6 種新型CpG 分子增強新型冠狀病毒重組亞單位疫苗的免疫效果比較

李思奇 高孟 安彤 張柯欣 馬培凱 沈錢通 朱赟 莊昉成 陳剛

杭州醫學院基礎醫學與法醫學院 浙江省醫學生物工程疫苗研發重點實驗室，杭州 310053

佐劑是一種非特異性免疫增強劑，在疫苗中廣泛使用[1]。 尋找安全有效的新型佐劑一直是免疫學領域的熱點之一。 CpG 分子具有巨大的潛力[2]，它是模式識別受體——Toll 樣受體9（TLR9）的激動劑[3]，其作用機制是激活TLR9 并引發下游炎癥相關基因表達，從而達到激活和加強免疫應答的效果[4]。 CpG 根據其結構不同可以分為A、B、C 三種類型[5]。 2017 年在美國上市的新型乙型肝炎疫苗由于和CpG1018聯用，對不同年齡組人群的保護效果均優于傳統疫苗[6]。 但是由于專利保護的原因，目前全球僅有個別公司可以使用CpG1018。 本研究在設計出多個新型CpG 分子的基礎上，評價其對重組亞單位疫苗的免疫增強作用，篩選出具有潛力的分子，為后續新型CpG 佐劑的開發提供依據。

材料與方法

一、儀器與試劑

SPECTRAMAX 190 酶標儀（Molecular Devices）；MCO-20AIC 二氧化碳培養箱（三洋電機株式會社廠）。

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）亞單位疫苗由浙江省醫學生物工程疫苗研發重點實驗室制備，主要成分為SARS-CoV-2 受體結合域（RBD）抗原蛋白和鋁佐劑[7]；CpG 寡核苷酸由擎科生物公司合成且經高效液相色譜（HPLC）純化；血管緊張素轉化酶2（ACE-2） 蛋白、SARS-CoV-2 RBD 蛋白以及辣根過氧化物酶（HRP）酶標的SARS-CoV-2 RBD 蛋白均購自金斯瑞公司；HRP 酶標羊抗鼠IgG1、 羊抗鼠IgG2a 抗體購自Abcam 公司； 小鼠IFN-γ 酶聯免疫斑點試驗試劑盒購自達科為公司；小鼠IL-2 酶聯免疫斑點試驗試劑盒購自Mabtech 公司,SARS-CoV-2 RBD 原型株和Delta 突變株肽刺激物由金斯瑞公司合成；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉劑購自索萊寶公司；TMB 顯色液購自北京四正柏生物科技有限公司。

4 周齡SPF 級雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心[實驗動物使用許可證號SYXK（浙）2018-0012；合格證編號：20170005044109]，SPF 環境下保持溫度20~25 ℃、 相對濕度為40%~70%。

二、實驗方法

1. CpG 寡聚脫氧核苷酸（CpG-ODN）分子設計

目前的研究發現CpG1018 只含有刺激基序AACGTT，導致其效果有限[8]。 本實驗將人鼠共源的CpG 基序TCGTT[9]加入到所有設計的CpG 序列之中， 在CpG1~CpG5 中只加入單一種類的刺激基序——TCGTT，并且都以TCGTT 作為開頭而后以2個胸腺嘧啶作為連接，以相同的序列TCGTT 作為結尾，中間序列不含腺嘌呤核苷酸，通過不同的排列組合將2~3 個TCGTT 序列插入其中。 CpG6 在引入TCGTT 序列的同時還包含有GACGTT 和AACGTT基序，所設計的CpG 長度均為19~26 bp，并采用全硫代修飾。 由于CpG-ODN 分子仍處于研發階段，此處略去CpG1~CpG6 的完整序列。

2.動物分組及免疫

將4 周齡SPF 級雌性BALB/c 小鼠分為9 組，每組5 只。 空白對照組小鼠只接種注射用水，疫苗對照組小鼠接種SARS-CoV-2 亞單位疫苗（含鋁佐劑成品），實驗組小鼠接種SARS-CoV-2 亞單位疫苗和7 種不同的CpG 佐劑， 根據加入的CpG 不同而分為CpG1~CpG6 組以及CpG1018 組。 免疫途徑均為腹腔注射，體積為0.5 mL。SARS-CoV-2 疫苗抗原蛋白劑量為50 μg/劑， 根據前期的研究結果，CpG劑量采用20 μg/劑，鋁佐劑用量為0.5 mg/劑。

