血清miR-31、IL-22 聯合檢測在兒童病毒性心肌炎診斷及預后評估中的價值

李瑩瑩 姚曉利 鄭瑞利 何坤

病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是由流感病毒、柯薩奇病毒及腺病毒等病毒感染引起心肌組織炎癥反應，導致心肌細胞代謝功能異常，進而引起心律失常、心源性休克及心力衰竭等嚴重后果［1］。目前臨床上對于VMC 診斷的金標準為心肌活檢，但心肌活檢存在技術難度高、創傷大等問題，不能在臨床上廣泛應用，而心肌生物標記物檢測則因為操作方便而備受臨床關注［2］。微小RNA-31（microRNA-31，miR-31）是一種非編碼鏈RNA 分子，通過與靶基因mRNA 結合，能夠調控基因轉錄后的表達水平，進而調控細胞增殖、分化與凋亡，且在免疫反應和炎癥反應等進程中具有重要作用［3］。白細胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）是由免疫細胞分泌的一種細胞因子，能夠調節炎癥反應、維持穩態、免疫反應及組織修復等，在心肌炎、動脈粥樣硬化及心肌梗死等多種心血管疾病的發生發展過程中具有重要作用［4］。本研究通過分析血清miR-31、IL-22 聯合檢測在兒童VMC 診斷及預后評估中的價值，為臨床診治提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至2022 年1 月河南省兒童醫院心血管內科收治的106 例VMC 患兒，將其命名為VMC 組，平均年齡（6.34±1.46）歲；男性59 例，女性47 例。納入標準：①均符合病毒性心肌炎的相關診斷標準［5］；②年齡≤14 歲；③臨床資料基本完整。病例排除標準：①合并存在先天性心臟病或其它類型心肌炎者；②合并存在遺傳代謝性疾病者；③合并存在嚴重感染性疾病者；④近期存在心臟疾病手術史者；⑤近期存在使用免疫抑制劑、干擾素及血液制品治療者。另選70 名同期在本院體檢的健康兒童作為對照組，平均年齡（6.68±1.54）歲；男性40 例，女性30 例。本研究已獲取醫院倫理委員會審查批準，所有參加研究兒童的監護人均簽署知情同意書。

1.2 心電圖與超聲心動圖檢測

采用多導聯心電分析系統對兩組進行心電圖檢測，記錄心室除極時間，即QRS 間期；記錄P 波終點至QRS 波群起點的時間間隔，即PR 間期。

采用彩色多普勒超聲診斷儀對兩組進行超聲心動圖檢測，參數設置：頻率4 MHz，幀頻60/s。記錄左室射血分數（Left ventricular ejection fraction，LVEF）與左心室短軸縮短率（Left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.3 血清指標檢測

于清晨下采集兩組的靜脈血5 mL，在5 000 r/min（4℃，半徑10 cm）下進行離心15 min 后，將上層血清置入-80℃冰箱保存待檢。①miR-31 檢測：以熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測血清miR-31 的表達水平。以Trizo 試劑盒（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）提取血清的總RNA，以反轉錄試劑盒（上海滬震生物科技有限公司）進行反轉錄合成cDNA，相關反應條件如下：90℃變性30 s；60℃退火40 s；70℃延伸60 s，共30 個循環。引物序列如下：F：5′-CAGGCACGCTGCGGACAGCCA-3′；R：5′-TGGTGCAGTGCAGCCGAGGT-3′。根據2-ΔΔCt法計算miR-31 的相對表達量。②IL-22 與肌酸激酶同工酶檢測：以酶聯免疫吸附法檢測血清IL-22與肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme，CK-MB）水平，按照試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）說明書進行檢測操作；③心肌肌鈣蛋白Ⅰ檢測：以免疫化學發光法檢測血清心肌肌鈣蛋白T（Cardiac troponin T，cTnT）水平，按照試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）說明書進行檢測操作。

1.4 調查方法

在治療結束后以門診定期復查或電話聯系等方法對VMC 患兒進行隨訪，每3 個月隨訪1 次，時長為1 年。以隨訪期間發生恢復遷延、擴張性心肌病、遺留心律失常及患兒死亡等事件為預后不良，隨訪截止時間為2023 年1 月或患兒出現死亡，結果顯示，預后良好的患兒為78 例，預后不良的患兒為28 例。收集可能對VMC 患兒預后存在影響的因素，包括年齡、性別、血清miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT 水平及QRS 間期、PR 間期、LVEF 與LVFS 等相關信息。

1.5 統計學方法

以SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（）表示，采用獨立樣本t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；采用多因素Logistic 回歸分析影響因素；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒診斷及預后不良評估的價值，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清指標與心電圖、超聲心動圖參數比較

VMC 組的血清miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT水平及QRS 間期、PR 間期均高于對照組，LVEF、LVFS 均低于對照組差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清指標與心電圖、超聲心動圖參數比較（）Table 1 Comparison of serum indexes，electrocardiogram and echocardiogram parameters between the two groups（）

表1 兩組血清指標與心電圖、超聲心動圖參數比較（）Table 1 Comparison of serum indexes，electrocardiogram and echocardiogram parameters between the two groups（）

2.2 血清miR-31、IL-22 對VMC 診斷的預測價值

ROC 曲線顯示，血清miR-31、IL-22 水平二者聯合檢測對VMC 診斷高于單一檢測（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 血清miR-31、IL-22水平對VMC診斷的ROC曲線分析Figure 1 ROC curve analysis of serum miR-31 and IL-22 levels for VMC diagnosis

