基于下丘腦-垂體-腎上腺軸探討電針對功能性消化不良大鼠的作用機制＊

樂 薇，姚函伶，楊格格，吳貽森，徐派的＊＊

（1.武漢市中西醫結合醫院 武漢 430022；2.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院 武漢 430065）

功能性消化不良（Functional dyspepsia，FD）是以進食后出現飽脹不適、上腹部燒灼性疼痛為主，伴惡心、噯氣，或見焦慮、抑郁等心理癥狀的非器質性胃腸疾病[1]。流行病學研究發現，功能性胃腸疾病在中國的發病率高達35%，其中FD的患病率約占比1/6[2]。目前關于FD 的研究多集中在胃排空延遲、腦-腸軸功能紊亂、內臟高敏性、十二指腸炎癥等領域[3-6]，其中腦-腸軸作為大腦和胃腸道的雙向調節軸，在中樞神經系統層面可通過下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamicpituitary-adrenal axis，HPA）軸分泌激素，在正常情況下，HPA 軸有維持內環境穩定，參與機體應激反應的作用。當長期慢性應激導致HPA 軸功能亢進時，可影響機體的消化、免疫、情志，導致FD 的發病[7]。5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）與促腎上腺皮質激素釋放激素（Corticotropin releasing homone，CRH）廣泛分布于腦和胃腸組織中，可增強腦與胃腸之間的內在聯系，被稱之為“腦腸肽”[7]。研究顯示，電針可抑制亢進的HPA軸，下調5-HT、CRH 的表達，有加速胃排空，恢復胃腸消化功能，抗焦慮等作用[8-9]。5-羥色胺3 受體（5-hydroxytryptamine-3 receptor，5-HT3R）作為5-HT唯一的離子通道型受體，其高電流密度可加重胃腸不適，并與抑郁情緒的產生密切相關[10]。促腎上腺皮質激素釋放激素受體2（Corticotropin-releasing-factor receptor 2，CRHR2）是CRH 的亞型受體，可與CRH 多肽緊密結合，有減輕內臟疼痛，抗抑郁的作用[11]。NOD樣受體蛋白6（Nod-like receptor pyrin domaincontaining protein 6，NLRP6）在腸上皮細胞中高度表達，可以組成炎癥小體復合物[12]與杯狀細胞一起參與腸道免疫的調控，在腸道黏液分泌、黏膜屏障、腸道炎癥方面有正向的調節作用[13]。

本課題前期已從胃腸動力、內臟高敏性、十二指腸炎癥、焦慮抑郁情緒等[14-17]層面展開研究，實驗表明電針可有效提升FD 治療效果，但電針降低FD 大鼠HPA 軸的具體作用機制還有待深入研究，本實驗建立FD模型大鼠，以大鼠下丘腦、胃腸為觀察點，旨在從行為學、細胞、分子學角度，觀察電針對FD 模型大鼠曠場自主活動行為，胃黏膜細胞，十二指腸杯狀細胞，下丘腦5-HT3R、CRH，十二指腸CRHR2、NLRP6 的水平，探討電針對FD大鼠HPA軸的干預作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物與分組

SPF 級SD 雄性大鼠，40 只，體質量180-200 g，由三峽大學動物實驗中心供應，許可證號：SCXK（鄂）2022-0012。SD 大鼠飼養于SPF 級動物房，室溫（22±2）℃，晝夜明暗交替12 h，SD 大鼠自由采食無菌飼料、飲用無菌水，適應性喂養1 周后，隨機取10 只SD 大鼠組成空白組，剩余SD 大鼠行造模處理，14 天造模結束后，隨機取10 只SD 大鼠組成模型組，10 只SD 大鼠組成電針組。電針組繼續予以14 天電針干預。本實驗所有操作均符合《湖北省動物管理條例》條文規定（HUCMS202203001）[18]。

