價MMP-9表達水平，參照文獻［6］計算陽性表達率。

1.4 qPCR 分別取3組鼻息肉或黏膜組織，Trizol法提取總RNA后逆轉錄為cDNA，采用qPCR檢測組織中MMP-9表達。MMP-9引物：上游5'-CAGTACCGAGAGAAAGCCTATT-3，下游5'-CAGGATGTCATAGGTCACGTAG-3'。內參GAPDH引物：上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。25 μL反應體系包含cDNA 3 μL，上、下游引物各1 μL，PCR mix 10 μL，DNAse-free H2O 10 μL。反應參數：95 ℃變性5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，實驗重復3次。

1.5 細胞培養及分組干預 取約1×104個HNEpc細胞接種于含1%雙抗、10%FBS的RPMI 1640培養基中，37 ℃、5%CO2培養24 h后接種于六孔板中。細胞分為對照組、TGF-β1組和TGF-β1+si-MMP-9組，TGF-β1組加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1［7］，對照組添加等體積的培養基。TGF-β1+si-MMP-9組在TGF-β1干預前24 h參照Lipofectamine 2000說明書轉染si-MMP-9。分組處理結束后繼續培養48 h，收集細胞，用于后續實驗。

1.6 免疫熒光染色檢測MMP-9表達 3組細胞用4%多聚甲醛固定，用0.5% Triton X-100通透30 min，5% BSA在室溫下孵育1 h。滴加MMP-9一抗與Alexa Fluor 594-驢抗兔lgG抗體，最后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染。使用共聚焦顯微鏡觀察染色圖像，統計MMP-9陽性細胞數，實驗重復3次。

1.7 Western blot檢測蛋白表達 3組組織和細胞在4 ℃下用裂解液裂解30 min，12 000 r/min離心15 min分離上清液，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度。每個樣本取20 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE，濕轉法恒流20 mA轉膜50 min將目的蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉在室溫下封閉1.5 h，根據研究目的，添加TGF-β1、MMP-9、E-cadherin、vimentin、α-SMA和β-actin一抗（均為1∶1 000稀釋），于4 ℃孵育過夜。次日PBS洗膜3次，每次5 min，在室溫添加辣根過氧化物酶偶聯IgG二抗（1∶2 000），孵育90 min，使用增強型化學發光系統檢測蛋白表達，并計算相對表達量，實驗重復3次。

1.8 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析，計量數據符合正態分布用[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者MMP-9表達情況及陽性率 免疫組化染色結果顯示，MMP-9主要表達于黏膜上皮細胞中，呈棕黃色染色，見圖1。與對照組（12.5%，1/8）和CRSsNP組（25.0%，5/20）相比，CRSwNP組患者鼻黏膜組織中MMP-9表達陽性率（54.5%，12/22）明顯升高，差異有統計學意義（χ2=6.252，P＜0.05）。

2.2 3組患者中MMP-9和TGF-β1表達水平比較 Western blot結果顯示，與對照組相比，CRSwNP組和CRSsNP組MMP-9 mRNA和蛋白、TGF-β1蛋白表達升高（P＜0.05），與CRSsNP組相比，CRSwNP組MMP-9 mRNA和蛋白、TGF-β1蛋白表達升高（P＜0.05），見圖2、表1。

2.3 3組細胞中MMP-9表達變化 細胞免疫熒光染色結果顯示，Control組可見少量細胞表達MMP-9，TGF-β1組可見大量細胞表達MMP-9。與TGF-β1組相比，TGF-β1+si-MMP組MMP-9陽性細胞數減少，見圖3。

2.4 3組細胞中TGF-β1、MMP-9及EMT相關蛋白表達水平變化 見圖4、表2。與Control組相比，TGF-β1組TGF-β1、MMP-9、vimentin、α-SMA表達升高，E-cadherin表達下降。與TGF-β1組相比，TGF-β1+si-MMP-9組TGF-β1、MMP-9、vimentin、α-SMA表達下降，E-cadherin表達升高，敲低MMP-9表達后可逆轉EMT進程。

3 討論

CRSwNP和CRSsNP的病理形態和臨床表現差異較大，CRSsNP主要表現為鼻黏膜水腫、炎癥細胞浸潤、纖維化，但在CRSwNP中，可在黏膜下區域觀察到假性囊腫，這是由于結締組織內因異常間質液體積聚而形成的水腫腔［8-9］。組織重構是過敏性鼻炎或CRS鼻黏膜組織的重要病理改變，它可引起鼻黏膜固有層、黏膜下區域炎癥細胞浸潤、基底膜增厚、細胞水腫和纖維化，表現為慢性單核細胞和嗜酸性粒細胞浸潤、α-SMA和肌成纖維細胞增加、基底膜和黏膜下膠原沉積增加。然而，CRS尤其是CRSwNP患者的組織重塑和息肉形成的機制尚不清楚。MMP-9主要參與Ⅳ型膠原的降解，是鼻黏膜上皮細胞外基質和基底膜的重要組成部分。除了在細胞遷移和增殖中起作用外，MMP-9還被發現可調節微血管通透性和由此引起的下氣道水腫［10］。本研究發現，與對照組和CRSsNP組相比，CRSwNP組鼻黏膜組織中MMP-9的表達明顯升高，提示MMP-9可能參與了CRSsNP向CRSwNP的進展過程。Lygeros等［11］檢測了37例CRSwNP患者的鼻黏膜標本和12例健康對照者的鼻黏膜標本，發現CRSwNP患者的MMP-9 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，其可能是CRSwNP有價值的生物標志物和治療靶點，與本研究結果相一致。

EMT是上皮細胞失去上皮特性，獲得間充質特性并最終形成成纖維細胞的特征，這也是完全分化的上皮細胞發生表型轉化并發展成間充質細胞表型的過程［12］。近年來有研究發現，CRS存在EMT，它可誘導上皮細胞的丟失和肌成纖維細胞的分化［13-14］。TGF-β1是炎癥修復和重塑中的代表性細胞因子，其通過激活EMT信號促進鼻黏膜的組織重塑，在鼻息肉的形成和生長中發揮重要作用［15］。TGF-β1通過與細胞表面的Ⅰ型和Ⅱ型受體絲氨酸/蘇氨酸激酶結合啟動EMT信號通路，通過受體介導Smad轉錄因子的激活，調節基因表達。但目前有關CRSwNP中TGF-β1表達的報道尚不一致。有研究發現，與健康對照和CRSsNP患者相比，CRSwNP患者中TGF-β1表達明顯升高［16］；而另有研究認為，與CRSsNP組和正常對照組相比，CRSwNP組TGF-β1表達水平較低［17］。本研究結果顯示，CRSwNP患者鼻黏膜組織中TGF-β1表達水平高于其他兩組。為進一步為探討其具體作用機制，本研究通過TGF-β1誘導HNEpc細胞后，發現與對照組相比，TGF-β1組TGF-β1、vimentin、MMP-9、α-SMA蛋白表達明顯升高，E-cadherin表達明顯下降，提示HNEpc發生了EMT，而經過轉染si-MMP-9后，TGF-β1、vimentin、MMP-9、α-SMA蛋白表達明顯下降，E-cadherin表達明顯升高，提示敲低MMP-9可延緩TGF-β1誘導HNEpc細胞后的EMT進程。綜上所述，CRS患者MMP-9表達升高，其可能通過促進EMT來誘導鼻黏膜組織重塑。

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（2023-09-20收稿 2023-11-06修回）

（本文編輯 胡小寧）