基于CRISPR/Cas9 的新冠病毒雙基因檢測試紙條

沈海聰， 朱 志

（廈門大學化學化工學院，福建廈門361005）

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 （SARSCoV-2） 給全人類生命健康和公共醫療系統帶來了嚴重威脅。 迄今為止，由于缺乏針對該病毒的有效藥物和疫苗，快速、大規模的感染者鑒定對病毒的擴散控制有著重要意義。 SARS-CoV-2 的檢測方法主要分為3 類： 胸部計算機斷層掃描（CT），血清學檢查和核酸檢查。胸部CT 能夠檢測到患者的肺部病變，但它不能準確識別輕度肺部病變或無癥狀的患者，特異性不夠。 血清學檢測主要檢測患者血清中的抗體，但受限于檢測窗口期。 相比之下，即便在感染的初期，患者鼻咽拭子中的病毒滴度也比較高， 因此直接對病毒進行RNA 檢測是比較推薦的[1]。 反轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）被認為是SARS-CoV-2 核酸檢測的金標準。 然而，RT-qPCR 方法需要專用且昂貴的設備， 專業的操作以及較長的樣品檢測時間，不利于資源匱乏地區、學校、診所和家庭的使用。 作為RT-qPCR 方法的有效補充，基于核酸恒溫擴增的技術和CRISPR 技術的側向層析試紙條可滿足快速檢測的需求[2]。 當前的研究大都只是針對單一的靶基因，這對臨床的診斷是不夠準確的。 最近，華南師范大學生命科學學院周小明教授課題組聯合湖北省疾病預防控制中心，將Cas9/sgRNA 系統整合到已建立的生物傳感平臺中，通過膠體金試紙條對新冠病毒的E 和Orf1ab基因片段進行聯合檢測，以期獲得更加可靠的檢測結果[3]， 這一研究成果近期發表在Angew．Chem．Int．Ed．雜志上。

為了實現雙基因檢測的目標，他們首先設計了包括兩條測試線（T 1 和T 2）和一條質控線（C）的膠體金試紙條（圖a）。 隨后，利用多重RT-RPA恒溫核酸擴增技術，對目標基因E 和Orf1ab 進行擴增使其DNA 雙鏈產物分別帶上生物素和地高辛標記物（圖b）。 同時利用基因特異性的Cas9/sgRNA1 和Cas9/sgRNA2 復合物對相應的DNA雙鏈產物進行識別和結合。 在試紙條分析中，將以上復合物加到試紙條樣品墊上，液體流經金標墊時， 預固定的AuNP-DNA 探針通過核酸雜交與Cas9/sgRNA 上的環形支架序列結合， 使得DNA 雙鏈產物間接帶上納米金信號；接著，復合物依次流過T1（固定有鏈霉親和素）和T2（固定有抗地高辛抗體）， 帶有生物素或地高辛標記物的復合物分別被捕獲； 多余的AuNP-DNA 探針則被C 線捕獲。 最后，通過肉眼識別即可得到相應的檢測結果（圖c）。 這種新開發的雙靶標核酸檢測試紙條可提供4 個潛在的測試結果：①僅C線可見，表示測試結果為陰性；②③T1 線和C 線（或T2 線和C 線）可見，表示只有單個基因被發現，暗示有可疑感染；④T1 線、T2 線和C 線均可見， 確認SARS-CoV-2 感染。 在單個反應中（25 μL），該技術可檢測出100 個RNA 拷貝。 在臨床64 例樣本的檢測中， 該方法具有100%的陰性預測值和97．14%的陽性預測值。 綜上，該平臺具有為資源貧乏地區提供更加準確便捷的SARSCoV-2 或其他傳染病診斷的潛力。