對銀屑病患者外周血中性粒細胞胞外誘捕網形成的觀察

屈小燕 陳盼 倪文瓊 肖輝 （鄭州大學附屬鄭州中心醫院皮膚科，鄭州 450007）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚疾病，成人和兒童均可發病，全身泛發的皮損給個人帶來巨大的經濟負擔和心理負擔［1］。除了皮膚損害，銀屑病患者發生某些其他系統疾病共病的概率升高，包括銀屑病關節炎、心血管疾病、代謝綜合征和自身免疫性疾病等［2］。銀屑病與其共病的機制尚不清楚，現有研究認為其由遺傳因素和環境因素共同引起［3］。許多經典的（包括T細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞）和非經典的免疫細胞（如角質形成細胞）參與了銀屑病的發病，其中短壽命的中性粒細胞（poly morphonuclear neutrophil，PMN）可能發揮一定作用［4-6］。

中性粒細胞可以率先捕獲外源性的刺激，如細菌、病毒等，并通過獨特的死亡機制釋放中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）［7］。2004年，BRINKMANN等［8］描述了這一機制，即組蛋白3（Histone 3，H3）瓜氨酸化修飾使染色質解螺旋，最終導致顆粒來源蛋白修飾的染色質纖維網（即NETs）的程序性外化，該過程被命名為NETosis。已有研究發現，NETs作為一種天然的生物防御機制，其升高與炎癥反應和相關疾病如肥胖、自身免疫性疾病、動脈粥樣硬化和癌癥等有關［9-10］。

本研究通過觀察銀屑病患者外周血和皮損中PMN形成NETs的情況，并與臨床分型、疾病嚴重性及炎癥指標進行相關性分析，探索NETs與銀屑病發病的相關性，以期為研究中性粒細胞參與銀屑病發病的機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 將2018年8月至2020年12月就診于鄭州大學附屬鄭州中心醫院皮膚科的符合中國銀屑病診療指南診斷標準的63例銀屑病患者作為銀屑病組，其中斑塊型39例、點滴型11例、紅皮病型5例、膿皰型6例、關節型2例。上述患者均由皮膚科2位主任醫師參照《中國銀屑病治療專家共識（2014版）》《中國銀屑病診療指南（2018完整版）》明確診斷。同時選取性別、年齡匹配的同期健康體檢者27例作為對照組（排除血常規異常、肝功能指標異常、急慢性感染、過敏性疾病、自身免疫病患者），分別抽取2 ml外周血，同時對銀屑病患者的皮損嚴重程度進行評估（PASI、BSA評分），收集銀屑病組及對照組的家族史，以及血常規、血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、ASO、RF、CRP、PCT、ESR、血糖、血脂、血尿酸等臨床資料，并計算中性粒細胞/淋巴細胞（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）、外周血血小板/淋巴細胞（platelet/lymphocyte ratio，PLR）、系統免疫炎癥指數（systemic immune-inflammation index，SII）、衍生中性粒細胞/淋巴細胞（derived neutrophil/lymphocyte ratio，dNLR）等常見的血液炎癥指標。同時采集其中5例銀屑病患者皮損。該研究通過鄭州大學倫理委員會審查，所有參與者均已簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 Histopaque-1119、Histopaque-1077（Sigma）；紅細胞裂解液、BSA（索萊寶）；抗瓜氨酸化組蛋白3（Histone 3 citrullinated，H3Cit）、抗MPO、熒光標記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG（Abcam）；抗熒光淬滅封片液（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 分離外周血中性粒細胞 采用密度梯度離心法分離外周血中性粒細胞。離心管中依次緩慢加入Histopaque-1119 4 ml、Histopaque-1077 2 ml、外周血（采血后1 h內進行）2 ml，700 g室溫離心30 min。小心吸取中性粒細胞層細胞懸液，PBS洗滌1次，再經紅細胞裂解液分離得到中性粒細胞。

1.2.2 外周血和皮損NETs免疫熒光染色 將分離的中性粒細胞接種于6孔板，貼片1 h后，4%多聚甲醛固定液固定20 min，0.2%Triton X-100透膜10 min，5%BSA封閉1 h后，再用5%BSA稀釋的H3Cit和抗MPO混合一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，用5%BSA稀釋的熒光標記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG混合二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次?？篃晒獯銣绶馄悍馄?，置于熒光顯微鏡下觀察NETs的形態及數量。每例樣本在200倍鏡下隨機選取10個視野采集圖像。采用Image J圖像分析軟件分析熒光強度及半定量計數，以每個視野內H3Cit（+）細胞數/DNA（+）細胞數作為NETs陽性率，以H3Cit的綠色熒光強度和面積代表NETs的熒光強度和面積。對制備好的銀屑病患者的蠟塊切片，進行抗原修復后處理，具體步驟同外周血中性粒細胞的免疫染色。