1.2 主要試劑與儀器

CRHR2抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：25267-2-AP）；NLRP6 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號：A15628）；內參抗體GAPDH（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：GB12002）；HE 染液套裝（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1003）；阿利新藍染液套裝（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1027）；三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10006818）；華佗穴位電針儀（南京濟生醫療科技有限公司，型號：SDZ-Ⅱ型）；一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司，0.28 mm×25 mm）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad，型號：CFX）；超微量分光光度計（賽默飛世爾中國科技有限公司，型號：NanoDrop2000）；酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司，型號：RT-6100）；臺式高速冷凍離心機（北京大龍興創實驗儀器有限公司，型號：D3024R）；轉印電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：SVT-2）；正置光學顯微鏡（日本尼康公司，型號：Nikon Eclipse E100）；全景切片掃描儀（三達科技股份有限公司，型號：PANNORAMIC 1000）等。

2 方法

2.1 建立FD大鼠模型

除10只空白組大鼠外，剩余大鼠均采取冰生理鹽水灌胃+不規則飲食+夾尾造模處理[19]，每日8∶30 和15∶00灌胃，提前解凍冰生理鹽水待用，當出現部分流動液體后開始灌胃，每只灌胃2 mL。灌胃結束后行夾尾處理，采用240 mm 止血鉗，將止血鉗頭部用自粘繃帶包裹，夾取部位選擇大鼠尾端1/3 處，輕輕夾起尾端，激怒大鼠，使其撕咬同籠大鼠，讓全籠大鼠處于一種焦躁、恐慌的狀態。操作過程中隨時觀察大鼠尾端情況，避免夾的太緊或時間過長而引發尾部缺血壞死，每次30 min，每天2 次，連續夾尾14 天。每日實驗結束后，查看大鼠尾部狀態，破皮處予以消毒處理，避免尾部感染。雙日8∶00清除大鼠籠子里剩余的飼料，行禁食處理，補充無菌水，自由飲水。當大鼠表現為喜扎堆，蜷縮角落，少動，毛發雜亂發黃，大便稀軟，可聞及刺激腥臭味，剩余飼料增多，體質量增長緩慢，提示造模成功[20]。

2.2 干預方法

空白組：常規飼養，不做特殊干預處理。模型組：造模成功后常規飼養，在電針組電針干預期間，抓取模型組大鼠，穿自制鼠衣，用相同的方法固定于鼠架上，每次30 min，每天1次，連續干預14天。電針組：造模結束第2天，用自制鼠衣將大鼠固定于鼠架上，暴露雙側上、下肢，取印堂（兩眼眶上緣最高點連線的中點，向下平刺5 mm）、內關（前肢內側，距腕關節約3 mm 的尺橈骨縫間，直刺1 mm）以及足三里（膝關節后外側，在腓骨頭下約5 mm處，直刺7 mm），定位參考《實驗動物常用穴位名稱與定位 第2部分：大鼠》[21]，穴位消毒后，用一次性毫針（0.28 mm×25 mm）針刺，快速破皮，得氣后，開啟華佗牌電針儀，1 組電極連接同側內關、足三里針柄，一共2 組電極，采用連續波，頻率2 Hz，電流強度1 mA，四肢微微抖動即可，干預結束后，拔出電針，無菌棉球按壓，避免出血。每次電針干預時長為30 min，每天1次，連續干預14天。

2.3 取材

電針干預結束后行最后1 次曠場實驗，實驗結束后，采用隨機排列表法，每組選取5 只大鼠，予以禁食處理，為第2 天取材做準備。腹腔注射，麻醉大鼠，全身麻醉后，用手術刀片逐層切開，暴露腹腔，找到胃賁門及幽門，用細線結扎，剪斷連接處，取出全胃，剪取胃竇，置于裝有4%多聚甲醛的痰杯中固定。后用鑷子分離與其他組織相連的腸管，剪取多段十二指腸組織，沿腸壁一側剪開十二指腸，清除腸內容物后，置于-80℃保存待用。剪取腦，迅速剝離全腦，在冰臺上取大鼠下丘腦組織，將分離出的下丘腦組織用冰生理鹽水沖洗，除去血液后，再用濾紙吸干水分，置于凍存管內，后加入RNA 保存液，放入干冰中迅速冷凍待檢。