免疫程序為初次免疫當天計為第0 天， 第14天加強免疫。 2 次免疫的疫苗均來自浙江省醫學生物工程疫苗研發重點實驗室。 初次免疫后7 d 小鼠眼眶采血收集血清，14 d 后免疫前采血同時進行加強免疫。 加強免疫后每周繼續采集眼眶血，收集血清，加強免疫21 d 后脫頸處死小鼠，取眼球血收集血清，取脾臟收集淋巴細胞。

3.不同亞型血清結合抗體效價檢測

取商品化SARS-CoV-2 RBD 蛋白 （濃度為1.22 mg/mL）， 稀釋1 500 倍后包被96 孔板， 用含1%牛血清白蛋白的PBS 溶液稀釋小鼠血清， 每孔100 μL 梯度倍比稀釋， 以1%牛血清白蛋白的PBS溶液作為本底，每個樣本同時設置平行復孔。 37 ℃孵育1 h 后洗版，將HRP 酶標的抗小鼠IgG1、IgG2a抗體分別稀釋5 000 倍， 加入96 孔板37 ℃孵育0.5 h，再次洗板，加入TMB 顯色液，室溫避光孵育后終止顯色， 酶標儀讀取450 nm 處的OD 值。 cutoff 值為本底孔OD 平均值的2.1 倍，且≥0.105。 選擇結合抗體水平最高的CpG 組的血清做后續免疫學檢測。

4.競爭抑制法檢測結合抗體效價

將商品化的ACE-2 蛋白（濃度為0.65 mg/mL）稀釋700 倍，包被在96 孔板上。參照試劑盒說明書用稀釋液稀釋小鼠血清， 并與1 000 倍稀釋的酶標HRP的SARS-CoV-2 RBD 蛋白1∶1 充分混合均勻，37 ℃水浴鍋孵育30 min， 取出后加入到包被ACE-2 蛋白的96 孔板中，37 ℃水浴鍋孵育15 min， 洗版后加入TMB 顯色液室溫避光顯色15 min 后終止并讀數。 酶標儀讀取450 nm 處的OD 值， 用各個稀釋度下血清的抑制率表示其中和能力，計算公式為抑制率=（1-樣本讀數的平均值/陰參讀數的平均值）×100%。

5.小鼠細胞免疫水平檢測

取加強免疫后21 d 的小鼠脫頸處理，并在無菌環境下取出小鼠脾臟， 置于濾網中碾磨經過洗滌、裂解紅細胞等處理后得到小鼠脾淋巴細胞懸液，混勻后細胞計數，參照試劑說明書將細胞濃度稀釋到5×106個/mL，每孔100 μL 加入到預包被小鼠IFN-γ和IL-2 的板子上，然后加入SARS-CoV-2 RBD 肽庫作為刺激物。 酶聯免疫斑點試驗檢測參考文獻[10]的方法并參照試劑說明書進行。

三、統計學方法

采用Graphpad Prism 8.3.0 統計軟件處理分析，符合正態分布的計量資料采用±s 表示， 組間兩兩比較采用S-N-K 法進行統計學分析，P<0.05 表示差異存在統計學意義。

結 果

一、血清結合抗體水平

在初次免疫后14 d，CpG6 組小鼠血清IgG2a和IgG1 水平分別為3.63±0.27 和3.44±1.03，顯著高于CpG1018 組的2.06±1.30 和2.06±0.39。 加強免疫后除空白對照組之外，所有組別的血清IgG2a 和IgG1水平均大幅提高，且接種了CpG 佐劑組均高于疫苗對照組。 加強免疫后14 d，CpG6 組IgG2a 水平為6.52±0.21，高于CpG1018 組的6.33±0.40。 根據結合抗體的結果，選擇效果較好的CpG6 組，做后續的免疫學指標檢測。 具體結果見圖1。