1.3 統計學處理 對銀屑病組及對照組外周血自發NETs情況進行統計學分析，同時將銀屑病組的NETs與臨床炎癥指標及疾病嚴重性進行相關性分析，采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件進行統計分析。所有統計測試都是雙向的。多組對比采用Kruskal-Wallis Test，兩組間對比采用Mann-WhitneyUtest。相關性分析采用Pearson檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 銀屑病組皮損中NETs形成情況 熒光顯微鏡下觀察NETs的表達情況。銀屑病患者皮損的Munro微膿腫中可見H3Cit陽性表達（圖1）。

圖1 1例銀屑病患者皮損中NETs表達情況Fig.1 Expression of NETs in psoriatic lesions in 1 patient

2.2 銀屑病組及對照組外周血自發NETs情況對比 熒光顯微鏡下觀察NETs的形態及數量。結果顯示：銀屑病患者外周血中NETs的陽性率、H3Cit的總熒光強度、平均熒光強度、熒光面積均顯著高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.01，圖2、表1）。

表1 銀屑病及健康對照者外周血自發NETs陽性率及熒光強度對比分析表Tab.1 Comparative analysis table of positive rate and fluorescence intensity of spontaneous NETs in peripheral blood of psoriasis patients and healthy controls

圖2 銀屑病組及健康對照組自發NETs情況Fig.2 Spontaneous NETs in psoriasis group and healthy control group

2.3 NETs陽性率與銀屑病嚴重程度相關性分析為了解NETs作為銀屑病臨床指征的可能性，評估NETs產生與銀屑病嚴重程度的相關性。結果如下：外周血NETs陽性率與銀屑病PASI評分呈正相關（r=0.31，P=0.013），與BSA評分無明顯相關性（r=0.17，P=0.175，圖3）。

圖3 銀屑病外周血NETs陽性率與PASI、BSA相關性散點圖Fig.3 Scatter plot of correlation between positive rate of NETs in psoriatic peripheral blood and scores of PASI and BSA

2.4 各型銀屑病間自發NETs比較分析 為了解NETs形成與銀屑病分型間的關系，本研究對比了各型銀屑病間的NETs形成情況，結果顯示，斑塊型、點滴型、紅皮病型、膿皰型、關節型銀屑病組間的NETs陽性率、總熒光強度、平均熒光強度、熒光面積均差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 外周血NETs與銀屑病臨床指標相關性分析回顧性收集患者代謝相關、TNF-α、IL-6、CRP、PCT等實驗室檢測資料，將銀屑病組分為結果正常組及結果異常組，分析兩組間PASI、BSA、自發NETs的差異情況，結果如下：以代謝異常作為影響因素的研究部分，共收集48例銀屑病患者資料，其中合并代謝異常的患者23例（占總人數的47.92%），不合并代謝異常的患者25例（占總人數的52.08%），對比兩組發現，合并代謝異常組的NETs熒光面積顯著高于未合并代謝異常組（P=0.03）；高TNF-α組有患者20例（占總人數的47.62%），正常TNF-α組有患者22例（占總人數的52.38%），高TNF-α組的NETs總熒光強度和熒光面積均顯著高于正常TNFα組（P=0.01）；高IL-6、CRP、PCT組NETs陽性率、平均熒光強度、總熒光強度和熒光面積及PASI、BSA評分較正常IL-6、CRP、PCT組差異均無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 銀屑病組臨床指標與NETs及疾病嚴重性相關性分析Tab.2 Correlation analysis of laboratory indicators with NETs and disease severity in psoriasis group

2.6 外周血炎癥標志物與銀屑病嚴重程度及外周血自發NETs的相關性分析 本研究收集銀屑病組及健康對照組的NLR、PLR、SII、dNLR等數據，并與NETs及疾病嚴重性進行相關性分析，以探索其作為評價銀屑病疾病嚴重性的可能性。結果如下：銀屑病組NLR、PLR、SII、dNLR較健康對照組差異均無統計學意義（P＞0.05，表3）。銀屑病組的NLR、PLR、SII、dNLR與PASI、BSA、NETs的陽性率、總熒光強度、平均熒光強度及熒光面積間均無相關性（Pearson檢驗，P＞0.05）。此外，本研究分別根據銀屑病組NLR、PLR、SII、dNLR的中位數將銀屑病患者分為高NLR、PLR、SII、dNLR組（≥中位數）和低NLR、PLR、SII、dNLR組（＜中位數），對比兩組的PASI、BSA及自發NETs情況，結果顯示兩組PASI、BSA、NETs的陽性率、總熒光強度、平均熒光強度及熒光面積差異均無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表3 銀屑病組及健康對照組血清炎癥指標分析Tab.3 Analysis of serum inflammatory indexes in psoriasis group and healthy control group

