冷季補飼對泌乳期藏羊母羊乳汁成分與代謝產物的影響

周 力，侯生珍，桂林生*，羅增海

冷季補飼對泌乳期藏羊母羊乳汁成分與代謝產物的影響

周 力1,3，侯生珍1，桂林生1*，羅增海2*

(1. 青海大學農牧學院，西寧 810016；2. 青海省畜牧總站，西寧 810001；3 寧夏大學動物科技學院，銀川 750021)

為了使用乳品快速分析儀和液相色譜-質譜聯用（LC-MS）技術對放牧與補飼條件下藏羊母羊乳成分和代謝產物進行差異分析，選取胎次一致、體重相近（43.85 kg±7.06 kg）且發育良好的3歲齡藏羊母羊440只，隨機分成兩組，即自然放牧（control group，CG），放牧+補飼0.25 kg·d-1精料補充料（test group，TG）。試驗期為60 d（配種后150～210 d）。試驗結束時，從兩組中各收集5只母羊的乳汁分析營養成分，同時檢測其代謝產物。結果顯示：（1）與CG組相比，TG組藏羊母羊的產奶量、脂肪、蛋白質、灰分及非脂固形物含量均有所提高，其中產奶量與脂肪含量差異顯著（＜0.05）。（2）兩組共獲得已注釋顯著性差異代謝物39種，其中24種上調，15種下調；結合KEGG通路分析，發現脂肪細胞脂解調節（regulation of lipolysis in adipocyte），含血清素神經突觸（serotonergic synapse），醛固酮合成與分泌（aldosterone synthesis and secretion），FcεRI信號通路（Fc epsilon RI signaling pathway），不飽和脂肪酸生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acid），苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis）是最為顯著性關鍵代謝通路，并篩選出花生四烯酸（arachidonic acid），二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid）和D-果糖-1-磷酸（D-fructose-1-phosphate）作為差異顯著相關代謝物。綜上，通過冷季補飼提高了泌乳期藏羊母羊乳汁品質，并能改善其代謝產物，這為今后綿羊母乳的研究與開發提供一定理論依據與技術支持。

藏羊；精料補飼；代謝組；乳品質；泌乳期；脂肪酸

近年來，乳汁的營養價值逐漸走進人們的視野，已成為食品領域研究的熱點[1]。羊乳含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素以及礦物質等，已被公認其營養組成是最為接近母乳的乳產品[2]。據有關報道，羊乳中酪蛋白含量較少，易被機體消化吸收，所以更適合被嬰幼兒、老年及消化不良的人群飲用[3]。同時乳中不僅能夠提供幼畜生長發育和人們日常所需的養分，同時還能含有大量的生物活性成分。除此之外，在羊乳中還發現其他抗氧化成分，例如維生素C、維生素E以及超氧化物歧化酶等物質，能夠清除機體內的自由基，延緩其衰老[4-5]。隨著人們對羊乳營養價值的不斷重視，羊乳及其相關產品的種類也越來越多，由此可見，未來羊乳將具有十分廣闊的市場前景。

目前我國綿羊的飼養量、出欄量、肉產量、皮產量以及絨產量均居于世界前列[6]。而藏羊（）作為青藏高原特有的綿羊品種資源，對低溫、少氧以及強紫外輻射等惡劣環境具有較強的適應性，在羊產業中占有十分重要的地位[7]。但由于其所處環境無明顯的四季分界，只有冷季（10月—翌年5月）和暖季（5月—10月）之分[8]，加之冷季牧草的產量低且營養素含量也極度匱乏。因此，在寒冷季節對高原土著動物及時補飼不僅能夠滿足機體的營養需要，同時還有利于幼畜的快速生長。例如在冷季對牦牛進行“少量補飼”能夠在一定程度上緩解其體重掉膘[9]。其他試驗也進一步證實，冷季給予懷孕牦牛補飼精料可以提高犢牦牛的初生重[10]。

