河流弧菌核酸檢測試劑國家參考品的建立

任珊珊 麻婷婷 許四宏★

河流弧菌（Vibrio flurialis）是海洋中的一種常見致病菌，又名河流菌，河川弧菌等。該菌屬于革蘭氏陰性菌，是一種具有彎曲細胞形態和極性鞭毛的運動嗜鹽菌，是在弧菌屬中僅次于霍亂弧菌和副溶血性弧菌的致病性弧菌，可引起人類散發或爆發腹瀉。河流弧菌在許多國家的自然海水和海產品中相繼被檢出，其可引起魚類、蝦蟹類、貝類的敗血癥和膿包癥等。同時河流弧菌也可通過不潔海產品引起人類嚴重的流行性腹瀉，其被認為是一種全球性的人獸共患的新型病原菌［1］。河流弧菌抵抗力較強，在抹布和面板上能存活30 天以上，在冰箱中能存活76 天以上，被污染的食品、魚類均可成為傳播媒介［2］。中毒者多以惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉為主要癥狀，并多數伴有發熱，白細胞總數升高［3］。雖然河流弧菌可以進行培養，但因其與霍亂弧菌或氣單胞菌的表型相似，所以在鑒定上仍具有挑戰性。然而，利用分子檢測技術，可以準確的從臨床和不同的環境樣本中鑒別出河流弧菌［4］。目前我國雖已有相關企業成功研發河流弧菌核酸檢測試劑，但該類產品均無系統的質量評價和統一的質量標準，故尚未有核酸診斷試劑產品上市。國家參考品是相關診斷試劑質量評價的基礎，是審評審批的重要依據，建立創新型的質量評價方法，是評估診斷試劑產品性能的重要保障［5-7］。本研究擬開展河流弧菌核酸檢測試劑國家參考品的研制工作并制定其質量評價標準，用于評價河流弧菌核酸檢測試劑的陽性符合率、陰性符合率、檢測限及重復性，助力推進國內企業在研產品的質量優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考品原料來源

河流弧菌核酸檢測試劑參考品的樣本共計18份，均為培養的菌液經滅活后稀釋至生理鹽水中制備而成。所有樣本均來源于中國疾病控制中心（Chinese Center for Disease Control and Prevention，CDC）傳染病所。見表1?；魜y弧菌和副溶血弧菌樣本經56℃、30 min 滅活處理，其他臨床分離株樣本均經60℃、1 h滅活處理，并于-70℃及以下保存備用。

表1 臨床病原菌分離株信息Table 1 clinical pathogenic bacteria isolates information

1.1.2 檢測試劑

本研究使用試劑包括中山大學達安基因股份有限公司的河流弧菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（批號：2020001，規格：48 反應/盒）、江蘇碩世生物科技股份有限公司的河弧菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）（批號：20220802，規格：50 反應/盒）、蘇州天隆生物科技有限公司提的河弧菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）（批號：742210410，規格：50 反應/盒）共3 家企業的產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料篩選

從-80℃甘油保存管中復蘇至普通瓊脂培養基平板，在平板上挑單菌落至Luria-Bertani 培養基增菌液中增菌，取增菌液鑒定，對臨床病原菌進行初篩。

通過宏基因16S rRNA 測序方法對臨床病原菌進行復核，測序平臺為illumina Novaseq，PE150測序。測序獲得的原始數據，質控去除含adapter的reads、含N 比例大于10%的reads 和低質量reads，采用BWA 的分析方法，進行宿主過濾分析，組裝基因組序列，導入微生物數據庫比對，進行注釋與鑒定。

使用江蘇碩世生物科技股份有限公司的河弧菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）對臨床病原菌進行確認，并按照說明書規定的方法進行陰陽性判定。隨機抽取部分河流弧菌陽性樣本送至廣州微遠基因科技有限公司進行序列同源性分析。

1.2.2 參考品制備

將確認后的病原菌經離心、過濾、稀釋及分包裝后作為參考品的組盤樣本，分別編號為8 份陽性參考品P1～P8，10 份陰性參考品N1～N10，1 份檢測限參考品L 和1 份重復性參考品R。

1.2.3 協作標定

協作標定使用試劑包括中山大學達安基因股份有限公司、江蘇碩世生物科技股份有限公司、蘇州天隆生物科技有限公司共3 家企業的產品。盲編為A、B 和C，按照各自的產品說明書操作。評價項目包括陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、檢測限和重復性。

1.2.4 穩定性與均勻性研究

隨機抽取一套完整的河流弧菌核酸檢測試劑國家參考品和三支檢測限參考品L 放置于2～8℃和室溫環境中，并于第1、3、5、7 d 分別取出檢測限參考品L 用無RNA 酶的去離子水進行1∶101～1∶106倍稀釋，第7 天取出完整的參考品使用河弧菌核酸檢測試劑盒對2～8℃和室溫穩定性進行評估。另隨機抽取檢測限參考品L 一支，-20℃凍融1 次后用無RNA 酶的去離子水進行1∶101～1∶106倍稀釋，對凍融穩定性評估。