圖1 不同佐劑聯用的新型冠狀病毒亞單位疫苗注射后小鼠血清IgG 結合抗體亞型水平

二、血清結合抗體抑制率

采用競爭性ELISA 法檢測血清結合抗體水平，在初次免疫14 d、加強免疫21 d 后，各組間差異均有統計學意義（F=13.66、12.58、19.38 和19.38，均P<0.001）。 初次免疫后第14 天將CpG6 組小鼠血清稀釋10 倍， 對SARS-CoV-2 原型株的抑制率為（64.67±20.41）%， 高 于CpG1018 組 的 （27.84±20.23）%，差異有統計學意義（t=2.70, P=0.031）；并且高于疫苗對照組和空白對照組，差異均有統計學意義（t=5.42, P=0.001；t=5.07, P=0.001），結果如表1所示。對加強免疫后21 d 處死的小鼠眼球血血清稀釋150 倍后發現CpG6 組和CpG1018 組的結合抗體抑制率分別為（88.21±1.47）%和（78.09±8.20）%，且CpG6 組抑制率明顯高于疫苗對照組和空白對照組， 差異均有統計學意義 （t=2.78 和39.51, 均P<0.001）。將血清稀釋1 000 倍后CpG6 組和CpG1018組對SARS-CoV-2 原型株的抑制率仍然維持在很高的水平，其中CpG6 組血清抑制率為（89.71±4.83）%，高于CpG1018 組的（70.84±17.20）%，差異有統計學意義（t=2.36, P=0.046），也高于疫苗對照組和空白對照組， 差異均有統計學意義（t=4.35, P=0.002；t=30.56, P<0.001）。 對SARS-CoV-2 Delta 突變株的抑制率上，CpG6 組為（79.04±6.32）%， 高于CpG1018組的（52.61±14.22）%，差異有統計學意義（t=3.80,P=0.005）， 并且CpG6 組抑制率明顯高于疫苗對照組和空白對照組，差異均有統計學意義（t=3.94, P=0.004；t=19.61, P<0.001）。

表1 免疫后各組小鼠在不同免疫天數的血清結合抗體抑制率（%, ±s）

表1 免疫后各組小鼠在不同免疫天數的血清結合抗體抑制率（%, ±s）

注：a：血清稀釋10 倍；b：血清稀釋150 倍；c: 稀釋1 000 倍；與CpG6 組比較，d：P<0.05，e：P<0.01

組別 只數（只） 初次免疫14 d 加強免疫21 d原型株a 原型株b 原型株c Delta 株c CpG1018 5 27.84±20.23d 78.09±8.20 70.84±17.20d 52.61±14.22e CpG6 5 64.67±20.41 88.21±1.47 89.71±4.83 79.04±6.32疫苗對照 5 8.46±1.22e 46.49±33.53e 33.18±28.66e 31.30±26.34e空白對照 4 11.82±2.71e 21.80±3.43e 9.88±2.07e 14.67±1.59e F 值 13.66 12.58 19.38 19.38 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

三、細胞免疫水平檢測結果

利用酶聯免疫斑點試驗檢測小鼠特異性細胞水平，結果如表2 所示，CpG1018、CpG6、疫苗對照和空白組細胞數差異有統計學意義 （F=14.08、14.71、17.37 和13.85， 均P<0.001）。 CpG6 組針對SARS-CoV-2 原型株敏感[（795.06±332.09）個/5×105個細胞]和Delta 突變株敏感的特異性IFN-γ 分泌T細胞[（678.53±269.60）個/5×105個細胞] 均明顯高于疫苗對照組（t=4.74，P=0.001；t=4.74，P=0.001）和空白 對 照 組 （t =3.95，P =0.008；t =3.93，P =0.008）。CpG1018 組針對SARS-CoV-2 原型株敏感和Delta突變株敏感的特異性IFN-γ 分泌細胞數分別為（947.62±300.92）個/5×105個細胞和（825.67±326.11）個/5×105個細胞，與CpG6 組相比，差異均無統計學意義（t=0.76，P=0.469；t=0.78，P=0.459）。 在特異性IL-2 分泌T 細胞數量上CpG6 組無論針對SARSCoV-2 原型株[（874.75±402.28）個/5×105個細胞]，還是針對Delta 突變株[（743.68±332.07）個/5×105個細胞]，均高于疫苗對照組（t=2.98，P=0.018；t=2.02，P=0.019） 和空白對照組 （t=4.30，P=0.004；t=4.30，P=0.004）；而CpG1018 組與CpG6 組相比，差異沒有統計學意義（t=0.70，P=0.503；t=0.90，P=0.395）。

表2 酶聯免疫斑點試驗檢測小鼠特異性細胞水平（±s）

表2 酶聯免疫斑點試驗檢測小鼠特異性細胞水平（±s）

注：a：與疫苗對照組比較，P<0.05；b：與空白對照組比較，P<0.05

組別 只數（只） 分泌IL-2 的特異性細胞（個/5×105 個細胞） 分泌IFN-γ 的特異性細胞（個/5×105 個細胞）原型株肽庫刺激 Delta 株肽庫刺激 原型株肽庫刺激 Delta 株肽庫刺激CpG1018 5 1 030.44±291.33ab 915.74±270.03ab 947.62±300.92ab 825.67±326.11ab CpG6 5 874.75±402.28ab 743.68±332.07ab 795.06±332.09ab 678.53±269.60ab疫苗對照 5 290.95±175.17 259.12±165.53 82.12±48.73 92.43±62.60空白對照 4 18.89±7.66 19.80±3.58 10.11±8.28 15.16±11.57 F 值 14.08 14.71 17.37 13.85 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