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等之后，又一興起的組學技術，能夠從整體和多角度闡明機體的內源性代謝變化[11]。因其具有高分辨率、高靈敏度、高通量等優點而得到廣泛應用，研究對象主要為相對分子質量＜1 000的小分子代謝物[12]。代謝物作為機體生化反應的終點，直接體現生物功能的最終效應，能夠表明機體異常的生理狀態[13]。其技術主要包括核磁共振技術（NMR）、氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）和液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）等[14]。其中LC-MS因分離能力高、靈敏度強以及選擇性好等優點已成為一種不可或缺的檢測方式[15]。

因此，本研究以高海拔地區藏母羊為試驗對象，探討放牧與補飼條件下乳汁營養物質的差異，并篩選其差異代謝物，為綿羊母乳的加工和生產提供基本理論數據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選用胎次一致、體重相近（43.85 kg±7.06 kg）及發育健康的3歲齡藏母羊440只，每組220只，即對照組（control group, CG）和試驗組（test group, TG）。對照組在青海天然牧場進行放牧，試驗組在自然放牧基礎上每天19 : 30歸牧后每只母羊補飼精料補充料0.25 kg。試驗于青海省海南州同德縣河北鄉夏知邁村進行，整個試驗期為60 d（配種后150～210 d），基礎飼糧設計參考按照《肉羊飼養標準（NY/T 816—2004）》[16]進行，其組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成和營養水平（干物質基礎）

1）預混料為每千克日糧提供：鐵 Fe 9.0 g，銅 Cu 1.8 g，錳Mn 6.0 g，鋅Zn 10.0 g，碘I 100.0 mg，硒Se 25.0 mg，鈷Co 25.0 mg。2）營養水平均為實測值。

1.2 乳樣采集

母羊出生后第760 天，每日對羔羊進行哺乳3次（07:30、12:00和18:30），完成哺乳后對所有羔羊進行體重稱量并與母羊隔離，當日泌乳量為3次測量之和，將每只母羊采集到的乳汁進行混合搖勻，用于乳品質分析以及進行非靶向代謝組學的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳汁營養成分分析 采用乳品快速分析儀MASTER（YQ1-014，保加利亞）測定藏母羊乳中脂肪、蛋白質、灰分和非脂固形物含量。

1.3.2 代謝物提取 首先吸取100 μL乳汁，加入300 μL甲醇、20 μL內標，渦旋瞬時震動后，在冰水浴條件下超聲提取5 min。在-20℃條件下靜置2 h，于4℃條件下13 000 r·min-1離心15 min，再吸取200 μL上清液于2 mL進樣瓶，進行液相色譜-質譜聯用技術分析。

1.3.3 LC-MS檢測 ① UPLC條件：樣品盤溫度為4 ℃，進樣體積：1 μL，UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）液相色譜柱對樣品化合物進行色譜分離，液相色譜A相為水相（負模式：5 mmol·L-1醋酸銨水溶液），B相均為乙腈。

②質譜條件：Q Exactive Orbitrap高分辨質譜儀，采用電噴霧電離源（ESI），負離子（-3 100 V）模式下進行一級、二級質譜數據的采集。毛細管溫度：320℃；鞘氣流速：45 Arb；輔助氣流速：15 Arb；掃描范圍：70～1 000 m·z-1；一級分辨率：70 000；二級分辨率：17 500；分步碰撞能量的強度取值：3；分步碰撞能量：20、40和60 eV；掃描速率：7 Hz。

1.4 數據處理分析

試驗數據先用Excel 2010初步整理后，檢驗法進行兩組間顯著性分析，結果以“平均數±標準差”表示，<0.05作為顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 冷季補飼對泌乳期藏羊母羊乳成分的影響

藏羊母羊乳成分的結果見表2。TG組藏羊母羊的產奶量顯著高于CG組（<0.05）；與CG組相比，TG組藏羊母羊的脂肪、蛋白質、灰分和非脂固形物分別提高了15.29%、2.65%、5.56%和2.29%，其中脂肪含量差異顯著（<0.05）。

表2 放牧與補飼下藏羊母羊乳成分差異比較

注:同列不同字母表示差異顯著（＞0.05），相同字母或無字母表示差異不顯著（＞0.05）。

圖1 放牧與補飼下藏羊母羊乳汁PCA圖

Figure 1 PCA diagram of milk of grazing and supplemented Tibetan sheep ewes

2.2 差異代謝物主成分分析（PCA）

利用主成分分析（principal components analysis, PCA）方法能夠直觀清楚地反映各處理間的差異性及相似性。由圖1所示，兩組羊藏羊母羊乳汁中第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）解釋率分別為43.10 %和18.50 %，兩者累計貢獻率可達61.60 %，由此可見，兩組間存在較為明顯的分離趨勢。

