液體活檢在膠質瘤中的應用及展望

依日扎提·艾力 王增亮 努爾斯曼古麗·買買提明 秦虎 汪永新

【摘要】膠質瘤是一種最常見的原發性顱內腫瘤，由于其早期診斷困難、解剖位置復雜及復發率高，導致其預后極差，使之成為致死性最高的惡性腫瘤之一。近幾年來，隨著二代測序技術的發展，液體活檢以可重復性和微創為特點在膠質瘤的早期發現、耐藥監測、靶點檢測及預后預測中表現出了良好的應用前景。然而，液體活檢在膠質瘤患者臨床應用中仍面臨著一系列的挑戰，本文綜述液體活檢及其生物標志物在膠質瘤中的研究進展及其臨床應用。

【關鍵詞】膠質瘤；液體活檢；腦脊液；生物標志物

【中圖分類號】R739.41【文獻標志碼】A【文章編號】1672-7770（2024）01-0091-04

Application and prospect of liquid biopsy in glioma Yirizhati Aili， WANG Zengliang， Nuersimanguli Maimaitiming， et al. Department of Neurosurgery， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China

Corresponding author： WANG Yongxin

Abstract： Glioma is one of the most common primary intracranial tumors. Due to difficulty of early diagnosis， complicated anatomical location and high recurrence rate， it has a very poor prognosis， making it one of the most fatal malignant tumors. In recent years， with the development of second-generation sequencing technology， liquid biopsy characterized by reproducible and minimally invasive methods has shown promising applications in the early detection， drug resistance monitoring， target detection and prognostic prediction of glioma. However， liquid biopsy still faces several columns of challenges in the clinical application of glioma patients. Therefore， this paper will explore the progress of liquid biopsy and its biomarkers and its clinical application in glioma.

Key words： glioma; liquid biopsy; cerebrospinal fluid; biomarkers

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金重點項目（2022D01D70）；新疆維吾爾自治區區域協同創新專項（上海合作組織科技伙伴計劃及國際科技合作）項目（2021E01013）

作者單位：830054 烏魯木齊，新疆醫科大學第一附屬醫院神經外科中心（依日扎提·艾力，王增亮，秦虎，汪永新），干部保健中心（努爾斯曼古麗·買買提明）

通信作者：汪永新

膠質瘤是中樞神經系統最常見的成人惡性腫瘤，占中樞神經系統腫瘤的75%～80%。根據WHO分級分為Ⅰ-Ⅳ級，其中膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）的惡性程度最高，平均總生存期不足14.6個月［1］。膠質瘤傳統的診斷和治療手段主要以組織活檢為標準，但由于腫瘤異質性、特殊的解剖部位及侵襲性等原因使得其在臨床上仍具有一定的局限性［2］。液體活檢則在一定程度上彌補了傳統活檢的局限性，從診斷到指導個體化治療具有重要的意義和應用前景。

1液體活檢

“液體活檢”通過監測尿液、腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）及血液等樣本中腫瘤起源的原發性或轉移性腫瘤病變脫落的細胞，循環DNA、RNA及循環外泌體等，實現腫瘤的早期、動態及低創監測。由于傳統活檢無法動態檢測腫瘤發展過程，同時難以捕捉較小的病灶，因此，由于非侵入性診斷工具的不斷發展，液體活檢因其優勢在多種實體腫瘤的診斷和治療中廣泛應用［3］。對于中樞神經系統腫瘤患者而言，液體活檢最常用的標本主要是CSF、血液及唾液。其中，CSF可以與中樞神經系統內病灶直接接觸并包含腫瘤代謝產物，因此CSF成為中樞神經腫瘤液體活檢理想的樣本［4］。1990年科學家首次在皰疹性腦炎患者CSF中，檢測出病毒特異性DNA。此后，Siegal等［5］在膠質瘤CSF來源的循環DNA中檢測到p53基因突變。隨后液體活檢逐漸成了膠質瘤基礎和臨床研究的新熱點，有望替代傳統活檢，進而幫助膠質瘤患者制定更好的治療方案。

相對于傳統的組織病理活檢而言，液體活檢不會對腦組織造成損傷，可以在疾病不同階段連續進行，在腫瘤進展的不同時期可檢測到原發腫瘤相關遺傳信息，從而實現早期診斷、動態監測及評估預后，因此成為一種有前途的監測工具。

