IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA表達與腎病預后不良的關系分析

廖敏 宋勇波 魏卓 劉小兵 程魁 范哲奇 雙松濤 祝存海

（孝感市中心醫院泌尿外科，武漢科技大學附屬孝感醫院，孝感 432100）

免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）腎病是以腎小球系膜區IgA沉積為特征的慢性腎病，發病率占原發性腎小球疾病的20%～45%［1］。IgA腎病呈慢性進展性，目前尚無特異性治療方法，臨床常根據患者臨床表現和腎臟病變程度給予長療程多藥聯合治療，以修復腎臟損傷、抑制腎臟異常免疫反應從而延緩病情發展，但仍有部分患者最終進展為終末期腎病，威脅其生命健康［2］。因此，探討影響IgA腎病患者預后不良的影響因素對預防該病進展、改善預后有重要意義。腎小球系膜細胞過度增殖、細胞外基質過度沉積是導致腎小球疾病進展的核心病理環節［3］，而P21、P27是與細胞增殖密切相關的細胞周期調控因子，能抑制G1期和S期的細胞周期素與細胞周期激酶（cyclin dependent kinase，CDK）結合，抑制細胞增殖，增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是脫氧核糖核酸（DNA）多聚酶的一種輔助蛋白，能夠反映細胞增殖活性，既往研究發現P21、P27、PCNA在腎病中表達異常，參與了腎系膜細胞的增殖過程［4-5］。但以上指標在IgA腎病患者中的表達及其與腎臟預后不良的關系尚不明確。鑒于此，本研究采用免疫組化法檢測IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達，并探討其與腎臟預后不良的關系，旨在為其臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入標準：均行腎穿刺活檢，且病理結果證實為IgA腎??；年齡≥18歲；均對本研究知情并簽署同意書。排除標準：乙肝病毒、過敏性紫癜、系統性紅斑狼瘡相關性腎炎等繼發性IgA腎??；有腎移植史的患者；腎穿刺活檢標本鏡下腎小球數＜8個；合并糖尿病腎病、膜性腎病、間質性腎炎等腎病患者；其他合并糖尿病、心腦血管疾病、血液系統疾病及惡性腫瘤患者。按納入、排除標準選取2017年4月至2019年8月孝感市中心醫院收治的145例IgA腎病患者作為研究對象，其中男83例，女62例；年齡21～60歲，平均（39.54±7.78）歲；病理表現：系膜細胞增生74例、毛細血管內皮細胞增生7例、節段性腎小球硬化86例、腎小管萎縮29例、新月體54例。

1.2 方法

1.2.1 治療與隨訪 依據《原發性IgA腎病診治循證指南（2016）》［6］，針對患者病情和腎臟病變程度進行治療，合并持續性肉眼血尿（持續2～4周及以上）患者給予甲潑尼龍沖擊治療，15～30 mg/（kg·d），3～5 d為1個療程，治療1～2個療程；合并蛋白尿患者結合腎臟病理結果給予血管緊張素轉化酶抑制劑（ace inhibitors，ACEI）、血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin-receptor blockade，ARB）、免疫抑制劑治療；新月體形成患者給予激素聯合環磷酰胺治療6個月，前3～5 d給予甲潑尼龍15～30 mg/（kg·d）沖擊治療，后續口服潑尼松15～30 mg/（kg·d），同時環磷酰胺每月0.5 g/m2沖擊治療；另針對合并高血壓、高血脂、凝血異常等患者給予降壓（當腎功能正?；蜉p微受損時給予ACEI/ARB降壓，當腎功能受損嚴重、Scr＞440 μmol/L時給予鈣拮抗劑降壓）、調脂、抗凝等治療。

以病理確診日期為隨訪起點，所有患者均隨訪24個月，將腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate,eGFR）較基線值下降超過50%或進展至終末期［eGFR＜15 ml/min·（1.73 m2）］的患者歸為預后不良組，其余患者歸為預后良好組，其中eGFR=186×Scr-1.154×年齡-0.203×（0.742女性）。

