基于細胞信號通路探討中藥復方治療冠心病研究進展※

路清越 宋耀鴻

(1.南京中醫藥大學2021級碩士研究生,江蘇 南京 210056;2.南京中醫藥大學附屬南京中醫院心內科,江蘇 南京 210022)

心血管疾病在我國乃至全球發病率和死亡率均較高[1]。據調查,在歐洲49%的女性和40%的男性死亡都與心血管疾病密切相關[2-3]。冠心病(coronary atherosclerotic heart disease,CHD)為心血管疾病中的高發病種,在2017年我國2.9億心血管疾病患者中,CHD患者高達1100 萬人[4],預計到 2030 年全球將有23.3億人死于該病[5]。目前,CHD的主要致病因素有血糖異常、高脂血癥、吸煙、肥胖、高血壓、高尿酸、高同型半胱氨酸(Hcy)血癥等[6],其病理機制較為復雜,主要與心肌細胞的能量代謝障礙、細胞自噬和凋亡等因素密切相關。其治療主要是提高患者冠狀動脈的供血速度,使患者心肌耗氧量降低,改善血管內的炎癥狀態,保護心肌細胞等,從而改善臨床癥狀,但因其發病機制尚未完全清楚,臨床治療難度較大。

CHD屬中醫學“胸痹心痛”“厥心痛”“卒心痛”“真心痛”范疇。2008年《中藥臨床藥理學》[7]將該病分為七大證型:心血瘀阻、痰阻心脈、寒凝心脈、氣滯心胸、心氣虧虛、心腎陽虛和心陰不足。臨床上分別用血府逐瘀湯、瓜蔞薤白半夏湯合滌痰湯、枳實薤白桂枝湯合當歸四逆湯、柴胡疏肝散、保元湯、參附湯合桂枝甘草湯和天王補心丹合炙甘草湯對癥加減治療,每獲良效。

目前,雖有較多文獻研究證實中藥復方治療CHD可通過抗炎性因子、抗氧化、保護內皮細胞和防止心肌損傷等方面發揮效果,但對于CHD調控細胞信號通路的相關作用機制方面缺乏最新的文章綜述。我們對中藥復方治療CHD的關鍵信號通路作用機制予以綜合總結論述,進一步闡明中藥復方在分子水平治療CHD的作用機制,為發掘CHD的潛在治療手段提供幫助。

1 CHD與細胞信號通路

1.1 核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路 NF-κB是一種特殊的蛋白質,也是一種重要的轉錄激活因子,該蛋白通過與固定核苷酸序列結合,啟動基因轉錄功能,在機體的免疫反應、炎癥的發生和發展進程等方面發揮重要作用。在促炎方面,NF-κB信號的異常調節可誘導促炎細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、IL-1β,趨化因子趨化蛋白1、IL-8和一氧化氮合酶(iNOS)等炎癥靶基因持續表達,趨化炎癥細胞浸潤募集,直接維持和放大局部促炎反應,從而導致組織損傷和炎癥[8-9]。此外NF-κB 還能通過刺激可作為NF-κB 刺激劑的TNF-α 和 IL-1β 等細胞因子,進一步活化自身,以此放大炎性反應[9]。在心肌損傷方面,SHANG X等[10]研究表明,白藜蘆醇可通過激活自噬通路磷脂肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路和抑制NF-κB信號通路及相關炎癥因子對膿毒癥心肌起保護作用。

1.2 PI3K/Akt/內皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號通路 PI3K/Akt/eNOS傳導通路參與細胞存活、凋亡和增殖等重要生理功能。PI3K是真核細胞膜的重要組成部分,在心臟中PI3K可與胰島素共同作用形成胰島素/PI3K信號通路,該通路的激活可參與多種心肌細胞的生理病理過程。PI3K中 p110α可調節心肌細胞的L型Ca2+通道(LTCC),而心肌細胞的收縮又依賴于內向Ca2+電流(CIcaL)通過電壓依賴性LTCC引起。若PI3K通路受到抑制則會導致胰島素信號傳導異常,進而影響心肌收縮功能引起收縮障礙[11]。Akt一方面可介導eNOS磷酸化及血管生成和舒張;另一方面可激活下游的信號分子保護心臟,通過激活Akt/eNOS信號通路調節內皮細胞增殖。此外,Akt的磷酸化可激活NF-κB,從而促進TNF-α、IL-1β等促炎因子的分泌和表達引起炎性反應[12]。因此,PI3K/Akt/eNOS信號通路在保護心肌和心肌細胞的炎性反應方面發揮重要作用。王新強等[13]研究發現,長期活化該信號通路可促進心肌細胞炎性反應和心肌纖維化。趙桂香等[14]的研究提示,通過促進PI3K/Akt信號通路下游產物eNOS的合成能對心肌細胞起到保護作用。