2.4 觀察指標與檢測方法

2.4.1 大鼠一般狀態

每日8∶00給各組大鼠稱重，觀察并記錄各組大鼠實驗過程中的活動度、進食量、體質量的變化情況、毛發的整潔度、大便的干燥度等。

2.4.2 曠場實驗

采用曠場實驗檢測各組大鼠的自主行為以及對陌生環境的緊張度。分別于造模結束后、干預1 周及干預2周后進行曠場實驗，調試好設備后，將大鼠放置于長寬均40 cm，高50 cm 的正方形反應箱的中央區域，適應30 s 后，開始計時，每只大鼠測試時長為5 min，采用Smart 3.0軟件進行數據分析，記錄5 min內大鼠的自主運動距離和運動速度，全程保持安靜，以免干擾大鼠活動。每只大鼠檢測完畢后，先噴灑75%乙醇酒精，再用酒精濕巾清潔前1 只大鼠留在反應箱內壁及底面的大小便，最后用干紙巾擦干，以排除前一只大鼠留下來的氣味干擾。

2.4.3 大鼠胃竇組織病理學變化

采用HE 染色法檢測，取胃竇組織，石蠟包埋，用切片機切成厚度5 μm的薄片，蘇木素染色5 min，自來水洗，分化液分化，再次水洗，返藍液藍化，入伊紅染液中染色5 min，漂洗透明，樹膠封片。置于×200 光學顯微鏡下，觀察大鼠胃竇組織形態。

2.4.4 大鼠下丘腦5-HT3R、CRH表達

采用實時熒光定量PCR 法檢測，取100 mg凍存的下丘腦組織，剪碎后充分研磨至無肉眼可見組織塊，用TRIzol 法提取總RNA，取10 μL RNA 逆轉錄成cDNA，最后用實時熒光定量PCR 儀進行目的mRNA含量檢測。5-HT3R、CRH 和GAPDH 引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，序列見表1。反應條件95℃持續30 min 預變性，然后95℃持續15 s，最后60℃持續30 s，連續40 次，監測熔解曲線，以2-△△Ct法算出大鼠下丘腦5-HT3R、CRH mRNA相對表達量。

表1 mRNA引物序列

2.4.5 大鼠十二指腸CRHR2，NLRP6蛋白表達

采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測，取50 mg 十二指腸組織，添加250 μL RIPA 裂解液，低溫研磨，提取蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白的質量濃度；經SDS-PAGE 凝膠泳道上樣，電泳后將蛋白轉膜，室溫封閉30 min；添加一抗（CRHR2 1∶1000，NLRP6 1∶1000），4℃恒溫孵化一夜，用TBST 洗膜3 次，添加HRP標記的二抗（山羊抗小鼠IgG 1∶5000），室溫孵化30 min，添加ECL 溶液曝光，GAPDH 為內參，采用Image J圖像分析軟件提取目的條帶灰度值。

2.4.6 大鼠十二指腸杯狀細胞的表達

采用阿利新藍染色法檢測，取凍存的十二指腸組織，石蠟包埋，超薄切片后，脫臘水洗，將切片浸泡于阿利新藍A 染液中10 min，水洗后，用阿利新藍B 染液浸染細胞核3 min，至細胞核清晰，脫水透明，樹膠封片。使用CaseViewer2.2 掃描瀏覽軟件選取組織的目的區域進行成像（×100），成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0 分析軟件分別測量每張切片中5 根絨毛上皮長度（mm），并計算上皮杯狀細胞數量，可按照如下方法計算：單位長度杯狀細胞=杯狀細胞/腸腺上皮長度。

2.5 統計學處理

選用SPSS 27.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較方差齊用LSD 檢驗，方差不齊采用Dunnett-t檢驗；組內比較采用重復測量方差分析法。以P<0.05 或P<0.01 為差異具有統計學意義的標準。

3 結果

3.1 各組大鼠的一般狀態比較

造模前，各組大鼠反應靈敏，常有毛發修飾行為，糞便干燥。造模14天后，模型組和電針組大鼠反應遲鈍，昏睡，毛發發黃雜亂，大便不成形伴腥臭味。電針干預14天后，與模型組相比，電針組大鼠機警，動作敏捷，毛發柔順，大便顆粒狀，無明顯刺激異味。

3.2 各組大鼠曠場實驗對比

造模后，與空白組相比，模型組和電針組大鼠的曠場自主運動距離明顯縮短，運動速度明顯減慢（P<0.01）；干預2 周后，與空白組相比，模型組大鼠的曠場自主運動距離及運動速度均呈下降趨勢（P<0.01），中央區運動減少，多在周圍區徘徊。與模型組相比，電針組大鼠的曠場自主運動距離及運動速度均明顯上升（P<0.01），其中央區穿行次數增多。見圖1及表2-3。

