基于p38 MAPK信號通路探討生慧顆粒對AD模型大鼠EC與CA1區影響及作用機制＊

李澤飛，趙賓賓，石和元，王 平＊＊

（1.湖北中醫藥大學基礎醫學院 武漢 430065；2.江漢大學醫學部 武漢 430056）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是最常見的進行性神經退行性疾病，其特征是大腦中出現細胞外老年斑和細胞內神經原纖維纏結，導致進行性認知能力下降和神經元細胞死亡[1]。經典觀點認為，淀粉樣蛋白斑塊導致的結構損傷和神經元丟失是AD 認知障礙的基礎。但現有研究發現，AD 在早期階段即有不同腦區間環路交流功能障礙和神經元異常放電[2]。越來越多的數據表明，大腦神經網絡的改變可以解釋AD 的早期發病機制，這些神經環路異常甚至先于典型的Aβ 沉積。海馬CA1 區是一個信號匯集點，可以接收來自上游腦區的電信號輸入[3]，其中單突觸回路內嗅皮層（Entorhinal cortex，EC）-CA1 一直被認為是學習和記憶的重要回路基礎[4]。

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族包括細胞外信號調節激酶（Extracellular signal regulated kinases，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c Jun N terminal kinase，JNK）和p38 MAPK 等亞族。其中p38 MAPK 在中樞神經系統的神經元和非神經元細胞中高度表達。有研究發現，AD患者大腦中p38 MAPK 活性增加[5]。p38 MAPK 與AD發病機制中的許多病理過程有關，其中與Aβ、Tau 蛋白過度磷酸化、神經炎癥、突觸可塑性關系較為密切[6]。Aβ 沉積形成的淀粉樣斑塊是AD 的病理標志之一，Aβ 可激活p38MAPK 導致細胞內鈣、活性氧產生/積累和線粒體應激增加，促進AD 病理的發生與發展。過度磷酸化tau 蛋白形成的神經纖維纏結是AD 另一種主要病理特征。上調p38 MAPK 的表達可以促進Tau 蛋白過度磷酸化和沉積，引發神經毒性和突觸功能障礙[7]。在生理情況下Tau 蛋白主要富集在神經元的軸突部位，Tau 蛋白高度磷酸化導致其未能與微管結合，這會導致細胞骨架穩定性的下降和軸突運輸的受損，從而導致突觸功能障礙。另外，Aβ 引起的過度細胞應激可能誘導星形膠質細胞釋放TNF-α、IL-1β和一氧化氮等促炎介質，導致腦內的慢性炎癥狀態。而p38 MAPK 可被許多細胞外炎癥介質激活，并進一步通過調節轉錄因子產生促炎細胞因子，導致慢性神經毒性[8]。p38 激活還可以抑制長時程增強（Longterm potentiation，LTP），使海馬突觸可塑性降低[9]。突觸是直接參與神經系統內信息整合和傳遞的結構，突觸可塑性是調控神經功能的基礎。EC-CA1神經回路間順利交流依賴于突觸結構及功能正常。因此，通過抑制p38MAPK 信號通路激活來改善突觸功能障礙和恢復突觸可塑性是治療AD的有效途徑。

東莨菪堿是一種非選擇性毒蕈堿乙酰膽堿受體拮抗劑，東莨菪堿處理的動物通常用作研究AD 的動物模型。腹腔注射東莨菪堿的AD 動物模型除具有認知功能障礙外還具備多種AD 特征，如氧化損傷、線粒體功能障礙和Aβ 病理學特征等[10]。乙酰膽堿在記憶過程中發揮作用，但也在運動和焦慮相關行為中發揮作用。因此，東莨菪堿阻斷受體可導致認知和運動缺陷，并可導致焦慮。

