空氣中顆粒物對耐藥基因接合轉移的影響

王麗芳， 孫紅衛， 董輝偉， 陳鄭珊， 譚 蓉， 程春燕， 楊 棟*， 李君文*

(濱州醫學院公共衛生與管理學院， 山東煙臺 264000)

顆粒物又稱粉塵，是空氣污染物的主要成分，顆粒物根據空氣動力學直徑分為粗顆粒物(空氣動力學直徑≤10 μm，PM10)，細顆粒物(空氣動力學直徑≤2.5 μm，PM2.5)和超細顆粒物(空氣動力學直徑≤0.1 μm，PM0.1)〔1-2〕。三者統稱為可吸入顆粒物，根據空氣動力學直徑的大小決定其在呼吸系統沉積部位，PM10主要沉積在上呼吸道〔3〕，PM2.5和PM0.1可到達肺部,進而影響人體的健康。流行病學研究表明，顆粒物不僅影響呼吸系統和心血管系統、而且還可以通過影響體內的物質代謝進而影響肝臟、腎臟以及腸道菌群〔4〕?？諝庵蓄w粒物成分復雜多樣，主要包括有機碳(OC)、碳單質(EC)、金屬元素、水溶性無機離子、細菌、內毒素、抗生素耐藥基因(ARGs)等〔5-9〕。而不同時間、不同區域顆粒物的成分也存在差異，而其成分影響其毒性結果〔10-11〕。 細菌主要通過自身基因突變和水平轉移的方式獲得耐藥性，細菌自發突變率低，且不穩定，而后者是細菌獲得耐藥性的主要方式。細菌間發生基因水平轉移主要有3種方式：接合、轉化和轉導。接合轉移是環境中耐藥基因水平轉移最常見、最有效的方式，對細菌耐藥性的獲得具有重要作用〔12〕。土壤和水環境中已經發現多種耐藥基因甚至多重耐藥基因〔13-16〕，隨著人們對顆粒物成分研究的不斷加深，空氣中耐藥基因的擴散和傳播引起人們的關注。本研究主要探討空氣中不同粒徑顆粒物對耐藥基因接合轉移的影響。從而制定有效的環境保護措施，進而減少耐藥基因的擴散和傳播。

1 材料和方法

1.1 菌株和試劑

1.1.1菌種 供體菌為帶有RP4質粒的大腸埃希菌E.coli MG1655，具有卡那霉素(Km)、氨芐青霉素(Amp)以及四環素(Tc)三重抗性。受體菌為具有美羅培南(Mem)抗性的肺炎克雷伯菌。菌株為本實驗室保存。

1.1.2抗生素 Tc溶液(購置上海生工生物工程有限公司)，濃度50 mg/mL，用0.22 μm濾膜過濾后，-20 ℃保存 ，備用。Mem購置北京索萊寶科技有限公司，用滅菌水配置成濃度為5 mg/mL溶液，用0.22 μm濾膜過濾后，-20 ℃保存 ，備用。

1.1.3顆粒物 PM0.1用納米二氧化硅替代，購置Sigma公司。PM2.5、PM10購置美國Protein Technologies Inc(PTI)。SRM 1648a Urban Particulate Matter(1648a)：美國城市顆粒物標準品，購置東莞市景源實驗科技有限公司。

1.1.4培養基 LB液體培養基：稱取10 gNaCL、10 g胰蛋白胨和5 g酵母粉(購置美國BD公司)，溶于1 L蒸餾水中，充分搖晃，混合均勻后，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后保存于4 ℃冰箱待用。LB瓊脂培養基：主要成分與LB液體培養基成分相同，在LB液體培養基溶解后再加入15 g瓊脂粉(購置上海生工生物工程有限公司)，121 ℃，20 min高壓滅菌后冷卻備用。使用前加熱煮沸，待冷卻至50 ℃左右加入抗生素搖勻使用。