1.2.2 臨床指標檢測 收集所有患者年齡、性別、病理表現、血壓及24 h尿蛋白、血肌酐（serum creatinine,Scr）、白蛋白（albumin,ALB）、尿酸（uric acid,UA）、膽固醇（TC）、三酰甘油（triacylglycerol,TG）等實驗室指標，所有臨床指標均為腎活檢前最后一次晨起空腹檢測結果。

1.2.3 腎小球陽性和陰性細胞檢測 收集所有患者腎穿刺活檢組織，采用甲醛-醋酸-乙醇固定液固定，經脫水、透明、石蠟包埋制成石蠟切片。切片經烘烤、脫蠟水化后用3%過氧化氫（H2O2）室溫孵育10 min滅活H2O2酶活性。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，P21、P27組織切片微波進行抗原修復（PCNA無須進行）；滴加牛血清蛋白進行封閉，室溫孵育20 min后用PBS清洗；滴加適當比例稀釋的一抗試劑，室溫孵育1 h，PBS清洗3次；滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS清洗3次；再滴加鏈親和素-過氧化物酶復合物，室溫孵育10 min，PBS清洗3次后用二氨基聯苯胺顯色，待顯色后用蘇木素復染，沖洗后用鹽酸乙醇分色，脫水透明后封片。結果判讀：在高倍鏡（×200倍）下閱片，核顯示黃色或棕褐色為陽性，藍色為陰性，計數每個腎小球陽性和陰性細胞，陽性率（%）=陽性核數/（陰性核數+陽性核數）×100%，取所有腎小球的平均值作為該切片的表達指標。

1.3 統計學分析 采用SPSS25.0軟件分析數據，計量資料若符合正態分布以±s描述，采用t檢驗；計量資料若不符合正態分布則采用M（Q1，Q3）描述，采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料以“%”描述，采用χ2檢驗；并采用Logistic多元回歸分析IgA腎病患者預后不良的影響因素。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達 IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA陽性細胞表達率分別為（38.69±6.83）%、（55.94±8.08）%、（33.47±5.72）%，見圖1。

圖1 IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA表達Fig.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with IgA nephropathy

2.2 IgA腎病患者預后不良情況及不同預后患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達 隨訪結束時，145例IgA患者中預后不良者25例，預后良好者120例，預后不良發生率為17.24%（25/145）。預后不良組腎小球系膜組織P21、PCNA陽性細胞表達率均高于預后良好組（P＜0.05），P27陽性細胞表達率低于預后良好組（P＜0.05），見表1、圖2。

表1 不同預后患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達（±s，%）Tab.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with different prognosis （±s，%）

表1 不同預后患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達（±s，%）Tab.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with different prognosis （±s，%）

Groups Poor prognosis（n=25）Good prognosis（n=120）t P P21 48.69±8.72 36.57±5.83 8.605＜0.001 P27 51.64±9.43 56.85±7.24 3.103 0.002 PCNA 44.17±7.62 31.20±4.06 12.180＜0.001

圖2 腎小球系膜組織P21、P27、PCNA表達Fig.2 Expression of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue

2.3 IgA腎病不同預后患者一般資料比較 預后不良組舒張壓、24 h蛋白尿、節段性腎小球硬化占比、腎小管萎縮/間質纖維化占比、新月體占比均高于預后良好組（P＜0.05），見表2。

表2 IgA腎病不同預后患者一般資料比較Tab.2 Comparison of prognosis of patients with IgA nephropathy

2.4 IgA腎病患者預后不良的影響因素 經Logistic多元回歸分析，舒張壓升高、24 h蛋白尿增多、系膜細胞增生、節段性腎小球硬化、腎小管萎縮/間質纖維化、新月體與P21、PCNA陽性表達率升高、P27陽性細胞表達率降低均是影響IgA腎病患者預后不良的危險因素（P＜0.05），見表3。