1.3 Toll樣受體4(TLR4)信號通路 TLR4是一種重要的炎癥調節因子,是先天免疫系統的一部分,可對病原體產生快速反應,當Toll樣受體(TLRs)激活細胞內信號響應,就會導致促炎細胞因子TNF-α等細胞毒性物質釋放,造成心肌細胞的損傷。TLR4是人體內13個TLRs中與心血管疾病聯系最為緊密的一種。TLR4被激活后,分泌啟動細胞因子并釋放蛋白酶,心肌細胞壞死或凋亡的程度更重。此時受損的心肌相應釋放高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、熱激蛋白(HSPs)和TLR4所識別的線粒體成分等幾種損傷相關分子模式(DAMPs),這些DAMPs會加重心臟的炎癥和心肌的損傷[15]。此外,HEISERMAN J P等[16]研究證明,TLR4的激活會導致NF-κB的激活,從而引發炎癥細胞因子表達的增加和凋亡級聯的激活。

1.4 Notch信號通路 Notch信號通路由Notch 1、Notch2、Notch3、Notch 4及5種配體 (Jagged-1、Jagged-2、Delta-like 1、Delta-like 3和Delta-like 4)組成。該信號通路經過3次酶切發揮生物學作用[17],首先在內質網內形成成熟的Notch受體;然后與配體結合,經過整合素金屬蛋白酶(ADAM)的作用釋放細胞外亞單位;最終由γ分泌酶催化,胞內細胞成分釋放并結合轉錄因子重組信號結合蛋白(RBP)-Jκ,募集組蛋白乙?；D移酶 (P300/CBP)和共活化物,調控下游基因發揮作用。從保護心肌方面,Notch信號通路可調控血管內皮細胞功能,抑制心肌細胞的凋亡,促進血管新生[18]。從炎性反應方面,該通路又可抑制心肌細胞中的炎癥因子如IL-1、IL-6、炎性細胞及巨噬細胞等表達,從而減輕炎性反應,降低心肌細胞損傷程度[18]。

1.5 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路 MAPK包括p38 MAPK(p38 protein,P38)、細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)和氨基末端激酶(JNK)3種。MAPK信號通路經過三級酶促級聯反應激活后,參與細胞的分化、遷移、分裂、增殖和凋亡,調節促炎因子的產生。目前,已有大量數據表明,p38 MAPK是肥大反應的調節因子,該因子的激活可促進初始代償期的肥厚反應,當刺激持續存在時,逐漸開始失代償,肥大和凋亡信號之間的失衡導致心肌細胞的凋亡。此外p38 MAPK對于CHD血管的慢性炎性反應的發生發展也發揮重要作用,主要是通過上調內皮細胞黏附分子和血管細胞黏附蛋白、增加血管平滑肌細胞毒性來促進炎癥因子釋放,從而引發一系列炎性反應,造成心肌損傷[19]。

2 通路間的聯系

CHD發病機制復雜,各個信號通路均與心肌細胞的生長凋亡及炎性反應等息息相關,至今并未完全研究透徹。此外,我們發現各個通路之前也存在相互關系,并非獨立存在。各個通路之間通過相互聯系,共同作用,產生級聯反應,從而影響細胞生長凋亡過程。

在動脈粥樣硬化中,NF-κB和p38 MAPK信號通路可通過抑制PI3K/Akt信號通路下調促炎細胞因子,研究表明 PI3K/Akt又可能是p38 MAPK活化的抑制劑,通過抑制PI3K/Akt信號通路還可抑制血管細胞生成[20]。PI3K/Akt參與NF-κB信號的調控,激活PI3K/Akt信號通路,可促使Akt蛋白的表達進而誘發eNOS磷酸化,釋放內源性一氧化氮(NO)。NO具有促進細胞內皮組織再生的作用,可引發血管舒張的功能,可減輕動脈粥樣硬化的程度,減少心肌細胞的缺血壞死。同時,被活化的Akt可激活NF-κB釋放多種炎癥信號,相反Akt也受NF-κB通路的調控,兩者形成正反饋循環。另外,在TLR通路中,髓樣分化因子88(MyD88)為該通路的銜接蛋白,當該通路檢測到配體出現時,可快速與MyD88銜接蛋白相結合,募集IL-1受體相關激酶傳遞細胞信號,此時被磷酸化的受體與連接酶形成復合物,激活NF-κB抑制劑(IκB)激酶復合物、NF-κB抑制劑(IκB)蛋白和MAPK解離,最終活化NF-κB信號通路,促使炎癥因子的合成與表達,造成炎性反應[21]。武坤等[22]研究表明,NF-κB 或許是Notch1的靶點,阻斷Notch1下游通路的NF-κB可降低突變的白細胞數量,對炎癥因子的表達產生影響。