討 論

一、新型CpG 佐劑分子的設計思路

佐劑在保證及提升疫苗免疫效果中扮演了重要角色。 CpG 佐劑具有作用機制明確、不良反應小、對細胞免疫提升大等優點，目前已在一些商業化重組蛋白疫苗中獲得使用批準。

本研究在設計新型CpG1~CpG6 分子時， 參考CpG1018 加入了TCGTT 基序， 突出其免疫增強效果，并希望在后續靈長類動物體內和臨床試驗中能體現出相應的效果。 CpG 存在種屬特異性，人和鼠的TLR9 受體在氨基酸水平上只有76%的同源性[11]。由于針對不同的物種產生的效果不一致，目前上市的 疫 苗 中，CpG1018 用 量 較 大 （達 到3 mg/劑）。TCGTT 基序可以同時增強小鼠和人免疫應答水平。相對于小鼠來說，TCGTT 基序對人的免疫提升作用更佳[9]。 CpG1018 序列中不含有TCGTT 基序，因此CpG1018 雖然可以較好地激活小鼠免疫應答，但在靈長類動物體內的效果可能弱于含該序列的CpG分子。

二、CpG6 佐劑分子的特點

本實驗中，CpG6 和CpG1018 兩組對小鼠免疫增強效果都較為明顯，均高于疫苗對照組和空白對照組。本文在細胞免疫水平的評估中選擇了IL-2 和IFN-γ 這兩項指標。 IFN-γ 可以作用于多種APC，通過受體-配體相互作用， 啟動信號級聯反應， 觸發STAT1 磷酸化， 并最終激活轉錄因子T-bet 使T 細胞向Th1 類細胞分化，是反映細胞免疫水平的重要因子[12-14]。 IL-2 是T 細胞生長因子，對于T 細胞的生長增殖以及發揮效應起重要作用，是重要的細胞免疫因子[15]。 在本研究中， CpG6 誘導的細胞免疫激活水平與CpG1018 組相比無顯著性差異。 相比于CpG1018，自行設計的新型CpG，特別是CpG6 在初次免疫后的體液免疫和細胞免疫方面保護效果更顯著，能更快地激活特異性淋巴細胞產生抗體和刺激細胞免疫等相關應答。同時，加強免疫后CpG6 組的IgG2a 抗體滴度高于CpG1018 組。 以上結果表明CpG6 和CpG1018 佐劑一樣， 能引起相應的機體免疫應答。 不過在面對新發、突發傳染病，需要盡快誘導特異性高水平免疫應答時，CpG6 在初次免疫時即可表現出的良好作用， 使其效果極有可能優于CpG1018。

總體來說， 本實驗設計的新型佐劑分子CpG6在初次免疫后表現出超越CpG1018 的良好效果,在加強免疫后誘導的體液免疫強于CpG1018，細胞免疫效果也不弱于CpG1018。 有待對其免疫增強的機制做進一步研究， 并且探究CpG6 對于其他類型的疫苗（如治療性疫苗）是否也具有顯著的免疫效果提升作用。 本研究存在一定的局限性：（1）實驗中所用到的疫苗為原核表達，其抗原分子與目前主流的真核疫苗有一定區別；（2） 研究所用到的CpG 分子的計量單位為質量而不是摩爾數，可能由于CpG 分子量的不同而加入不同摩爾數的CpG 分子；（3）實驗中使用的重組亞單位疫苗劑量為50 μg/劑，高于已上市的重組亞單位疫苗，后續研究中，將對其劑量探究。 在保證免疫效果的情況下，降低CpG 自身及抗原蛋白的用量， 并針對鋁佐劑做一定的優化，這對于降低疫苗不良反應、提升安全性具有重要的現實意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明李思奇：醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據、分析/解釋數據、起草文章、統計分析；高孟：醞釀和設計實驗、分析/解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費、技術和材料支持、指導；安彤、張柯欣：實施研究、采集數據、分析/解釋數據、統計分析；馬培凱：采集數據、分析/解釋數據、統計分析；沈錢通：實施研究、采集數據、分析/解釋數據；朱贊：分析/解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱、技術和材料支持；莊昉成：對文章的知識性內容作批評性審閱、技術和材料支持、指導；陳剛：醞釀和設計實驗、分析/解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱、統計分析、獲取研究經費、技術和材料支持、指導