1.1.5試劑和儀器 0.9%的生理鹽水：稱取氯化鈉9 g(購置天津市匯杭化工科技有限公司)溶于1 L蒸餾水中，121 ℃，20 min高壓滅菌后冷卻備用?；钚匝?ROS)測定試劑盒購置南京建成生物工程研究所。

1.2 接合實驗將大腸埃希菌(RP4)接種于含有40 μg/mL Tc的LB培養基中，肺炎克雷伯接種于含有2 μg/mL Mem的LB培養基，在37 ℃，150 rpm，搖床過夜培養16小時后，6000 rpm/5 min離心。用生理鹽水清洗重懸2次，測OD600值，調整菌液濃度。取等量的供體菌和受體菌，各4.75 mL,進行后續實驗。

1.2.1不同濃度顆粒物對耐藥基因接合轉移的影響 (1)不同濃度的PM0.1對耐藥基因接合轉移的影響。取9.5 mL初始濃度為108 CFU/mL供體菌和受體菌混合液5份，向其中4份分別加入0.5 mL濃度分別為1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL的PM0.1(納米二氧化硅)儲備液，使其終濃度分別達到62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL，向剩余的1份中加入0.5 mL生理鹽水作為空白對照。將所有的接合菌液混勻后，迅速置于37 ℃恒溫培養箱中進行接合，每2個小時混勻1次，接合8 h后取出進行接合子篩選。(2)不同濃度的PM2.5、PM10和1648a對耐藥基因接合轉移的影響。PM2.5、PM10和1648a實驗條件和PM0.1保持一致。

1.3 接合子的篩選和鑒定把接合體系稀釋到一定濃度，用含有60 μg/mL的Tc和6 μg/mL的Mem LB固體培養基傾注平板篩選接合子。用6 μg/mL的Mem LB固體培養基傾注平板篩選受體菌。平板至于37 ℃培養箱36小時。計算接合子和受體菌的數量。為檢驗選擇平板篩選的耐藥細菌均為接合子，排除E.coli MG1655(RP4)或肺炎克雷伯菌自發突變子的干擾，本實驗在設立上述組別的同時還分別設立E.coli MG1655(RP4)對照組和肺炎克雷伯菌對照組，各對照組分別加入上述濃度的顆粒物處理,篩選方法與實驗組相同。在雙抗篩選出的平板上，隨意挑單克隆在含有60 μg/mL的Tc和6 μg/mL的Mem LB進行培養，觀察細菌的生長情況。

1.4 接合頻率的計算接合轉移率計算公式如下：F=No.t/No.m；F.接合轉移頻率，No. t.接合子數量(cfu/mL)，No.m.受體菌數量(cfu/mL)。

1.5 顆粒物對細胞內ROS水平的影響使用DCFH-DA探針，按照制造商說明書測定細胞內ROS水平。使用酶標儀檢測激發波長500，發射波長525處的ROS水平。并通過實驗組和對照組的熒光強度比值進行評價。

2 結果

2.1PM0.1、PM2.5、PM10對耐藥基因接合轉移的影響對照組接合轉移率為2.48×10-5，隨著PM0.1、PM2.5、PM10、1648a濃度的增加，耐藥基因的接合轉移率先增加后下降。濃度為62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL時，PM0.1、PM2.5、PM10、1648a對耐藥基因接合轉移表現出促進作用，其中PM0.1組接合轉移率2.85×10-5～1.94×10-4;2.38×10-5～1×10-4;1.43×10-5～4.64×10-4。PM2.5組接合轉移率2.03×10-5～2.04×10-4;2.37×10-5～2.59×10-4;1.34×10-5～2.34×10-4。PM10組接合轉移率3.19×10-5～3.07×10-4;3.59×10-5～2.77×10-4;4.4×10-5～3.12×10-4。1648a組接合轉移率2.14×10-5～3×10-4;5.8×10-5～4.9×10-4;6.7×10-5～4.85×10-4。當濃度為500 μg/mL，四者對耐藥基因的接合轉移都表現出抑制作用，但都無統計學差異。這一結果表明顆粒物對耐藥基因接合轉移的作用與顆粒物濃度和空氣動力學直徑有關。見圖1。

