紅藍光調控茉莉開花的轉錄組分析

陳笛，郭永春，陳雪津，王鵬杰，陳桂信，葉乃興

福建農林大學 園藝學院 茶學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002

茉莉花 (Jasminum sambac(L.)Ait.)，屬木樨科 (Oleaceae) 素馨屬的多年生常綠灌木，是一種天然的香料及觀賞植物，其根、莖、葉、花均具有藥用功能，在亞熱帶地區廣泛栽培，我國江蘇省、浙江省、福建省、廣東省等地有較多栽培[1]。光對植物的生長發育及形態建成是一個重要的環境因素，而光質作為重要的光環境因素，近年來受到人們日益密切的關注，有研究表明光質可調控植物開花，其中紅光 (600–660 nm) 可誘導長日照植物開花，抑制短日植物開花，而藍光與其具有相反的作用[2]。Lin等[3]的研究發現，紅光和藍光影響植物開花主要是通過調控PHY和CRY基因的表達，其中紅光影響PHY基因的表達進而抑制開花，而藍光調控CRY基因的表達來促進開花。目前，光質對植物的研究主要用于培育部分花卉，如郁金香[4]、菊花[5]等，且多是對生理生化指標的測試，如光質對葉綠素含量、氧化酶活性、可溶性糖含量及生長速率等的調控[6]，鮮有從轉錄水平進行深入研究。

隨著組學技術的快速發展及其在揭示細胞生理活動規律和代謝機理的研究中廣泛應用，轉錄組測序技術能全面快速地獲取研究對象在某一狀態下基因轉錄信息，從中挖掘重要功能基因，揭示不同生物學性狀的分子機制，且相對于傳統的芯片雜交平臺，轉錄組測序可提供更精確的數字化信號，更高的檢測通量及更廣泛的檢測范圍[7]，尤其適用于還未有基因組信息的物種。目前，轉錄組測序技術已被廣泛應用于茶樹[8]、芒[9]、慈竹筍[10]等植物的研究中。

目前，關于茉莉花方面的研究主要集中在香氣成分及相關合成基因的研究[11-13]，而通過光質調控茉莉開花的研究尚未見報道。本研究選取雙瓣茉莉花，運用Illumina Hiseq/Miseq 2000高通量測序技術，探究了以LED為光源的紅光和藍光對茉莉開花時間調控的影響，利用測序得到的大量Unigene進行比較分析不同光質處理后茉莉花的轉錄差異，篩選出開花調控相關的差異表達基因，研究旨在初步揭示光質調控茉莉開花的分子機制，并為茉莉開花時間的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試材與取樣

以長勢一致且已過花期的3年生茉莉盆栽植株 (盆15 cm×20 cm，株高25 cm) 為試驗材料，并置于晝溫 (32±2)℃、夜溫 (22±2)℃及相對濕度(75±5)%的植物培養箱中培養。本試驗的對照組(CK) 為白色LED燈，處理組為純紅光 (Red) 和純藍光 (Blue)，波長分別為660 nm和460 nm，光照強度均為18 μmol/(m2·s)，光照周期為12 h/d，每個處理3個重復 (1盆為一個處理，每盆10株左右)。在處理過程中，觀察茉莉開花情況，以現蕾時間 (處理后第7天) 最早的一組作為取樣時間點，對3組分別取頂芽部位作為樣品，液氮速凍后?80 ℃保存，用于后期轉錄組測序分析。

1.2 茉莉開花數量統計

觀察并記錄茉莉花經不同光質處理后茉莉花的始花期 (第一朵花蕾出現) 和花蕾數量，以及終花期 (整株花蕾不再增加) 及花蕾數量，并通過SPSS軟件在P<0.05顯著水平下采用LSD方法進行方差分析。

1.3 文庫構建及轉錄組測序

參照Plant RNA Purification Reagent試劑盒(美國Invitrogen公司) 中方法提取樣品總RNA，用于后續cDNA文庫的構建和轉錄組測序；提取的RNA利用Nanodrop2000進行濃度和純度(OD260/OD280比值) 的檢測，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，最后用Agilent 2 100測定其RIN值。

cDNA 文庫的構建和轉錄組測序均委托上海元莘生物醫藥科技有限公司完成。利用帶有Oligo (dT) 的磁珠從總RNA中分離出mRNA，用片段化緩沖液將其完全隨機斷裂成 200 bp 左右的片段序列；隨后以此為模板，進行反轉錄實驗，合成一鏈cDNA，隨后進行二鏈合成，形成穩定的雙鏈結構；加入End Repair Mix 將結構為粘性末端的雙鏈cDNA補成平末端，隨后在3′末端加上一個A堿基，用于連接Y字形的接頭；最后采用TruseqTMRNA sample prep Kit試劑盒(美國Illumina公司) 進行PCR擴增富集得到 cDNA文庫，并用Certified Low Range Ultra Agarose 試劑盒 (美國BIO-RAD伯樂) 回收目的條帶；文庫建成后，采用TBS380 Picogreen (美國Invitrogen 公司)進行定量，按數據比例混合參照cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒(美國Illumina公司)進行橋式PCR擴增生成clusters，最后進行Illumina Hiseq/Miseq測序。