隨機抽取5 支重復性參考品R，使用河弧菌核酸檢測試劑盒對均勻性評估，用無RNA 酶的去離子水進行1∶10 和1∶100 稀釋，重復測定10 次，要求均為河流弧菌陽性。

1.3 統計學分析

使用SPSS 16.0 軟件進行統計分析。計量資料采用（），組間采用單因素方差分析。計算重復性參考品R（1∶10）和R（1∶100）各10 次。通過計算Ct 值的平均值（M）和標準差（SD），計算變異系數（CV，%），公式為CV=SD/M×100%，且其Ct 值的變異系數CV 均不大于5.0%。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本初篩、復核及確認

8 份河流弧菌毒株、10 份其他弧菌毒株進行初篩、復核、確認后均為其對應菌種。見圖1。

圖1 河流弧菌陽性樣本進化樹Figure 1 Evolutionary tree of Vibrio flurialis positive samples

2.2 參考品組成

經確定的河流弧菌核酸檢測試劑國家參考品由20 份樣本組成：8 份陽性參考品P1～P8、10份陰性參考品N1～N10、1 份檢測限參考品L 和1份重復性參考品R，L 經菌落計數法測定濃度為1×108CFU/mL。

2.3 協作標定結果

河流弧菌核酸檢測試劑的陽性符合率、陰性符合率、檢測限及重復性的協作標定結果顯示，3 種檢測試劑的陽性符合率（+/+）均為8/8，陰性符合率（-/-）均為10/10。檢測限指標，1∶104稀釋或更高濃度時應均為河流弧菌陽性，廠家A 為1∶107稀釋及以上濃度均能檢出，廠家B 為1∶106稀釋及以上濃度均能檢出，廠家C 為1∶105稀釋及以上濃度均能檢出。重復性指標，變異系數CV 均不大于5%。見表2。

表2 3 種試劑協作標定結果Table 2 Collaborative test results of 3 reagents

2.4 穩定性與均勻性結果

穩定性檢測結果顯示，檢測限參考品L 稀釋后，在2～8℃及室溫放置1 d、3 d、5 d 和7 d 檢測結果為1∶106稀釋及以上濃度均為陽性。放置于2～8℃和室溫7 d 的整套參考盤，陽性參考品P1～P8 和重復性參考品R 均為陽性，且Ct 值與0 d 相比差異無統計學意義（P＞0.05）；檢測限參考品L 為1∶106稀釋及以上濃度均為陽性；陰性參考品N1～N10 均為陰性。凍融1 次的檢測限參考品L 為1∶106稀釋及以上濃度均為陽性。結果見表3。均勻性檢測結果顯示，R（1∶10）和R（1∶100）的均勻性符合要求。

表3 河流弧菌核酸檢測試劑國家參考品穩定性考核結果Table 3 stability test on reference panel for Vibrio flurialis uncleic acid detection kits

3 討論

目前河流弧菌的檢測方法主要有傳統的細菌分離培養鑒定、熒光抗體檢測和以PCR 為基礎的分子生物學方法。使用傳統的河流弧菌檢測方法耗時長、操作復雜，不宜做大批量樣本的檢測。Hurtle W 等［8］報道了應用變性高效液相色譜快速鑒定細菌16SrRNA基因保守區的DNA 序列變異，周妍妍等［9］應用PCR 檢測河流弧菌的毒力基因vfh、hupO、vfp及toxR，發現導致腹瀉的河流弧菌主要攜帶vfh和hupO，而toxR具有種屬特異性，菌株攜帶toxR 為100%，可以作為特征性基因用于河流弧菌的鑒定［10-11］。曹際娟等［12］對河流弧菌的toxR基因的特異基因序列進行PCR 擴增，然后利用DHPLC 檢測陽性吸收峰，達到自動化快速檢測的目的。戚莉芳等［13］對河流弧菌水產品分離株OmpU基因進行克隆測序和生物信息學分析，為建立該菌的檢測方法和研制疫苗奠定基礎。

實時熒光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）檢測方法一種快速、靈敏的分子檢測方法，對有效防治因河弧菌引起的腹瀉病具有重要的應用價值?，F有的科研用途的河流弧菌檢測試劑盒均是基于qPCR 的方法進行的檢測。目前我國還未有河流弧菌核酸診斷試劑的行業標準、審評指導原則和標準物質，也未有商業化的河流弧菌核酸檢測試劑。為對此類產品進行系統的質量評價并建立統一的質量標準，本研究研制了河流弧菌核酸檢測試劑定性用國家參考品（編號為370081-202001）［14］。

本參考品的研制確定了我國河流弧菌核酸檢測試劑的最低質量要求，通過對該參考品相關檢測性能的考核，可對企業研發試劑的性能進行評估及質量控制，為臨床診斷試劑提供堅實有力的質量保證。