中醫藥治療癡呆注重早期干預、綜合防治。早在《辨證錄·健忘門》即有生慧湯治療老年人健忘癥的記載，該方由熟地、山茱萸、遠志、生酸棗仁、柏子仁（去油）、茯神、人參、石菖蒲、白芥子組成。人參、熟地、山茱萸功能培元補腎；生酸棗仁、柏子仁、茯神功能養心安神、助眠益智；遠志、石菖蒲、白芥子功能祛痰開竅、健腦益智，全方共奏培元健腦、安神益智之功。團隊前期研究發現生慧湯不僅能提高APP/PS1 雙轉基因AD模型小鼠學習記憶能力，降低海馬炎癥相關蛋白表達[11]，還能提高慢性睡眠剝奪模型小鼠認知能力，對神經具有保護作用[12]。在此基礎上本團隊依據生慧湯研發了生慧顆粒[13]。但是以往的研究僅局限于海馬腦區，在本研究中，擬使用生慧顆粒干預東莨菪堿致癡呆模型大鼠。使用行為學實驗評價大鼠學習記憶能力及焦慮樣行為，使用相關染色觀察EC和海馬體病理損傷情況與神經元活性，使用Western blot 檢測海馬p38 信號通路相關蛋白，從而探討生慧顆粒能否通過調節p38信號轉導從而改善海馬突觸功能障礙及細胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 試劑與實驗儀器

生慧顆粒由李時珍醫藥集團生產（批號202112001），成人劑量每日3 袋，每袋18 g。氫溴酸東莨菪堿注射液（華牧動物保健品有限公司，批號20210601）、多奈哌齊（衛材藥業有限公司，批號2010015）。各種一抗：c-Fos（愛博泰克，中國，A16641），p38（萬類生物，WL00764），p-p38（萬類生物，WLP1576），Tau（愛博泰克，A0002），p-Tau（愛博泰克，AP0053），Bax（愛博泰克，A0207），Bcl-2（愛博泰克，A0208），β-actin（abcam，ab8226）。

曠場實驗視頻跟蹤儀器（Ethovision-XT 16.0，諾達思（北京）信息技術有限責任公司）；水迷宮視頻跟蹤系統（V1.19，安徽正華生物儀器有限公司）；病理切片掃描儀（Pannoramic Scan，匈牙利3DHIESTECH 公司），凝膠成像系統（GelDoc XR，美國伯樂公司）。

1.2 動物和實驗組

40 只雄性SD 大鼠（5 周齡），體質量200±20 g 購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗單位使用許可證編號：SYXK（鄂）2017-0067。讓大鼠適應環境5天，自由飲食。房間條件保持在12 h/12 h 的明暗循環、55%濕度和22±2℃溫度。動物實驗經湖北中醫藥大學動物倫理委員會批準。生慧顆粒給藥劑量按照成人與大鼠等效劑量換算，結果為4.86 g·kg-1。將大鼠隨機分為四組（每組10只），即空白組、模型組、生慧顆粒組、多奈哌齊組。給藥處理如下：空白組（超純水灌胃），模型組（超純水灌胃），生慧顆粒組（生慧顆粒4.86 g·kg-1·d-1，灌胃）和多奈哌齊組（多奈哌齊1 mg·kg-1·d-1，灌胃）。實驗持續28 天，在前18 天，各組大鼠進行灌胃處理，第19-28 天除灌胃外還進行行為學實驗，在測試開始前30 min 對大鼠進行腹腔注射處理。除空白組外，其余各組每日腹腔注射氫溴酸東莨菪堿注射液5 mL·kg-1·d-1?？瞻捉M腹腔注射等劑量生理鹽水。行為學實驗結束后將所有動物處死。

1.3 Morris水迷宮測試

使用Morris 水迷宮測試評價大鼠長期空間學習和記憶能力。水迷宮為一個直徑150 cm、高100 cm的圓柱水箱，箱中充滿了含有黑色墨水的水（23±1℃），并在水箱周圍的墻壁上放置了圖案提示。一個平臺被淹沒在水面以下1 cm 處，以防止大鼠看到平臺。尋找水下隱藏平臺的訓練持續5 天，每天從不同象限訓練4 次。到達平臺后，讓大鼠在平臺上休息20 s。將90 s 內未能找到平臺的大鼠引導至平臺并讓其在平臺上停留20 s。第6 天大鼠暫停水迷宮行為學實驗。第7 天撤走水下平臺，讓大鼠自由游泳90 s。使用水迷宮視頻跟蹤系統分析游泳路徑和時間，并計算上平臺潛伏期，穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比。