2.3 差異代謝物偏最小二乘判別分析（PLS-DA）

采用偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）對構建的模型進行驗證，兩組藏羊母羊的乳汁樣本PLS-DA得分圖如圖2(a)所示，在負離子模式下所建模型對乳汁的累積判別解釋能力R2X = 0.767，R2Y = 0.999，Q2= 0.854，這3個指標越接近于1時表示PLS-DA模型越可靠。PLS-DA置換檢驗結果如圖2(b)所示，負離子模式下R2Y=0.09，Q2=0.215。由此可以看出原模型具有意義，不存在過擬合現象。

2.4 差異代謝物篩選與分析

利用OPLS-DA的VIP值和單變量統計分析t檢驗中值來篩選兩組間藏羊母羊乳汁顯著性差異代謝物，差異顯著的閾值為：VIP≥1且<0.05。在負離子模式下共篩出N-苯乙酰甘氨酸（N-Phenylacetylglycine）、尿苷-5-二磷酸-D-半乳糖（Uridine-5-diphospho--D-galactose）、檸檬酸鹽（Citraconate）、肌醇（Myoinositol）和6-磷酸海藻糖（6-Trehalose phosphate）等已注釋39種顯著性差異代謝物，其中24種代謝物相對含量顯著上調，15種代謝物的相對含量顯著下調（見表3）。

圖2 放牧與補飼下藏羊母羊乳汁PLS-DA得分圖（a）和PLS-DA置換圖（b）

Figure 2 PLS-DA score (a) and PLS-DA replacement (b) of Tibetan sheep ewes ' milk under grazing and supplementary feeding

表3 放牧與補飼下藏羊母羊乳汁差異代謝物

圖3 放牧與補飼下藏羊母羊乳汁聚類熱圖

Figure 3 Heat map of lactation clustering of Tibetan sheep ewes under grazing and supplemental feeding

2.5 差異代謝物聚類分析

負離子模式下兩組藏羊母羊乳汁差異代謝物的聚類分析結果如圖3所示。圖中的顏色代表了乳汁代謝物在該組樣本中相對表達量的大小，顏色由藍到紅代表了代謝物豐度逐漸升高。通過層次聚類分析可以看出，與傳統放牧相比，放牧＋補飼精料對藏羊母羊乳中差異代謝物具有較為明顯的影響。

2.6 差異代謝物KEGG富集分析

圖4是負離子模式下兩組差異代謝物富集于前20條代謝通路如表示，再根據＜0.05值，篩選出最為顯著的關鍵代謝通路6條：脂肪細胞中脂肪分解的調節（regulation of lipolysis in adipocyte），含血清素的神經突觸（serotonergic synapse），醛固酮的合成和分泌（aldosterone synthesis and secretion），FcεRI信號通路（Fc epsilon RI signaling pathway），不飽和脂肪酸的生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids），苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成（phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis），參與其中代謝物分別為花生四烯酸，二十碳五烯酸和D-果糖-1-磷酸。