3 討論

遺傳和環境因素與銀屑病的發病密切相關［11］。在遺傳易感性和環境觸發器之間的相互作用中，微生物群入侵導致的感染可能是一個關鍵角色［12］。而中性粒細胞作為感染早期響應的免疫細胞，在接收來自微生物的刺激后發揮的作用與銀屑病的炎癥免疫反應有相關性。

中性粒細胞在銀屑病中作為固有免疫反應中的“先鋒士兵”，可通過吞噬、脫顆粒作用或活化轉變為NETs參與免疫應答［13-14］。研究表明，在類銀屑病小鼠模型中，消耗中性粒細胞可緩解類似銀屑病的皮損癥狀［15］。在藥物誘導的粒細胞缺乏癥患者中銀屑病皮損情況得到改善，而在中性粒細胞計數正?；筱y屑病復發［16］。而且，有研究發現，銀屑病患者外周血和皮損中NETs含量明顯升高［17］。在咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠模型中，連續7 d靜脈注射CI-酰胺后，小鼠外周血中NETs含量明顯下降，皮膚細胞表達的炎癥因子水平降低，小鼠背部皮膚的鱗屑和棘層肥厚也減少，提示抑制NETs釋放可顯著緩解銀屑?。?8］。本研究發現銀屑病患者外周血NETs形成增多，且與銀屑病PASI評分呈正相關，提示在銀屑病中，中性粒細胞可能以形成NETs的方式參與銀屑病發病，但其具體機制尚不明確?，F有研究發現NETs中包含大量趨化因子和炎癥因子等成分，可促使未活化的中性粒細胞從血管中大量趨化、遷移至表皮并進一步分泌NETs，形成以中性粒細胞反復激活為基礎的免疫激活循環［19］。在這一循環中，持續激活的中性粒細胞釋放NETs的同時，激活pDC，與Th1、Th17相互作用，釋放大量趨化因子和炎癥因子，刺激角質形成細胞［20］。因此，檢測外周血NETosis細胞可能作為評估銀屑病患者病情的一個炎癥指標，或為靶向中性粒細胞的治療提供依據。

本研究還發現銀屑病患者血清TNF-α與NETs存在相關性。這種相關性在類風濕關節炎和放射性軸性脊柱關節炎中也有報道，且后者在應用Infliximab治療后發現NETosis生成減少［21-22］。還有研究發現，在類風濕關節炎患者中，運用Infliximab治療可通過抑制NETs的形成減少炎癥因子產生，改善疾病活動性［23］。以上研究結果說明TNF-α可能促進NETs的形成，而NETs有可能成為TNF-α單抗治療銀屑病的療效評估指標之一

近年來多項研究發現NETs的產生與多種非感染性急慢性疾病的發生和進展密切相關［24］。環境因素如微生物感染、壓力、吸煙、肥胖和飲酒，作為銀屑病的關鍵危險因素和觸發因素，對機體的影響是全身性的，因此銀屑病也常常與其他疾病共病，越來越多的臨床研究證實銀屑病常合并代謝相關疾?。?5］。有研究認為，代謝綜合征直接增加了銀屑病患者心血管疾病和過早死亡的風險，從而大大降低了他們的預期壽命［26］。這些共病中長期的代謝紊亂可引起固有免疫的長程激活，造成持久的代謝性炎癥，炎癥細胞產生的氧化應激環境和炎癥因子將為NETosis過程提供有利的微環境，在某個觸發因素的影響下引起銀屑病復發［27］。研究表明，2型糖尿病及其相關的動脈粥樣硬化中，NETs形成明顯增加，與ApoE-/-敲除小鼠相比，通過敲除中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和蛋白酶-3進而抑制NETosis的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變明顯減輕［28］。而對患有代謝綜合征和1型糖尿病的受試者使用Secukinumab進行治療，反應較好的患者平均體重、腰圍和BMI與對照組相比持續下降［29］。這些發現都說明NETs與銀屑病及其代謝相關共病密切關聯。本研究顯示合并代謝異常的銀屑病患者相對不合并代謝異常的銀屑病患者，其外周血自發NETs增強，NETs有可能是關聯銀屑病及其共病之間的機制之一。針對中性粒細胞，特別是針對NETs的藥物可能成為銀屑病的治療靶點之一。銀屑病的治療藥物富馬酸二甲酯具有削弱中性粒細胞功能和抑制NETs形成的作用，從另一方面佐證了NETs作為銀屑病治療靶點的可能性［30］。

急性感染是銀屑病觸發和復發機制中的關鍵因素，而中性粒細胞是早期響應急性感染的“種子”，代謝紊亂患者體內的炎癥狀態為這一過程提供“肥沃土壤”，促使中性粒細胞NETosis釋放NETs，在此微環境中，炎癥免疫反應迅速級聯擴大，最終導致銀屑病的發生發展及復發。而這一過程涉及的具體機制還需要更深入的探索和研究。