表2 血清miR-31、IL-22 對VMC 診斷的預測價值Table 2 Predictive value of serum miR-31 and IL-22 in diagnosis of VMC

2.3 VMC 患兒預后單因素分析

對影響VMC 患兒預后不良的因素進行分析，miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT、QRS 間期、PR 間期、LVEF 及LVFS 均是VMC 患兒預后不良的影響因素，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 VMC 患兒預后單因素分析［n（%），（）］Table 3 Univariate analysis of prognosis in children with VMC［n（%），（）］

表3 VMC 患兒預后單因素分析［n（%），（）］Table 3 Univariate analysis of prognosis in children with VMC［n（%），（）］

2.4 VMC患兒預后不良的多因素Logistic回歸分析

以VMC 患兒是否出現預后不良為因變量，將收集的基本資料為自變量進行Logistic 回歸分析。結果顯示，miR-31 水平高表達、IL-22 水平升高、CK-MB 水平升高、cTnT 水平升高、QRS 間期延長、PR 間 期延長、LVEF降低及LVFS 降低均 是VMC 患兒預后不良的獨立危險因素。見表4。

表4 VMC 患兒預后不良的多因素Logistic 回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of poor prognosis in children with VMC

2.5 血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒預后不良的預測價值

ROC 曲線顯示，血清miR-31、IL-22 水平聯合的預測價值高于單一檢測（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒預后不良的ROC 曲線分析Figure 2 ROC curve analysis of serum miR-31 and IL-22 levels on poor prognosis in children with VMC

表5 血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒預后不良的預測價值Table 5 Predictive value of serum miR-31 and IL-22 levels for poor prognosis in children with VMC

3 討論

VMC 具有多種表現形式，在急性期病毒被清除后，患者僅表現為疲勞和呼吸短促等非特異性癥狀，但病毒感染持續存在可能會引起自身免疫介導的持續性炎癥反應，嚴重的情況下會發生暴發性心肌炎，導致病情迅速進展，具有較高的死亡率［6］。宋微等［7］研究認為，VMC 與病毒直接損傷心肌組織、機體自身的免疫反應、遺傳因素和氧化應激反應作用等因素相關，機體在受到病毒感染后，能夠激活炎癥信號通路清除病毒，但同時會促進大量炎癥因子分泌，放大炎癥反應，進而造成心肌組織損害。Xia K 等［8］研究指出，VMC 在兒童的發病率呈上升趨勢，心肌細胞的慢性炎癥可引起心肌細胞生長抑制、肥大、凋亡和心肌纖維化，從而引起擴張性心肌病和心力衰竭，如果診斷和治療不及時，會嚴重影響VMC 患兒的預后。因此，尋找有效的VMC 診斷標志物

對患兒的臨床治療和預后具有積極意義。microRNA 是一種長約20～25 個核苷酸的單鏈RNA 分子，能夠調節靶基因的表達參與調控心肌細胞凋亡與炎癥反應、調節宿主免疫機制以及影響病毒感染的過程等多種方式影響VMC 的進展，在VMC 生理病理的發展過程中具有重要作用［9］。miR-31 是microRNA 家族成員，Climent M 等［10］研究表明，miR-31 參與調節機體的氧化應激反應，促使心肌細胞凋亡。陳策等［11］研究指出，miR-31 能夠調節炎癥反應參與VMC 的發病機制，其表達水平與VMC 的病情密切相關，而且miR-31 通過參與調節免疫細胞，影響調節性T 細胞的分泌，進而影響VMC 的病理過程。本研究結果提示miR-31可以作為診斷VMC 的指標。IL-22 是一種重要的促炎介質，具有調節免疫應答、抗微生物感染以及促進組織修復等多種作用，與心肌細胞的炎癥反應相關［12］。吉思等［13］研究表明，IL-22 與心臟炎癥和心肌細胞凋亡密切相關，進而參與VMC 的發生發展過程。王芳娟等［14］研究指出，VMC 的發生與病毒引起的免疫反應異常都和心肌細胞損傷相關，而IL-22 參與病毒對機體VMC 的直接損傷，導致病情的發生發展。本研究結果提示IL-22 可以作為診斷VMC 的指標。

本研究采用多因素Logistic 回歸分析了對VMC 患兒預后不良的相關影響因素，結果顯示，miR-31 水平高表達、IL-22 水平升高、CK-MB 水平升高、cTnT 水平升高、QRS 間期延長、PR 間期延長、LVEF 降低及LVFS 降低均是VMC 患兒預后不良的獨立危險因素，了解相關危險因素對減少VMC 患兒預后不良情況發生具有積極意義。毛柳青等［15］研究認為，CK-MB 水平升高與心肌細胞受損密切相關。丁佩芳等［16］研究指出，cTnT 是心肌細胞的標志物之一，當心肌細胞受損后，游離的cTnT 進入血液循環，從而表現為血清cTnT 水平上升。盧志強等［17］研究表明，VMC 導致了傳導系統與心室肌除極的延緩以及室內傳導阻滯，導致QRS 間期與PR 間期延長，而且心肌損傷會影響心肌縱向運動下降，導致LVEF 與LVFS 降低。本研究進一步驗證血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒診斷及預后不良評估的預測價值，ROC 曲線分析表明，各單一指標均可對VMC 患兒診斷及預后不良進行預測，提示血清miR-31、IL-22 水平可作為VMC 患兒診斷及預后不良的診斷指標，且聯合檢測的敏感度和特異度更高。

綜上所述，miR-31、IL-22 在病毒性心肌炎患兒血清中呈高表達，可能成為兒童病毒性心肌炎診斷及預后評估的輔助預測指標。