1.1膠質瘤中的CTCs檢測循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是從原發灶的膠質瘤細胞或膠質瘤干細胞脫落并進入血管、CSF或唾液的游離腫瘤細胞，因此CTCs具有腫瘤細胞和干細胞的特性，包含原發腫瘤的特異性遺傳物質和腫瘤分子表型等重要的信息［6］。目前多項研究證實，CTCs在肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤和嗜鉻細胞瘤等多種實體腫瘤的早期診斷、評估療效和預后中具有一定的作用［7］。但是，由于目前CTCs最常用的方法依賴于監測上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM），而該分子在膠質瘤細胞中不表達，導致CTCs在膠質瘤患者中檢出率約為21%～82%［8］，從而限制了其在臨床上的實際應用。

研究表明，膠質瘤患者CSF中的CTCs具有高間充質和少量的神經信號，隨著表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）拷貝數增加，染色體數量也改變（3、7和12號染色體增加，10、13和22號染色體丟失），此過程與原發腫瘤同步。使用二代測序（next generation sequencing，NGS）或更敏感的靶向檢測方法對膠質瘤患者CSF中的CTCs進行突變分析可能有助于篩查復發風險較高的GBM患者和直接動態干預治療策略。因此，GBM患者CSF中的CTCs分析有助于更確切地區分分子亞型，因此可以作為評價預后和療效的生物標志物［9］。此外，CTCs狀態與膠質瘤患者的臨床特征有密切聯系，CTCs陽性與治療耐藥、局部復發和較短的無進展生存期顯著相關；同時，對于晚期GBM患者CTCs的動態監測具有區分腫瘤復發和假性進展的能力［10-11］。因此，表明CTCS計數反映了疾病狀態，隨著病情進展而增加，而在放化療之后會下降。CTCs分析可能作為常規MRI的補充，更確切地監測GBM患者病程變化。

雖然CTCs在GBM患者中有很大的應用前景，但是其在臨床環境中仍受到質疑和挑戰。首先，GBM患者CSF中提取CTCs存在濃度低及方法復雜等缺點。其次，由于腫瘤細胞基底膜的異質性，從單個分析CTCs的分子亞型和特征所獲得的信息不能充分代表患者整個病變進展。最后，到目前為止關于GBM患者CSF中CTCs的研究數量有限，各研究所包含的患者樣本量較少，沒有長期研究數據，所得出的研究結果存在質疑。

1.2膠質瘤中的循環腫瘤核酸檢測循環腫瘤核酸（circulating tumor nucleic acids，ctNAs）包括循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA、ctDNAs）和循環腫瘤RNA（circulating tumor RNA、ctRNAs），它們通過病變組織的分解釋放到血液、CSF以及尿液中［12］。分析ctNAs的難點是需要高靈敏度和特異度的技術來提取循環中低濃度的ctNAs，同時需要與正常細胞釋放的高濃度循環游離DNA和RNA分離。在晚期的實體腫瘤，如晚期肺癌患者血液中存在較高濃度的ctNAs，并且已被廣泛研究證明是預測全身治療反應的早期預測因子［13］。

相關研究已表明，ctNAs已在一些原發性中樞神經系統腫瘤患者中檢測到，包括星型膠質細胞瘤和少突膠質細胞瘤。在一項研究中，所有少突膠質細胞瘤和80.5%星型膠質細胞瘤患者血清中可以檢測到較高濃度的ctDNAs，并且ctDNAs中顯示腫瘤相關特異性生物標志物［O6-甲基鳥嘌呤甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因子甲基化/10q LOH/1p或19q LOH］［14］。另一項研究中，在33例中樞神經系統腫瘤患者（7例原發性GBM，8例星型膠質細胞瘤，2例膠質肉瘤，6例腦膜瘤和10例轉移瘤）的血清中檢測與原發性中樞神經系統腫瘤相關的基因（MGMT、RASSF2B、CDKN2A）甲基化狀態。結果顯示，星型膠質細胞瘤組70%的患者血清ctDNAs中，檢測到至少一個基因啟動子甲基化；同樣，轉移瘤組中的7例患者和腦膜瘤組中的3例患者中，檢測到至少一個基因啟動子甲基化；在5例GBM患者血清中檢測到較低濃度ctDNAs并發現與原發腫瘤相關的生物標志物。但是與其他腫瘤區別的是，GBM患者血清中ctDNA的濃度和陽性率均較低［15］。2014年，Bettegowda等［16］證實CSF是比血清更好的，作為檢測原發性腦部腫瘤來源的ctNAs的樣本。Huang等［8］對35例中樞神經系統患者進行CSF的ctDNAs進行測序，結果顯示74%的樣本中含有原發腫瘤DNA，且腫瘤DNA的檢出率與腫瘤的解剖位置和腫瘤分級有關，而與腫瘤大小無關。Baraniskin等［17］發現，膠質瘤患者CSF的ctRNAs中miR-15b和miR-21的聯合檢測可以區分膠質瘤和原發性中樞神經系統淋巴瘤。由于在治療過程較容易獲得患者CSF，動態監測患者CSF或血液中的ctNAs不但有助于疾病的早期診斷，也有望實現不同階段的個體化治療。