1.4 測序數據分析

將Illumina測序得到的原始圖像數據經過Base Calling轉化為序列數據 (原始數據)，對原始數據進行質量控制，利用在線軟件SeqPrep和Sickle進行數據過濾：將獲得的讀長(Reads)中接頭序列剔除，以及5′端含有非AGCT的堿基和N比例達到10%的reads，測序質量值低于Q20的reads末端需要被修剪，去除長度小于25 bp的小片段，最終得到高質量的測序數據 (Clean data)。使用Trinity (http://trinityrnaseq.sourceforge.net/) 對所有clean data進行從頭組裝獲得單一序列的轉錄本 (Transcript) 或基因簇 (Unigene)，隨后通過Blastx比對工具將這些單基因簇Unigene與蛋白質直系同源簇數據庫 (COG)、基因本體數據庫(GO)、京都基因和基因組百科全書 (KEGG)、蛋白質序列數據庫 (Swiss-Prot) 以及NCBI非冗余蛋白庫 (NR) 等蛋白數據庫比對 (E值≤1e-5)并進行功能注釋，并基于負二項分布模型使用edgeR (http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html) 進行差異表達分析[14-15]，以差異倍數log2|FC| ≥1且P-value<0.01為篩選標準，對差異表達基因的功能、類別、代謝通路富集情況等進行注釋。

1.5 實時熒光定量PCR驗證

篩選出受光質影響的代謝通路差異表達基因序列設計熒光定量PCR引物 (表1)，以同期茉莉花不同光質處理的葉片cDNA為模板，Actin為內參，按照Transstart?Tip Green qPCR superMix試劑盒 (北京全式金生物技術有限公司) 的操作說明進行 RT-qPCR 反應，驗證轉錄組測序的可靠性，每個處理設置 3 個生物學重復，用2-??Ct法進行定量分析。反應體系為10 μL：1 μL茉莉花葉片cDNA，0.2 μL Forward Primer，0.2 μL Reverse Primer，5 μL Transstart?Tip Green qPCR SuperMix，補3.6 μL ddH2O至10 μL。擴增程序：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃復性30 s (第二步至第三步重復40個循環)。

2 結果與分析

2.1 LED對茉莉開花的影響

與對照組相比較，紅光處理下茉莉的始花期比對照組提前了5 d，而藍光組延遲了3 d，且紅光組相比對照組開花持續時間無顯著差異，但藍光組花期持續了9 d；茉莉植株經不同光質處理后，花蕾數量變化不同，其中紅光組的花蕾數量相較于對照組有所增加，而藍光組相較于對照組，花蕾數量減少，且各組之間花蕾數量差異顯著(表2)。

表2 不同光質對茉莉開花時間及花蕾數量的影響Table 2 The effects of different light quality on jasmine flowering

2.2 茉莉花轉錄組測序結果質量評估及Unigene功能初步分析

根據測序產生的原始序列文件，過濾掉低質量的序列后進行統計分析。通過Trinity初步從頭組裝，獲得2 883 742個轉錄本，總長度達到1 328 373 387 bp，最長序列為30 951 bp，最短序列為201 bp，平均長460.64 bp，N50長489 bp；進一步組裝得到2 452 457個單基因簇Unigene，總長度為1 011 078 933 bp，最長序列為30 951 bp，最短序列為201 bp，平均長412.27 bp，N50長425 bp。對組裝獲得的轉錄本和單基因簇長度分布進行分析，結果如表3所示，所占比例最大的是100–400 bp，分別占66.026% (1 904 022條) 和68.164% (1 671 695條)，其次為401–1 000 bp，分別占27.268% (786 349條) 和27.868% (683 448條)。長度大于4 000 bp的分別占0.168% (4 858條) 和0.058% (1 425條)。

表3 茉莉花轉錄組中轉錄本和單基因簇的序列大小Table 3 Sequence size (bp) of transcript and Unigene in jasmine transcriptome