圖1 各組電針干預2周后的曠場實驗軌跡比較

表2 各組大鼠干預前后自主運動距離比較（±s，n=10，cm）

表2 各組大鼠干預前后自主運動距離比較（±s，n=10，cm）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

干預2周后1487.35±334.58 250.52±85.75**1417.13±359.21△△組別空白組模型組電針組造模后1514.01±316.02 378.45±260.09**394.04±227.6**干預1周后1498.22±332.59 345.3±188.44**1251.76±372.54△△

表3 各組大鼠干預前后運動速度比較（±s，n=10，cm·s-1）

表3 各組大鼠干預前后運動速度比較（±s，n=10，cm·s-1）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

干預2周后11.29±2.15 4.34±1.69**10.63±1.79△△組別空白組模型組電針組造模后10.03±2.03 5.51±1.85**5.89±1.53**干預1周后11.25±1.56 5.23±1.57**10.64±1.89△△

3.3 各組大鼠胃竇組織病理學形態比較

空白組大鼠的胃竇黏膜排列有序，各層肌纖維上色均勻，間質細胞無明顯增生，未見炎癥反應。模型組大鼠的胃竇基質組織液分泌增多，黏膜有輕度水腫，可見疏松的結締組織，淋巴細胞。電針組大鼠的胃竇黏膜外觀形態正常，各層肌纖維著色一致，細胞排列整齊，黏膜上皮完整，未見明顯細胞脫落，沒有炎癥細胞聚集。見圖2。

圖2 各組大鼠胃竇組織病理學形態比較（HE染色，×200）

3.4 各組大鼠下丘腦中5-HT3R、CRH表達比較

與空白組相比，模型組大鼠下丘腦5-HT3R、CRH大幅升高（P<0.05）。與模型組相比，電針組大鼠下丘腦5-HT3R、CRH大幅降低（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠下丘腦5-HT3R、CRH表達（±s，n=5）

表4 各組大鼠下丘腦5-HT3R、CRH表達（±s，n=5）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

CRH 0.81±0.18 2.02±0.2*0.78±0.13△△組別空白組模型組電針組5-HT3R 1.05±0.3 2.66±0.76*1.11±0.28△

3.5 各組大鼠十二指腸中CRHR2、NLRP6 蛋白表達比較

與空白組相比，模型組大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6 蛋白表達量大幅降低（P<0.05）。與模型組相比，電針組大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6 蛋白表達大幅升高（P<0.05）。見圖3及表5。

圖3 各組大鼠十二指腸中CRHR2、NLRP6蛋白表達情況（±s）

表5 各組大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6表達（±s，n=5）

表5 各組大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6表達（±s，n=5）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

NLRP6 0.87±0.22 0.39±0.06*0.93±0.22△組別空白組模型組電針組CRHR2 1.28±0.11 0.56±0.23**1.34±0.28△△

3.6 各組大鼠十二指腸單位長度杯狀細胞數表達比較

與空白組相比，模型組大鼠十二指腸黏膜排列疏松，腸絨毛結構破碎，可見散在分布的上皮細胞，上皮杯狀細胞嚴重缺失，單位長度杯狀細胞數表達量明顯降低。與模型組相比，電針組十二指腸絨毛排列緊密，組織完整無破碎，阿利新藍染色均勻，杯狀細胞無缺失，單位長度杯狀細胞數表達量明顯升高（P<0.05）。見圖4及表6。

圖4 各組大鼠十二指腸組織切片形態比較（阿利新藍染色，×100）

表6 各組大鼠十二指腸單位長度杯狀細胞數表達量（±s，n=5，n·mm-1）

表6 各組大鼠十二指腸單位長度杯狀細胞數表達量（±s，n=5，n·mm-1）

注：與模型組比較，△P<0.05。

組別單位長度杯狀細胞數51.93±10.21 35.03±5.79 56.62±9.14△空白組模型組電針組

4 討論

早在1991 年，Mearin 等[22]便提出實驗假設，認為FD 患者的消化不良癥狀是由腦-腸軸功能失常而引發。目前有越來越多的學者更加深入地研究腦-腸軸功能與FD 的相關性， Xue等[23]發現腦腸肽及腸道菌群的異?？蓪δX-腸信號造成干擾，影響胃腸運動及短鏈脂肪酸的釋放，誘導FD 患者出現腸道炎癥和內臟高敏性。?chiopu 等[24]通過多數據庫的文獻引證，認為伴有精神癥狀的FD 患者可通過腸道微生物群來調控HPA軸，其中HPA軸是腦-腸軸的關鍵參與者，可對外界壓力、大腦和腸道信號做出反應，從而達到情志與胃腸的雙向調節作用。