3 中醫學對CHD的認識

CHD屬中醫學“胸痹心痛”范疇,《山海經》中最早提出心痛一詞,《素問·痹論》中說“心痹者,脈不通”。本病總屬本虛標實,痰濁、瘀血、熱毒、氣滯、寒凝等病邪均可致此病。陳陽等[23]通過對CHD患者常規證型分布的研究發現,臨床最常見的是3種證型:心血瘀阻、痰阻心脈和心陰不足;通過對CHD中醫證型分布與冠狀動脈CTA相關性的研究發現,中醫各證型的CHD冠狀動脈狹窄程度有所差異,痰阻心脈證中冠狀動脈重度狹窄占比較大,氣陰兩虛證則多見輕度狹窄;各個證型的CHD冠狀動脈的病變支數也各有不同,其中心血瘀阻證和痰阻心脈證多見多支冠狀動脈病變,而氣陰兩虛證則多見單支冠狀動脈病變。心血瘀阻證和痰阻心脈證CHD患者冠狀動脈情況更嚴重,心肌細胞狀況較差,炎性反應可能更明顯。因此,針對不同證型的CHD患者,中醫可辨證論治。

4 不同證型 CHD中藥復方與細胞信號通路

4.1 心血瘀阻證 此證為CHD臨床最常見證型,歷代醫家以“瘀”為該證型的核心病理因素?！督饏T要略·臟腑經絡先后病脈證第一》中云“血脈相傳,壅塞不通……”。該證型患者臨床上表現為胸心部多疼痛劇烈,發作時痛有定處,疼痛多以刺痛、絞痛為主,更有甚者心痛徹背,背痛徹心,痛引肩背,治療上以活血化瘀為大法,選用血府逐瘀湯加減。劉紅等[24]研究血府逐瘀湯治療心肌缺血后再灌注損傷(I/R)大鼠,實驗中對磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)的蛋白表達量進行檢測,結果顯示,與I/R組大鼠比較,結果顯示,血府逐瘀湯組心肌細胞中的p-PI3K、p-Akt表達量明顯更高,且血府逐瘀湯組大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CKMB)含量減少。說明血府逐瘀湯能激活PI3K/Akt 通路,抑制心肌損傷過程中的線粒體凋亡,此觀點在王小平等[25]研究中同樣得到證實,作為該方君藥的紅花通過調控PI3K/PDK1/Akt信號通路,可下調裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、裂解凋亡蛋白酶-9(cleaved Caspase-9)及促凋亡蛋白Bax的表達,從而減少心肌細胞的凋亡。姜玉姬等[26]研究血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化含藥血清TLRs及炎癥因子的影響發現,血府逐瘀湯抗動脈粥樣硬化主要通過抑制TLR4通路的激活,使其相應的銜接蛋白MyD88的表達受到抑制,而后抑制NF-κB通路,最終減少IL-8、TNF-α、凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1(LOX-1),抗細胞間黏附的分子-1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)等因子的表達。肇夢楠等[27]的研究發現MAPK1、MAPK3是存在于血府逐瘀湯中的核心基因,在動脈粥樣硬化過程中,當MAPK1、MAPK3信號被抑制時,IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12等炎性因子的釋放均會被抑制,炎性反應減輕,內皮細胞得到保護。

4.2 痰阻心脈證 《素問·痹論》言“心痹痛者,亦有頑痰死血”,說明痰邪是導致胸痹心痛的重要原因。臨床上痰阻心脈證常表現為胸悶較重伴心痛癥狀,氣短乏力,咯吐痰涎,形體較胖,納呆便溏,口中黏膩,潮濕或陰雨天癥狀較重容易發作,苔白膩或滑,脈滑。治法通常采取豁痰泄濁之法,選用瓜蔞薤白半夏湯合滌痰湯加減治療。孫笛洋等[28]探討瓜蔞薤白半夏湯治療2型糖尿病合并急性心肌缺血大鼠的作用機制,發現瓜蔞薤白半夏湯干預后大鼠受損的心肌組織中PI3K、Akt、eNOS的蛋白表達較未干預組明顯增多,說明瓜蔞薤白半夏湯可通過清除大鼠血漿中總自由基(T-ROS),改變氧化成分水平,激活PI3K/Akt/eNOS信號通路,使大鼠受損心肌得到保護。有研究表明,瓜蔞薤白半夏湯中存在多種潛在的活化因子包括槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、柚皮素等,均對CHD動脈粥樣硬化進程有潛在作用。β-谷甾醇、黃芩素、槲皮素均可調控 NF-κB 信號通路,β-谷甾醇可降低 p-NF-κB 在 HAEC 細胞中的表達,并聯合黃芩素調控抗炎機制,減少細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等因子的基因表達[29-30];槲皮素可通過抑制 ICAM-1因子的表達達到抗炎作用,柚皮素可抑制凋亡蛋白Caspase-3、Bax作用,增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表達,從而抑制心肌細胞的凋亡保護受損的心肌細胞,對抗動脈粥樣硬化進程[31]。另外,瓜蔞薤白湯正丁醇部位可通過上調Notch通路,抑制心肌纖維化過程中轉化生長因子β1(TGF-β1)表達,從而保護心肌細胞[32]。