將獲得的2 452 457條Unigene序列通過NCBI中Blastx比對，最終結果顯示 (表4)，總共1 760 723條的Unigene (71.8%) 獲得注釋信息，其中非冗余蛋白質數據庫NR比對上227 123條，蛋白質數據庫Swiss-Prot比對上237 536條，蛋白質數據庫Pfam比對上25 582條，STRING數據庫比對上254 422條，COG數據庫比對上127 517條，KOG數據庫比對上284 775條，NOG數據庫比對上155 211條，GO數據庫比對上214 933條，KEGG數據庫比對上233 624條。

表4 茉莉花轉錄組Unigene的功能注釋統計結果Table 4 Statistics of annotation results of Unigene functional annotation in jasmine transcriptome

2.3 茉莉花轉錄組差異表達基因分析

以P-Value<0.05為篩選標準，且通過NR注釋后的差異基因分析表明，CK vs Red產生的差異表達基因有894個，上調基因 (Up-regulated genes) 數量為727，下調基因 (Down-regulated genes) 數量為167個；CK vs Blue產生的差異表達基因有2 619個，上調基因 (Up-regulated genes)數量為1 072，下調基因 (Down-regulated genes)數量為1 681個；Red vs Blue產生了3 828個差異基因，其中2 541個上調基因，1 287個下調基因 (圖1)，且兩兩比較后，3組之間共有72個差異表達基因 (圖2)。

圖1 茉莉花轉錄組兩兩比較之間差異表達基因分析統計Fig.1 The pattern of significantly differential expressed genes between each group in jasmine transcriptome.

圖2 茉莉花各組樣本間差異表達基因Venn圖Fig.2 Venn diagram of significantly differential expressed genes between each group in jasmine.

2.4 茉莉花轉錄組差異表達基因的GO注釋分析

為探究不同組間的基因功能差異，對上述差異表達基因進行GO富集分析，通過FDR<0.001篩選出極顯著的GO條目。結果顯示 (圖3、圖4)，CK vs Red有635個DEGs注釋到GO數據庫的生物過程、細胞組分及分子功能3大類型，其中526個上調基因，109個下調基因，其特有的顯著性富集通路有71條，主要涉及碳固定(Carbon fixation)、光呼吸 (Photorespiration)、過氧化物酶體部分 (Peroxisomal part)、信使核糖核蛋白復合物 (Messenger ribonucleoprotein complex)、天冬氨酰酯酶活性 (Aspartyl esterase activity)、脫氧核糖核苷酸結合(Deoxyribonucleotide binding) 等過程；CK vs Blue有1 554個差異基因注釋到GO數據庫的生物過程和分子功能，其中690個上調基因，864個下調基因，其特有的顯著性富集通路有65條，主要涉及花發育的負調節 (Negative regulation of flower development)、生長素生物合成過程(Auxin biosynthetic process)、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶活性 (Cyclin-dependent protein kinase activity)、類固醇羥化酶活性 (Steroid hydroxylase activity) 等過程；Red VS Blue有2 422個差異基因注釋到GO數據庫的生物過程、細胞組分及分子功能，其中1 501個上調基因、921個下調基因，其特有的顯著性富集通路有157條，主要含有初級代謝過程 (Primary metabolic process)、細胞蛋白質代謝過程 (Cellular protein metabolic process)、蛋白質的復合物 (Protein-containing complex)、葉綠體外膜 (Chloroplast outer membrane)、光系統Ⅰ反應中心 (Photosystem Ⅰreaction center)、PSII相關的光捕獲復合物Ⅱ(PSII associated light-harvesting complexⅡ)、花青素3?-O-β-葡糖基轉移酶活性 (Anthocyanin 3?-O-beta-glucosyltransferase activity)、花色素還原酶活性 (Anthocyanidin reductase activity)。

圖3 茉莉花轉錄組中上調表達DEGs的GO二級節點注釋Fig.3 The GO annotation of up-regulated DEGs in jasmine transcriptome.

圖4 茉莉花轉錄組中下調表達DEGs的GO二級節點注釋Fig.4 The GO annotation of down regulated DEGs in jasmine transcriptome.