現代HPA 軸理論可從中醫經絡循行、臟腑功能角度加以理解。手陽明大腸經、足陽明胃經以及手太陽小腸經均上行絡腦。腦為髓海，頭部精氣匯聚于腦，稱為頭氣街；脾胃為水谷之海，胃腸精氣匯聚于腹部，稱為腹氣街，兩者由氣街四海相貫通，滲灌氣血津液于全身[25]，可見經絡、氣街四海為腦與脾胃溝通的橋梁?！澳X為元神之府”可主宰人體的生命活動，主司精神及感覺運動。胃腸的受納功能依賴于大腦感知系統的正常運作，若大腦無法獲取胃腸的饑餓信號，即使胃腸功能無異常，胃腸也無法正常受納水谷?！捌⒃隗w合肉，主四肢”，脾胃運化水谷，化生氣血津液充養全身，若脾胃虛弱，氣血化生乏源，腦及四肢失于濡養，元神受損，則令人不寐，易感疲乏，日久則肉削肌痿，運動失司[26]。

足三里是水谷之海匯聚之所，內關是心包經氣聚集之要，兩者合用是臨床治療FD 的經典配穴[27]。前期研究表明，針刺足三里可刺激胃體收縮，增加胃腸道的蠕動，還可加速胃腸道黏膜的修復[28]。針刺內關可降低胃腸炎癥反應，增強機體免疫力，又可下調腦區復雜度，緩解焦慮情緒[29]。鄭嘉怡等[26]認為情志不暢可誘發或加重FD，減弱胃腸的運動功能；而胃腸排空的延遲易興奮HPA 軸，刺激CRH 的釋放，增加抑郁情緒的發作風險，表明壓力可雙向調節FD 大腦與胃腸功能。因此，本研究在足三里、內關的基礎上搭配有解郁調神的印堂作為干預選穴。李翔等[30]研究發現，采用針刺印堂的方法來干預抑郁模型小鼠可增加小鼠曠場實驗中央區活動時間，提升糖水偏好實驗百分比，表明針刺印堂有緩解小鼠抑郁樣行為的作用。三穴同用，以期能較好地探討電針對FD 大鼠HPA 軸的作用機制。

曠場實驗是一項用于評估實驗大鼠抑郁狀態的行為學指標，大鼠的自主活動水平可反映其興奮性和對陌生環境的適應性[31]。本實驗結果顯示：造模后，與空白組大鼠相比，模型和電針組大鼠曠場自主運動水平顯著下降，說明FD 大鼠經過多因素造模刺激后出現類似人類的抑郁樣情緒，經過2周的干預后，電針組大鼠自主運動距離和運動速度及中央區穿行活動均得到提升，與本課題前期實驗結果相一致，提示電針可有效改善大鼠的焦慮和抑郁行為。