1.3膠質瘤中的循環外泌體檢測外泌體（exosomes）是被膜包裹的胞外囊泡，一般直徑為40～100 nm，多種細胞在正常及病理狀態下均主動分泌外泌體，它攜帶了各種細胞成分，如蛋白質、核酸（mRNA、DNA、非編碼RNA）和脂類。外泌體可以介導細胞間通訊，通過釋放包含的生物因子，從而改變受體細胞的分子活動。因此，腫瘤細胞釋放的外泌體中含有腫瘤特異性生物標志物并可以檢測到原發腫瘤特點。一項研究結果表明，移植人類癌癥干細胞的小鼠模型中，小鼠CSF中檢測到腫瘤細胞相關的胞外囊泡［18］。另一項研究表明，在膠質瘤患者中低級別和高級別膠質瘤患者CSF中都可以分離胞外囊泡，并且反映病變進展程度［19］。這些研究結果證明，外泌體可用于檢測臨床相關的預后生物標志物，如CSF來源的胞外囊泡中檢測到 IDH1-R132H的突變。

一項研究中，隨訪檢測腫瘤切除術后膠質瘤患者血漿外泌體中基因表達情況，結果表明這些胞外囊泡與腫瘤切除后復發有關，其外泌體中特異性miRNA的差異表達可為膠質瘤的診斷和監測藥物耐性提供新的生物標志物［20］，進一步地證明CSF或血漿中外泌體分析有助于膠質瘤的早期診斷、評估預后以及檢測對化療藥物的耐藥性。

2樣本的選擇

CSF被認為是一種包含大量腫瘤信息的、可分析循環腫瘤標志物的理想液體活檢樣本。雖然獲取CSF途徑是有創操作并具有一定的風險，并不是所有患者都能承受風險，但是與傳統取活檢相比，它是一種微創手術活檢，獲取較簡單、創傷小。在膠質瘤患者中CSF可作為液體活檢的樣本，可以動態監測疾病進展，但這個過程需要患者同意并反復進行腰椎穿刺［21］。

目前研究表明，在膠質瘤患者CSF中可以提取較高濃度的ctDNAs，而ctDNAs的濃度相比血清中的濃度高，這一結果表明CSF是比較理想的液體活檢樣本［22］。在一項研究中，采用NGS對85例膠質瘤患者CSF的ctDNA進行分析，其中WHO分級Ⅳ級46例，Ⅲ級26例，Ⅱ級13例，其中49.4%的患者CSF的ctDNAs中檢測到基因改變，20例患者的實體組織活檢樣本與CSF的ctDNAs分析的基因都有相似的突變。同時，CSF中的ctDNAs也顯示拷貝數改變、啟動子突變、蛋白質編碼突變和結構重排，盡管患者缺乏腫瘤分級、病程或既往病史，但ctDNAs分析的上述變化與較差的預后相關，且具有指導用藥的作用［9］。一項對繼發性腦轉移瘤的原發性肺癌患者的研究支持上述觀念，認為CSF是理性的液體活檢樣本。該研究通過NGS方法分別對CSF的ctDNAs和血清的ctDNAs突變模式進行了檢測，結果表明與原發腫瘤相關突變基因在CSF ctDNAs、血清ctDNAs和CTCs中陽性率分別為95.2%（20/21）、66.7（14/21）和39%（8/21）。12例患者（57.2%）通過CSF中生物標志物分析可以檢測到EGFR突變，而通過血清ctDNAs和CTCs檢測到5例。CSF中ctDNAs EGFR的突變與原發性腫瘤EGFR的突變一致率為88.9%［14］。