表3 Logistic多元回歸分析Tab.3 Logistic multiple regression analysis

3 討論

IgA腎病發病機制尚未完全明確，近年來研究發現IgA1對腎小球系膜細胞具有親和力，能夠特異性結合誘導細胞增殖，引發腎小球炎癥反應進而損傷腎小球［7］。有研究顯示約1/3的IgA腎病患者腎損傷呈進行性加重，最終導致預后不良［8］。本研究145例IgA腎病患者僅隨訪24個月預后不良發生率高達17.24%，證實了IgA腎病預后不良的高風險，故亟須探討影響IgA腎病預后不良的因素以指導臨床干預，改善預后。

本研究結果顯示，IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA陽性細胞表達率分別為（38.69±6.83）%、（55.94±8.08）%、（33.47±5.72）%，提示P21、P27、PCNA可能在IgA腎病的發生發展中發揮一定作用。IgA腎病以IgA免疫復合物沉積于系膜區，誘發腎小球系膜細胞增生及系膜基質堆積為主要特征，腎小球系膜的增生與系膜細胞過度增殖有關，而細胞增殖必須經歷完整的細胞周期，受細胞周期調控因子的調控［9］。PCNA是在細胞增殖中呈階段性表達的一種蛋白，與DNA聚合酶結合引導DNA復制，可有效反映細胞的增殖活性，既往研究報道IgA腎病小鼠PCNA水平相較健康對照組升高，且此類小鼠系膜細胞增殖增強，提示PCNA可能與腎系膜細胞增殖關系密切［10］。P21、P27是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）家族中的成員，能夠抑制多數細胞周期素和CDK復合物，使細胞不能通過G1期到S期之間的檢驗點，停滯在G1期；另外，P21可與PCNA結合抑制DNA復制，進而抑制細胞增殖［11-12］。正常情況下P21處于低表達水平，P27處于高表達水平來抑制細胞增殖，而在腎小球系膜組織中P21表達上調、P27表達下調則提示抑制腎系膜細胞增殖能力減弱，進而參與IgA腎病的發生。此外，本研究結果顯示IgA腎病預后不良組腎小球系膜組織P21、PCNA陽性細胞表達率均高于預后良好組，P27陽性細胞表達率低于預后良好組，經多因素分析顯示其均是IgA腎病預后不良的危險因素。腎小球系膜細胞增殖是IgA腎病的重要病理機制，也是病情進展的重要原因。PCNA是細胞增殖活性的指標，而P27是抑制細胞增殖的因子，PCNA表達增加，P27表達減少說明腎小球系膜細胞增殖增多，促進IgA腎病進展。P21可與CDK復合物結合抑制細胞增殖，但P21參與足細胞的損傷，當足細胞在增殖表型狀態下P21可從復合物中分離，變為游離狀態［13］，因此在腎小球硬化過程中隨著足細胞增生，P21同樣作為抑制細胞增殖的因子表達增加。另外焦素敏等［14］發現P21表達水平與腎小球硬化呈正相關，進一步證實了P21表達增加與IgA腎病進展相關，是導致其預后不良的危險因素。且目前已有動物實驗通過在腎炎小鼠中調控P21、P27的表達來抑制細胞增殖來干預腎病進展，改善預后［15］。本研究結果還顯示，舒張壓升高、24 h蛋白尿增多、系膜細胞增生、節段性腎小球硬化、腎小管萎縮/間質纖維化、新月體均是影響IgA腎病預后不良的危險因素，與既往研究報道一致［16-18］。

綜上，P21、P27、PCNA在IgA腎病腎小球系膜組織中均存在陽性細胞表達，預后不良患者P21、PCNA陽性細胞表達率高于預后良好者，P27陽性細胞表達率低于預后良好者，且均是IgA腎病患者預后不良的危險因素。