5-HT 是調節胃腸功能的重要腦腸肽之一，在腦和腸道均有分布，異常釋放的5-HT 與其受體結合，可增強內臟敏感性、誘發胃腸炎癥、降低胃腸動力[32]。5-HT3R[33]是5-HT 的受體之一，被活化的5-HT3R 可改變Na+、K+、Ca2+離子的通透性，促進細胞外Na+、K+、Ca2+離子內流，增強5-HT3R 通道電流密度，可引發腹脹、腹痛等胃腸道不適癥狀，同時神經元Na+、K+、Ca2+在5-HT3R 受體介導的離子通道中異常流動，可加重抑郁情緒的發作[10]。隊列調查研究顯示，抑郁情緒或心理壓力會增加FD 的發病風險。長期的慢性應激會過度興奮HPA 軸，升高下丘腦CRH 水平，可促進炎癥細胞因子的釋放，增加腸道黏膜通透性[34]。CRHR2 是CRH受體之一，在腦和胃腸均有表達，與CRH 多肽Ucn2 和Ucn3 存在高親和力，主要發揮拮抗應激反應的作用，如抗焦慮[11]。本研究結果顯示，FD 大鼠下丘腦5-HT3R、CRH 明顯增多，十二指腸CRHR2 蛋白表達減少，結合FD 大鼠曠場自主運動的減弱、光鏡下觀察到胃竇黏膜的水腫及炎癥細胞的浸潤情況，說明機體的過度應激致使HPA 軸興奮性增高，體內的激素、神經遞質釋放增多，引發胃腸與心理情緒的異常。電針干預后，5-HT3R、CRH 顯著下降，CRHR2 蛋白水平升高，曠場自主運動水平提升，胃竇腫脹及炎癥情況得以改善，提示電針印堂、內關、足三里可下調5-HT3R、CRH 的表達，提升CRHR2 蛋白水平，這與電針抑制HPA 軸過度興奮，降低胃腸炎癥，緩解抑郁情緒的作用相一致。

NLRP6 可識別腸道微生物、細菌代謝產物、病毒RNA 以及細菌脂磷壁酸，有增強腸道防御、調節腸道微生態、參與機體炎癥免疫應答的作用[35]。腸道黏膜屏障的缺損使體內的細菌、病毒等有害物質損害腸黏膜，引發腸道炎癥反應。杯狀細胞及其分泌物是黏液屏障的重要組成部分，具有維持腸道微生物穩態的作用[36]。Wlodarska 等[37]研究發現，缺乏NLRP6 炎癥小體的小鼠，腸道的黏膜屏障受到損害，無法正常清除腸道黏膜表面的病原體，加大了腸道持續感染的風險，其機制可能是黏蛋白顆粒無法和腸上皮融合進而影響黏蛋白的胞吐作用，也可能是杯狀細胞自噬缺陷干擾了腸道黏液的分泌。Holzer 等[38]認為慢性應激可興奮HPA 軸，擾亂機體胃腸微生物菌群以及腸道穩態。眾所周知，腸黏膜屏障是由腸黏膜細胞和免疫細胞所構成，是機體抵抗外界病原菌侵襲的一道重要防線。如果腸道黏膜屏障的功能受損，就會對腸道細菌和外源性有害物質的入侵產生影響，引發機體的過度免疫反應，進而引起機體的病變[39]。在這當中，杯狀細胞以及其所分泌的黏蛋白組成了腸道免疫的第一道防線，在抵御外部刺激和微生物侵入的時候，為腸道提供了保障，對維持腸道共生菌群的平衡有很大的幫助作用，對維持十二指腸屏障的正常功能具有重要意義[40]。朱春洋等[41]采用四逆散干預FD 模型大鼠，采用阿利新藍染色法觀察到FD 模型大鼠十二指腸杯狀細胞數量明顯減少，與本實驗結果一致。此外，杯狀細胞還可通過其分泌物三葉因子-3 和腸道杯狀細胞特異性蛋白-抵抗素樣分子 β 共同保障腸道屏障的完整，在此過程中由杯狀細胞表達的羥基轉移酶可防止黏蛋白的降解，降低腸道炎癥、癌細胞的致病風險[42]。本研究結果發現，多因素干預建立的FD 模型大鼠的NLRP6蛋白表達下降，在阿利新藍染色實驗中，模型組大鼠十二指腸腸絨毛排列疏松，上皮杯狀細胞表達下降，提示FD 大鼠十二指腸黏膜屏障受損。電針組大鼠NLRP6 蛋白表達增高，腸絨毛排列緊密，組織染色均勻，上皮杯狀細胞數明顯增多，提示電針印堂、內關、足三里可激活NLRP6 蛋白，促進杯狀細胞表達，進而增加腸道黏液的分泌，修復十二指腸黏膜屏障的同時還可清除有害的病原體。

綜上所述，本研究從行為學、神經遞質、激素和黏膜屏障等角度驗證電針印堂、內關、足三里可作用于HPA軸，不僅可以調節胃腸動力，減輕胃腸炎癥，修復黏膜屏障，而且在心理、抑郁情緒等方面有顯著的調節作用，這也與中醫學“脾（胃）-腦”神識系統理論[7]相符合。