1.4 曠場測試

使用曠場測試評估大鼠運動狀態及焦慮等相關行為。該裝置由黑色地板（100 cm×100 cm）組成，周圍有50 cm 高的黑色墻壁。測試開始時，將動物置于空曠場地的角落，讓其自由探索5 min。在探索過程中，使用視頻跟蹤軟件記錄運動軌跡并計算穿越中心區域（50 cm×50 cm）次數和停留時間以及總運動路程。

1.5 HE染色

大鼠處死后，將全腦在10%福爾馬林中保存過夜，然后在石蠟中包埋4 h。制備石蠟塊，用切片機切取海馬CA1、CA2、CA3 和EC 區的冠狀切片。切片固定在硅烷涂層的載玻片上，在二甲苯中洗滌以脫蠟，在分級乙醇中再脫水，最后用蘇木精-伊紅（HE）染色。使用病理切片掃描儀對染色切片全掃描并觀察海馬各區神經元形態。

1.6 c-Fos免疫熒光染色

將冠狀腦切片用0.4% Trition X-100 滲透并用10%正常驢血清封閉，然后在4℃下使用一抗c-Fos（1∶300）孵育過夜。然后將切片在0.4% Trition X-100中洗滌3 次，每次30 min，然后在室溫下用適當的二抗孵育1 h。

1.7 蛋白質印跡分析

提取海馬組織總蛋白，使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定提取蛋白濃度。使用4%-10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白，隨后轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。室溫條件下使用5%無脂牛奶中封閉1 h，并在4℃下與相應一抗孵育過夜。洗滌后與相應二抗孵育。使用超敏ECL 進行顯色，凝膠成像系統對染色拍照。使用Image J軟件對條帶進行半定量分析。

1.8 統計分析

2 實驗結果

2.1 生慧顆粒改善AD大鼠中長期空間學習記憶

圖1A 為大鼠定位航行及空間探查實驗軌跡圖。如圖1B 所示，經過5 天的水迷宮訓練，所有組的逃避潛伏期逐漸降低。到第5 天，空白組、生慧顆粒組、多奈哌齊組大鼠的逃逸潛伏期分別為21.7±6.3 s、37.9±9.8 s、31.1±8.8 s。然而，模型組的逃逸潛伏期從為52.4±9.5 s，明顯高于其他組。

圖1 Morris水迷宮結果

圖1C 顯示了第7 天各組大鼠穿越平臺次數。與空白組（4.4±0.8）比較，模型組（1.1±0.6）穿越平臺次數明顯減少（P<0.01）。與模型組比較，生慧顆粒組（3.1±1.1）和多奈哌齊組（3.5±0.8）均高于模型組（P<0.01，P<0.01）。

圖1D 顯示了大鼠目標象限中停留時間的比值，模型組目標區停留時間百分比為（24.1%±3.4%），明顯低于空白組（34.0%±4.3%）（P<0.01）。生慧顆粒組（31.0%±4.3%）和多奈哌齊組（28.8%±3.1%）在目標區的游泳時間百分比均高于模型組，但生慧顆粒組具有顯著性差異（P<0.05），多奈哌齊組不具有顯著性差異（P>0.05）。

2.2 生慧顆粒減輕AD大鼠的焦慮抑郁樣行為

圖2A為大鼠曠場實驗軌跡熱圖。圖2B顯示大鼠在中心區停留的時間，與空白組（4.5±2.0 s）比較，模型組大鼠（1.2±0.7 s）停留的時間顯著減少（P<0.01）。與模型組比較，生慧顆粒組（3.2±0.9 s）和多奈哌齊組（3.4±1.0 s）大鼠在中心區停留的時間顯著升高（P<0.05，P<0.05）。