綜上所述，對于中樞神經系統腫瘤CSF可以作為更可靠、更理想的液體活檢樣本，是因為CSF本身在腦室和脊髓腔內循環流動，能直接接觸病變組織，含有大量的腫瘤脫落細胞及代謝產物。然而，由于CSF液體活檢用于動態連續檢測疾病進展，而CSF獲取具有一定的侵襲性，不同個體接受程度不同，所以這需要在實際臨床中權衡其利弊。CSF液體活檢在臨床中的應用價值還需進一步研究證實。

3液體活檢在膠質瘤臨床診療中的應用

隨著基因芯片技術的大力發展，液體活檢在膠質瘤診斷、預后及療效評價中展現出了巨大的應用前景。Baraniskin等［17］首次報道在CSF中miR-15b和miR-21的聯合檢測可以用于膠質瘤的早期診斷。隨后，Teplyuk等［23］也發現，CSF中miR-10b和miR-21可以將膠質瘤和其他神經系統疾病鑒別，而miR-200家族則有助于鑒別腦轉移瘤和膠質瘤。同時，已有研究表明［18］，CTCs和外泌體可用于診斷可外科手術治療的膠質瘤，其隨著膠質瘤惡性程度的增加在血液和CSF中CTCs和外泌體數量增加。此外，一些研究表明CSF中特定的生物標志物也可以用于膠質瘤的早期診斷［24］。

此外大量的研究表明，特定CTCs或ctNAs的異常表達與較短的總生存期（overall survival，OS）和/或無進展生存期（progression free survival，PFS）顯著相關，提示可能在中樞神經系統腫瘤患者中具有預測預后的價值。Martínez-Ricarte等［25］研究分析來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的2個腫瘤組（包括 648 例彌漫性膠質瘤）的 異檸檬酸脫氫酶1（isocitric dehydrogenase 1，IDH1）、IDH2、TP53、TERT、ATRX、H3F3A 和 HIST1H3B 基因突變，對20例膠質瘤患者的臨床腫瘤標本及CSF中上述7個基因進行的靶向外顯子測序和微滴式數字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）分析發現，CSF-ctDNA可對腫瘤進行準確地組織病理分型，并與預后相關。禹金良等［26］在膠質瘤患者CSF中發現，PIK3CA、KRAS、EGFR突變基因匹配到潛在耐藥藥物，對臨床靶向治療具有指導作用。Zhi等［27］的研究證實了9個miRNAs組合是一個獨立于其他臨床病理因素的重要預后評估指標，其還觀察到星形細胞瘤患者血液中9種miRNAs，包括miR-15b、miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-106a、miR-182、miR-182、miR-520h的表達水平均比健康組顯著增高，而手術后這9種miRNAs的表達水平明顯降低。以上述種種證據初步表明，基于膠質瘤患者中CSF和血漿的液體活檢，可用于腫瘤的診斷、預后及療效評價的生物標志物分析，然而液體活檢在臨床診療中處于初步應用階段，仍需要大量的研究證實。

4結論

大量的研究結果表明，對膠質瘤患者中CSF和血漿的液體活檢，可以作為組織活檢的潛在替代品，用于膠質瘤的診斷和預后生物標志物?？紤]到傳統取活檢相對困難及風險較高，而開發與腫瘤發展相關生物標志物是膠質瘤個體化治療趨勢中必不可少的。液體活檢提供了更安全、更方便的技術來獲取腫瘤相關分子信息，可以低創動態地對疾病進行診斷、調整治療方案以及有助于靶向藥物的研發。然而，這些研究規模較小，尚不能形成有力的統計學結論來證明腫瘤生物標志物的檢測與疾病參數的相關性。而且液體活檢需要依靠一些較前沿的技術如NGS，數字PCR等，技術成本較高且對檢測人員要求也高，因而限制了其在臨床中的應用。因此，這些需要大量的研究驗證液體活檢技術在膠質瘤患者中的有效性和可靠性，同時需要不斷地開發更簡單、更準確的方法來進行生物標志物的監測及療效評估等。

利益沖突：?所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻］

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（收稿2022-10-20修回2023-01-31）