4.3 心陰不足證 此證臨床上主要表現為心隱痛時作,伴五心煩熱,潮熱盜汗,咽干口燥,舌紅少津,苔薄,脈細,用天王補心丹合炙甘草湯滋陰清熱,養心安神。多項研究表明,天王補心丹可調控炎癥因子。劉珊等[33]發現天王補心丹可通過抑制TLR4、MyD88的表達,抑制炎癥介質TNF-α、IL-1的釋放,降低NF-κB、Toll樣受體結構域銜接蛋白(TRIF)水平。黃曉宇等[34]發現,ERK5作為MAPK家族中的大分子蛋白,在天王補心丹的作用下發生磷酸化,通過激活MEK5/ERK5/MAPK信號級聯通路,激活下游的靶點因子KLF4,最終發揮抑制細胞凋亡,保護內皮細胞,防止炎癥發生的作用。天王補心丹還可作用于p21活化激酶4(PAK4)抗炎因子,上調其表達,聯合炙甘草湯升高P13K/Akt/mTOR磷酸化水平,從而減少炎癥因子TNF-α、IL-1β、單核細胞趨化因子1(MCP-1)的釋放,起到抗炎、抗氧化作用,保護心肌細胞。

4.4 氣滯心胸證 此證主要表現為心胸滿悶,隱痛時作,痛無定處,善太息,情志不遂時疼痛加重,伴脘腹部脹滿。中醫治療選用柴胡疏肝散加減疏肝理氣,活血通絡。蔣春建等[35]研究表明,柴胡疏肝散可調節心肌缺血大鼠MAPK通路。MAPK家族中有一種重要的活化蛋白激酶ERK1/2,該蛋白可參與細胞分化、增殖和凋亡過程。柴胡疏肝散干預大鼠心肌缺血再灌注中,通過激活該蛋白通路,參與受損心肌的修復,反之通過抑制ERK1/2加重心肌受損大鼠心肌細胞凋亡程度,心肌纖維化和炎癥程度則會擴大,導致心室重構,減少血管新生。吳若霞等[36]發現,柴胡疏肝散可能通過啟動PI3K/Akt/糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信號通路,降低心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡指數,心肌細胞缺血缺氧后,引發Akt磷酸化水平升高,其下游產物GSK-3β活性降低,炎癥因子釋放減少,進而心肌細胞得到保護。

4.5 寒凝心脈證 《金匱要略》曰“心中寒者,其人苦病心如啖蒜狀,劇者心痛徹背,背痛徹心,譬如蠱注”,這表明寒凝心脈證疼痛程度較重,臨床上多表現為痛如絞甚至心痛徹背,背痛徹心,受寒時自覺疼痛加重,伴冷汗淋漓,形寒肢冷,苔薄白,脈沉緊。通常選用枳實薤白桂枝湯合當歸四逆湯溫經散寒,活血通痹。枳實薤白桂枝湯中君藥枳實含有黃酮類成分,這類化學物質可通過抑制NF-κB和MAPK信號通路來減輕炎性反應,減少促炎因子的釋放[37]。厚樸中木脂素類物質可下調NF-κB 信號通路中p50 和 p65亞基的表達,五聚蛋白3(PTX3)的表達亦被抑制,心肌細胞受到保護,凋亡減少[38]。另外,運用此方治療CHD心肌再灌注損傷時,可通過激活PI3K/Akt/eNOS信號通路進而激活下游的蛋白激酶G(PKG),該蛋白被激活后會調節ATP 敏感性鉀通道,最終減輕再灌注心肌損傷[39]。魏慧玲等[40]研究證明,當歸四逆湯可通過激活PI3K/Akt信號通路減少炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放。同樣,在炎性反應方面,當歸四逆湯可降低TLR4、NF-κB蛋白的表達以減少TNF-α、IL-16及IL-10炎癥因子在組織中的釋放。亦可作用于PI3K/Akt通路,但具體在心肌細胞保護方面,暫時缺乏相關研究。