圖2 曠場實驗結果

圖2C 顯示大鼠進入中心區次數，與空白組（3.3±0.9）相比，模型組大鼠（0.7±0.6）在進入中心區次數顯著減少（P<0.01）。與模型組比較，生慧顆粒組（2.2±0.6）和多奈哌齊組（1.7±0.8）大鼠進入中心區次數均顯著升高，但生慧顆粒組具有顯著性差異（P<0.01），多奈哌齊組不具有顯著性差異（P>0.05）。

圖2D 顯示大鼠總運動路程，與空白組（3467.2±692.4 cm）相比，模型組大鼠（652.3±272.9 cm）總運動路程顯著減少（P<0.01）。與模型組比較，生慧顆粒組（2464.2±699.7 cm）和多奈哌齊組（2701.0±585.8 cm）大鼠總運動路程均顯著升高（P<0.01，P<0.01）。

2.3 生慧顆粒減輕AD大鼠腦組織神經病理損傷

如圖3 所示，空白組（圖3A）EC 區與海馬CA1 區神經元排列整齊，而模型組（圖3B）大鼠神經細胞可觀察到明顯的嗜酸性細胞質、核固縮、神經元腫脹、錐體細胞收縮和空泡化。與模型組比較，生慧顆粒組（圖3C）與多奈哌齊組（圖3D）治療后嗜酸性染色的神經元數量較少，顯示出輕微的神經元毒性，核固縮與空泡化均有所減輕。這表明生慧顆粒對海馬區與EC區組織中具有潛在的保護作用。

圖3 海馬與EC區皮層H&E染色結果

2.4 生慧顆粒提高AD大鼠海馬及EC區神經元活性

圖4A 顯示各組大鼠海馬區c-Fos 免疫熒光染色，與空白組比較，模型組c-Fos 熒光表達降低。與模型組比較，生慧顆粒組與多奈哌齊組c-Fos 熒光表達升高。各組大鼠海馬組織蛋白質印跡數據（圖4B、4C）支持免疫染色結果。

圖4 海馬c-Fos免疫熒光染色與Western blot結果

圖5 顯示各組大鼠EC 區c-Fos 免疫熒光染色，與空白組比較，模型組c-Fos 熒光表達降低。與模型組比較，生慧顆粒組與多奈哌齊組c-Fos熒光強度升高。

圖5 EC區c-Fos免疫熒光染色結果

2.5 生慧顆粒對海馬組織p38 MAPK 信號通路的影響

如圖6A、6B 所示，通過Western blot 發現，各組海馬組織中p38 MAPK 蛋白含量沒有較大區別，而模型組大鼠海馬中p-p38 MAPK 表達明顯比空白組增加（P<0.01）。與模型組比較，生慧顆粒組與多奈哌齊組p-p38 MAPK表達降低（P<0.01，P<0.01）。

圖6 p38信號通路Western blot結果

如圖6C 所示，各組大鼠海馬Tau 蛋白表達無明顯差異。與空白組比較，模型組p-Tau 明顯比空白組升高（P<0.05）。與模型組比較，生慧顆粒組與多奈哌齊組p-Tau降低（P<0.05，P<0.05）。

如圖6D 所示，與空白組比較，模型組大鼠海馬中Bax 蛋白表達明顯比空白組增加（P<0.01）。與模型組比較，生慧顆粒組與多奈哌齊組Bax 蛋白表達降低（P<0.01，P<0.01）。

如圖6E 所示，與空白組比較，模型組大鼠海馬中Bcl-2 蛋白表達明顯比空白組有所下降（P<0.01）。與模型組比較，生慧顆粒組與多奈哌齊組Bcl-2 蛋白表達升高（P<0.05，P<0.01）。

3 討論

本實驗首先通過水迷宮及曠場實驗發現生慧顆?？梢愿纳茤|莨菪堿致癡呆AD 模型大鼠學習記憶能力及焦慮抑郁樣行為。隨后使用HE 染色對CA1 與EC區進行觀察，發現生慧顆粒對兩部分腦區均有保護作用?？臻g位置的學習記憶能力是高等生物生存所需的基本適應行為，位于大腦顳葉的海馬體對空間認知和情景記憶至關重要[14]。目前的研究發現，運動行為的位置和方向信息在海馬CA1 和DG 神經元中編碼，破壞其他腦區與CA1 或DG 神經元之間的連接會導致信息解碼準確性降低[15]。已有研究表明EC 與CA1區存在廣泛聯系，EC區負責直接或間接地將信息傳遞到海馬CA1內[16]。AD前期表現為輕度認知障礙，其特征是EC區中顯著的神經元丟失，最顯著的是II層PC[17-18]。使用逆行單突觸追蹤系統，已經確定了ECIIPN 和CA1PV 在生理條件下的直接聯系[19]（圖7A）。