2.5 茉莉花轉錄組差異表達基因的KEGG富集分析

為了明確茉莉花經過不同光質處理后的差異表達代謝通路，根據上述注釋結果進行KEGG富集分析。結果顯示，CK vs Red有258個差異基因注釋到KEGG途徑166條具體分支通路，顯著富集通路24條，主要包括光合生物中的碳固定(Carbon fixation in photosynthetic organisms)、植物激素信號轉導 (Plant hormone signal transduction)、苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis) 等；CK vs Blue有606個差異基因注釋到312條具體代謝途徑，顯著富集的代謝通路有32條，主要涉及植物激素信號轉導(Plant hormone signal transduction)、次生代謝物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、單萜類生物合成(Monoterpenoid biosynthesis)、苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)等；Red VS Blue共有1 048個差異基因注釋到329條代謝通路，顯著富集的代謝通路36條，主要涉及核糖體(Ribosome)、植物激素信號轉導 (Plant hormone signal transduction)、苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、光合作用-天線蛋白質 (Photosynthesis-antenna proteins)、光合作用(Photosynthesis) 等。兩兩比較后分別排名前5的顯著KEGG富集通路見表5。

表5 茉莉花轉錄組中顯著KEGG富集通路Table 5 The significant KEGG enrichment pathway in jasmine transcriptome

2.6 光質調控茉莉花中相關通路差異表達基因分析及熒光定量q-PCR驗證

根據通路圖展現的信息進一步挑選了受光質影響較大的代謝通路，主要涉及次生代謝物生物合成 (Biosynthesis of secondary metabolites)、苯丙素生物合成 (Phenylpropanoid biosynthesis)、吲哚生物堿生物合成 (Indole alkaloid biosynthesis)、光合作用 (Photosynthesis)、植物激素信號傳導(Plant hormone signal transduction) 和植物-病原體相互作用 (Plant-pathogen interaction)，分別從紅光組和藍光組中篩選出12條差異表達基因，采用熒光定量qPCR對24個基因的表達模式進行驗證，在P<0.01水平進行顯著性檢驗。結果表明，qPCR的相對表達量結果與轉錄組的結果呈極顯著相關 (R2=0.763**，P=0.003)，表明本次轉錄組測序數據及結果可靠 (圖5)。

圖5 實時熒光定量PCR及轉錄組表達水平的相關性分析Fig.5 Correlation analysis of RT-qPCR and RNA-seq.

2.7 光質調控茉莉開花相關基因的分析

光質主要通過不同光受體感應并進行信號轉導，從而影響植物生長發育，本研究中為找到不同光質調控茉莉開花的相關差異基因，比較分析CK vs Red、CK vs Blue及Red vs Blue的轉錄組表達模式。結果顯示，從該轉錄組數據中共找到與光周期途徑相關的基因包括紅光受體基因PHY、藍光受體基因CRY1及LHY和ELF3，自主途徑相關基因FPA，春化途徑相關基因VIN、VRN、ELF4，開花整合因子AGL和SOC1，與成花誘導相關的bHLH、MYB及WRKY轉錄因子家族成員 (表6)，以及IAA、ETH、GA、CTK、ABA、SA及JA相關植物激素信號轉導基因(表7)。

表6 茉莉花轉錄組中開花調控相關基因的表達模式Table 6 The expression pattern of DEGs related to flowering regulation in jasmine transcriptome

表7 茉莉花轉錄組中植物激素信號轉導相關基因的表達模式Table 7 The expression pattern of DEGs about plant hormone signal transduction pathway in jasmine transcriptome

進一步分析表明，植物激素信號轉導相關基因數量最多，共有234個，其中ETH數量最多，占總基因33.76%，其次為IAA，占總基因32.9%，在CK vs Red、CK vs Blue及Red vs Blue中差異表達基因數量分別有28個、78個、101個；開花調控相關基因在CK vs Red中基因數量最多，其次為對照組vs藍光組，但在CK vs Red中無差異表達，CK vs Blue中僅8個基因差異表達，但下調表達基因數量多，Red vs Blue中9個基因差異表達，上調表達基因數量多；與成花整合因子相關基因SOC1和AGL各含有5個，差異表達基因下調數量多；bHLH、MYB及WRKY轉錄因子家族成員基因在CK vs Red中共找到115個，差異表達的基因有28個；在CK vs Blue中共找到107個bHLH、MYB及WRKY轉錄因子家族成員基因，差異表達的基因有25個；Red vs Blue中133個bHLH、MYB及WRKY轉錄因子家族成員基因，差異表達的基因有50個。CK vs Red、CK vs Blue及Red vs Blue差異表達基因模式如圖6所示。

圖6 茉莉花轉錄組中調控開花相關差異表達基因熱圖Fig.6 The heatmap of flowering-related differential expressed genes in jasmine transcriptome.