4.6 心氣虧虛證 此證主要見于老年或久病患者,臨床主要表現為心胸部隱痛陣作,胸悶心悸氣短,動則尤甚,自覺少氣懶言,乏力倦怠,面色白,汗出不固,治療用保元湯加減補養心氣。保元湯中人參、黃芪、甘草等含有諸多化學成分,與各信號通路間關系密切,包括黃酮類、皂苷類、槲皮素類、木脂素類等化學物質。黃酮類化合物中的甘草苷可通過調節MMP-9、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原水平,使MAPK和NF-κB信號通路表達被抑制,減少心肌細胞凋亡,預防心肌纖維化,同時甘草苷還可減少心肌細胞毒性釋放,穩定細胞內鈣穩態,調節鈣循環,增強其適應性來維持心肌正常生理功能[41]。黃酮類化合物中的毛蕊異黃素可調節PI3K/Akt信號通路,通過增加H9c2細胞的活性,抑制細胞內氧化和凋亡來減少心臟毒性,保護心肌細胞。皂苷類化學成分中的黃芪甲苷可激活PI3K/Akt/mTOR信號通路,通過抑制細胞氧化,促進新生細胞,減輕心肌再灌注損傷;還可下調NF-κB/NRFP3的表達,同時上調PI3K/Akt通路的表達,保護神經元,抑制氧化應激反應,下調Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達,上調抗凋亡蛋白 Bcl-2、p62表達以保護心肌細胞[42-43]。槲皮素類可抑制 p38α/MAPK信號通路來延緩心肌纖維化。在炎性反應方面,黃芪甲苷可活化T淋巴細胞和CD45磷酸酶,抑制NF-κB 通路和促炎因子的釋放[44]。DU Z Y等[45]研究表明,保元湯可減少p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化,抑制ROS產生,下調NF-κB表達,減少TNF-α和 IL-6促炎因子的釋放,改善心肌受損情況和心肌肥厚狀態。

4.7 心腎陽虛證 此證臨床上主要表現為胸悶心痛,心中悸動不安,氣喘氣促,動則尤甚,神情倦怠,畏寒肢冷,四肢欠溫伴肢體腫脹,治療用參附湯合桂枝甘草湯加減補益陽氣,振奮心陽。參附湯中的黃酮類化合物山奈酚可通過調節NF-κB,抑制血管緊張素Ⅱ刺激的心肌細胞的炎性反應和氧化。參附湯中的谷甾醇可下調人主動脈內皮細胞中的VCAM-1的表達,該因子由TNF-α刺激產生,而后抑制NF-κB、p65 磷酸化,達到保護心肌內皮細胞、緩解CHD的作用[46]。桂枝甘草湯中桂枝和甘草配伍可減少EKR1/2的表達,達到抗缺血性心律失常目的[47]。

5 結語

中藥復方在臨床上治療CHD應用較為廣泛,中藥復方通過激活或抑制相關細胞通路的表達或傳導,來達到減少促炎因子釋放,抑制炎性反應發生和心肌細胞凋亡,或促進心肌細胞新生,來達到保護心肌內皮細胞、修復受損心肌進而治療CHD的目的。

在各種疾病中,細胞間的信號分子傳遞作用是疾病發生發展的基本規律,通過多重細胞信號的級聯反應,達成信號應答鏈,對于接受的信號,不斷傳遞或放大效應,引發機體的病理生理反應。

本文對中藥復方治療CHD的關鍵信號通路作用機制進行總結論述,進一步闡明中藥復方在分子水平治療CHD的作用機制。雖目前已有大量關于中藥復方或單味中藥治療CHD信號通路的機制研究,但仍存在一些問題:研究的通路有集中性,缺乏全面性,主要針對PI3K/Akt/eNOS、NF-κB、MAPK等通路上,而Notch、TLR4通路等研究較缺乏[48-49]。所研究的證型及中藥復方同樣具有集中性,對于心血瘀阻證、痰阻心脈證研究較多,而對心腎陽虛證等則相關研究較少,臨床常見老年CHD患者心腎陽虛證,十分具有臨床研究價值。CHD的發病機制目前尚未完全明確,且中藥復方涉及的信號通路多是多個信號通路共同作用的結果,但目前研究多針對單一通路[50-51]。因此,針對以上問題,今后還需繼續完善研究,以更全面地指導CHD的臨床治療。