通過c-Fos 染色發現生慧顆?？商岣逧C 和CA1神經元活性。神經元細胞活動可改變許多基因的表達，對學習和記憶產生重要影響，其中研究最廣泛的一種基因是Fos。有研究表明，神經元活動誘導DNA雙鏈斷裂的形成，包括Fos 在內的早期反應基因開始表達[20]。Fos 基因的蛋白質產物為c-Fos，因此c-Fos表達經常用作神經元活動的標志。本研究結果發現模型組c-Fos 在海馬和EC 區表達降低。已有文獻報道東莨膽堿顯著降低了AD 模型小鼠海馬中c-Fos 的蛋白水平[21]。結合HE結果發現，生慧顆?？梢酝瑫r改善EC與CA1區神經元損傷，提高神經元活性。

為了進一步觀察生慧顆粒對突觸功能障礙及細胞凋亡的影響，對海馬組織內p38 MAPK 通路相關蛋白進行檢測，發現生慧顆?？蓽p弱p38 及Tau 蛋白磷酸化，同時可降低Bax 表達、提高Bcl-2 表達。p38 MAPK 通路級聯磷酸化過程為三級激酶模式：MAPK激酶激酶（ASK1），MAPK 激酶（MEK）和p38 MAPK（圖7B）。p38 MAPK 信號通路可以被多種胞外信號激活，如Aβ、炎癥因子等，經過三級激酶信號轉導，p38可誘導細胞凋亡和微管相關蛋白Tau磷酸化。在細胞凋亡途徑中，Bcl-2/Bax蛋白在凋亡信號轉導中起關鍵作用。Bcl-2 作為關鍵的凋亡調控蛋白，可抑制細胞凋亡，參與細胞增殖與凋亡動態平衡的調控，其表達減少會引起大量神經細胞凋亡。Bax 則可拮抗Bcl-2產生促凋亡作用。p38可以激活Bax，從而觸發細胞色素c 從線粒體中釋放，激活半胱天冬酶發生促凋亡作用。Tau 蛋白是一種微管相關蛋白，通常存在于大腦的額葉、顳葉、海馬及內嗅區的神經元細胞中。正常情況下，Tau 蛋白具有高度可溶性并且幾乎沒有聚集傾向，而在神經退行性疾病中可見到Tau 的聚集。另外，Tau 蛋白異常磷酸化會導致細胞內骨架蛋白的解聚和神經纖維纏結，加速了神經元細胞的死亡。研究表明，p38 可以促進Tau 蛋白的異常磷酸化過程，從而加速AD 的病理進程。通過阻斷p38 MAPK 活性，可以挽救神經退行性表型[22-23]，因此p38 MAPK 是治療AD的一個重要靶點。本研究結果表明生慧顆粒通過下調p38 信號轉導抑制海馬體神經細胞凋亡、減弱Tau磷酸化改善突觸功能障礙。結合HE 與c-Fos 染色結果，推測生慧顆?？赡芡ㄟ^保護海馬與EC 區神經細胞從而增強EC-CA1回路連接發揮治療AD作用。

4 結論

綜上所述，在本研究中發現生慧顆粒能夠改善AD 模型大鼠學習記憶能力和焦慮樣行為，對海馬和皮層EC 區神經元具有保護作用，同時可提高兩部分腦區神經元活性。另外，生慧顆?？赏ㄟ^p38 信號通路起到抗AD 作用。本研究結果提示生慧顆?？赡芡ㄟ^EC-CA1神經環路治療AD，后期團隊將結合光遺傳學做進一步研究。