圖1 不同濃度不同顆粒物對耐藥基因接合轉移的影響(*P<0.05)

2.2 活性氧含量顆粒物干預后，供體菌細胞內ROS明顯升高，且與對照組存在統計學差異(P<0.05)。受體菌細胞內ROS變化不明顯，有時甚至下降。除了PM10,125 μg/mL，其他組都與對照組存在差異(P<0.05)。見圖2-5。

圖2 PM2.5對細胞內ROS的影響(*P<0.05)

圖3 PM10對細胞內ROS的影響(*P<0.05)

圖4 1648a對細胞內ROS的影響(*P<0.05)

圖5 納米二氧化硅對細胞內ROS的影響(*P<0.05)

3 討論

ARGs被認為是存在于水、土壤和空氣環境中新型持續性污染物〔13-16〕。2020年CHINET中國細菌耐藥監測臨床分離菌種排名前五位分離株分別是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金葡菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌，呼吸道標本中前5位占據其中4個，據報道，顆粒物可以載帶細菌或ARGs〔17, 18〕,而且顆粒物主要通過呼吸進入體內，進而影響人體健康，可見顆粒物對耐藥基因轉移和擴散研究具有重要意義。在我國，生活在監測空氣污染的城市地區的80%以上的人所接觸的空氣質量水平超過了世界衛生組織(WHO)的限值，而且顆粒物的長期暴露可使全球的預期期望壽命減少3年〔19〕。土壤和水中耐藥基因的擴散傳播研究已相當成熟，但大氣中不同粒徑顆粒物對耐藥基因傳播的影響還不太明確。故需要建立模型驗證不同粒徑顆粒物對耐藥基因水平轉移的影響。

在本研究中隨著顆粒物濃度的增加，顆粒物對耐藥基因接合轉移的促進作用先增強后減弱。PM0.1的最佳促進濃度為62.5 μg/mL，約為空白對照組的4.1倍。PM2.5和PM10、1468a最佳促進濃度均為125 μg/mL，PM2.5約為空白對照組的3.9倍，PM10約為空白對照組的4.7倍。1648a約為空白對照組的8.5倍?？梢婎w粒物的空氣動力學直徑不同，對耐藥基因接合轉移的影響效果不盡相同。而顆粒物的作用效果隨濃度的增加，有峰值的出現，可能原因是顆粒物在促進耐藥基因接合轉移的過程中，能夠使細胞產生嚴重的氧化應激反應，產生ROS和SOS。有研究表明SOS和中等濃度的ROS可以增加細胞膜的通透性，削弱細胞膜屏障，增加遺傳物質的轉移，進而促進耐藥基因的接合轉移〔8〕。而顆粒物的濃度為500 μg/mL對耐藥基因的接合轉移表現出抑制作用，可能是高劑量的顆粒物對細菌有殺傷作用，導致細菌死亡〔20〕。有文獻報道，隨著初始菌量的減少，耐藥菌之間的接合轉移率呈現下降趨勢〔21〕。而且大量顆粒物存在時，會粘附在細菌表面，減少細菌之間物理接觸機會，從而減少耐藥基因的接合轉移。顆粒物還可以促進接合轉移相關基因trbBp和trfAp的表達，從而增強耐藥基因的接合轉移〔8〕。

總的來說，空氣污染已經成為全球性的公共衛生問題，特別是在中國的很多城市，冬季空氣質量狀況嚴重超過WHO空氣質量限值，空氣中顆粒物有可能促進空氣中耐藥基因的水平轉移，引起耐藥菌的增加和遠程擴散，加重抗生素的負擔。所以，控制環境中顆粒物濃度至關重要。本研究結果可以對將來修訂空氣中顆粒物限值提供參考依據,而且對控制空氣中耐藥基因的傳播具有指導意義。