3 討論

轉錄組技術已在園藝植物中廣泛應用研究。劉之慧等[16]通過對草莓組培苗進行紅藍光處理，其轉錄組結果發現糖酵解/糖異生代謝通路、卟啉和葉綠素代謝通路、光合作用、植物激素信號轉導通路為主要受影響通路，其差異表達基因數量隨著藍光比率的下降而減少，且下調基因數量增多，說明藍光對草莓組培苗的生長發育影響較大。本研究發現茉莉花在不同光質下，其光合作用、植物激素信號轉導途徑及苯丙烷生物合成通路相關基因差異極顯著，在紅光處理下的差異基因數量低于藍光組，但藍光中下調基因數量居多，推測藍光對茉莉花開花有較大影響；但研究表明茉莉花在紅光下花期提前，而在藍光花期相比對照組延遲，而有研究結果表明藍光可誘導短日照植物開花，抑制長日照植物開花，而紅光的作用與之相反[17-18]。

本研究從該轉錄組中共找到14個光敏色素PHY基因，包括PHYA、PHYB、PHYC及PHYE，3個隱花色素基因CRY1，1個LHY基因，其中差異表達的基因有3個PHY基因及2個CRY1基因，均在藍光中下調表達，在紅光中上調表達，而光敏色素基因PHY基因為光周期途徑上游調控基因，隱花色素基因CRY為其下游調控基因，不同光質通過調節CRY和PHY基因的表達進而調控茉莉花開花早晚。植物開花受多種途徑調控，其通過影響植物開花時間基因FT調控下游開花整合因子，進而調控開花，SOC1和AGL為成花整合因子，屬于MADS-box基因，可被藍光誘導表達促進擬南芥開花[19]。本研究中總共鑒定到5個SOC1同源基因和5個AGL同源基因，在不同光質作用下表現出不同的表達模式，在紅光中上調表達基因數量多且高表達，而在藍光中相對較低，且5個AGL同源基因中未發現與SOC1功能相似的AGL24基因，由此說明不同的植物中調控植物開花的AGL基因可能會有所不同[15]。

植物激素信號轉導作為光質影響的主要通路之一，在植物成花誘導中也發揮著重要作用，如乙烯可促進雌花發育[20]，而GA促進雄蕊的發育，IAA可通過誘導乙烯的合成從而促進雌花發育，JA可通過不同途徑影響植株雌花的發育[21]，ABA因植物種類不同而起到促進雌花或雄花的發育[17]，CTK可促進植物開花結實[22]。本研究中紅光不僅誘導茉莉花提前開花，且增加始花期花蕾數量，通過轉錄組數據分析發現，與植物激素信號轉導相關的差異表達基因中數量最多的為ETH(33.76%)，其次為IAA(32.9%)、SA(12.39%)、GA(7.69%)、ABA(7.26%)、CTK(5.13%)，表明光質調控茉莉開花是多種植物激素協同作用，其中ETH可能起主導作用。GA途徑作為植物開花途徑中重要調控途徑之一，在紅光中高表達，而在藍光中下調表達基因較多，茉莉花花芽中檢測到的GA信號轉導相關基因，在藍光中下調表達數量居多。有研究表明紅光可通過光敏色素誘導GA合成相關酶基因的表達進而提高赤霉素含量，而在PHYA和PHYB突變體中該酶基因不表達或表達量無顯著變化[23]；PHYA 在遠紅光處理下正調節 ABA 信號，而PHYB負調控ABA的積累，因此光質可能通過不同光受體調節植物激素進而調控植物花芽分化[24]。

轉錄因子在植物生長發育各階段均可發揮作用，大部分研究表明轉錄因子在逆境脅迫中發揮重要作用，而較少研究證明其在植物開花誘導中發揮著作用[25]。bHLH家族成員光敏色素互作因子PIFs可與光信號直接作用，如PIF3可直接激活乙烯信號轉導途徑中EIN3轉錄因子[26]，PIF4可以激活植物開花時間基因FT[27]。WRKY 家族中的WRKY25通過調節開花整合因子API調控植物開花[28]，而WRKY20可能通過調控開花相關基因FT、SOC1、CO等從而提早開花[29]。本研究中篩選出bHLH、MYB及WRKY三大類轉錄因子家族基因，其中bHLH轉錄因子最多，包括PIF1、PIF3及PIF7，其次為WRKY轉錄因子，主要有WRKY40和WRKY70，MYB轉錄因子數量較少，主要有MYB2、MYB44及MYB52，在紅光中多為上調表達，而在藍光中均為下調表達，由此說明不同的植物中調控植物開花的相關轉錄因子可能會有所不同。本研究通過不同光質作用于茉莉花，經轉錄組測序數據分析，推測光質調控茉莉花開花與植物激素、轉錄因子及開花途徑相關基因的表達有關，為茉莉花開花時間的研究提供了一定的理論基礎，而光質調控茉莉花開花時間的機制還有待進一步深入研究。