3 討論與結論

羊乳因其優異的營養價值而受到廣大消費者的喜愛，其營養成分主要包括糖類、脂肪、蛋白質以及礦物質等[17]。羊乳能夠提供各種營養物質，泌乳期母羊產奶量和乳成分對其胎兒生長十分重要[18]。反芻動物的泌乳性能主要受動物品種、飼糧組成、泌乳階段以及環境條件等多種因素的影響，其中飼養方式也是一個重要的方面。由于藏羊母羊泌乳期正處于寒冷季節，此時牧草供應不足、營養價值低、適口性差，無法為放牧家畜提供充足的養分，因此適宜補飼是維持泌乳時期藏羊母羊生長發育必不可少的環節。產奶量是母畜生產性能的重要指標之一，產奶量越高則說明生產性能越好。以泌乳牦牛為試驗對象[19]，結果表明其產奶量得到顯著提高。在西農薩能奶山羊亦發現[20]，精粗比4∶6組的日產奶量、乳糖含量均低于精粗比6∶4組，其中乳糖含量差異顯著。上述研究結果顯示，隨著精料比例的增加可以明顯提高反芻動物的產奶量。在本試驗中，與CG組相比，TG組的泌乳量提高顯著。這可能是由于在精料補飼下非結構性碳水化合物含量較高，小腸氨基酸模式得到優化，有效調節體內泌乳反應，繼而提高了產奶量。乳脂率是衡量奶品質的主要指標之一，乳脂率越高則表明奶品質越好[21]。王賢東等[22]研究證實，飼喂不同營養水平飼糧對妊娠后期伊犁馬初乳中脂肪無顯著影響，這與本試驗結果不一致，在本試驗中，TG組的乳脂肪含量顯著高于CG組，其原因可能是動物品種、飼料組成以及年齡差異等不同造成的。

Regulation of lipolysis in adipocyte（脂肪細胞中脂肪分解的調節），Serotonergic synapse（含血清素的神經突觸），Aldosterone synthesis and secretion（醛固酮的合成和分泌），Fc epsilon RI signaling pathway（FcεRI信號通路），Biosynthesis of unsaturated fatty acids（不飽和脂肪酸的生物合成），Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis（苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成），mTOR signaling pathway（mTOR信號通路），PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt信號通路），Phototransduction-fly（Phototransduction-fly），Oxytocin signaling pathway（催產素信號通路），Phenylalanine metabolism（苯丙氨酸代謝），Ascorbate and aldarate metabolism（抗壞血酸和醛酸代謝），Vascular smooth muscle contraction（血管平滑肌收縮），Platelet activation（血小板活化），Long-term depression（長期抑郁癥），Renin secretion（腎素分泌），Protein digestion and absorption（蛋白質消化吸收），cGMP - PKG signaling pathway（cGMP-PKG信號通路），FoxO signaling pathway（FoxO信號通路），Fc gamma R-mediated phagocytosis（FcγR介導的吞噬作用）。

Figure 4 Bubble diagram of differential metabolic pathways of lactation in Tibetan sheep ewes under grazing and supplemental feeding

代謝組學主要通過機體內代謝物的變化來揭示相關生命活動的機制[23]。已經被證實是一種有效的分析乳成分差異的方法[24]。乳汁代謝物組成不僅是機體代謝的重要表現，同時也是評估反芻動物健康、生理狀態以及乳質的重要標志物[25]。本試驗通過液相色譜-串聯質譜技術分別對放牧和補飼下藏羊母羊乳汁進行了測序，鑒定分析出已注釋39種顯著性差異代謝物，經過KEGG通路分析，最終篩選出最為顯著6條關鍵代謝通路，并映射出花生四烯酸、二十碳五烯酸和D-果糖-1-磷酸等3個為關鍵代謝產物?；ㄉ南┧醄26]是一種十分常見的多不飽和脂肪酸，在動物界廣泛存在?；ㄉ南┧峒捌浯x產物在調節動物新陳代謝、維持內環境平衡以及調控生理功能等方面都具有重要功能[27]。研究表明，二十碳五烯酸也是十分重要的多不飽和脂肪酸之一，可減少或預防血脂異常，具有調節血壓與葡萄糖代謝、減肥、抵抗炎癥以及降低抑郁癥等方面功能[28]。此外，多不飽和脂肪酸不僅能夠預防、治療人類許多疾病，同時還可對其脂類代謝具有重要的調節功能[29]。Vanleeuwen等[30]研究表明，多不飽和脂肪酸可抑制動物肌肉中脂肪酸的合成。從本試驗來看，與CG相比，TG組的乳中脂肪含量顯著提高，推測可能正是由于對照組藏母羊乳中花生四烯酸與二十碳五烯酸含量過高抑制脂肪合成所致。因此，D-果糖-1-磷酸可能參與苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑來調節氨基酸的合成。

綜上，在本試驗條件下，冷季補飼提高了泌乳期藏羊母羊乳汁營養水平，并對其代謝產物具有積極的調控作用，這為今后綿羊乳品質的營養調控提供了重要的理論依據。

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Effects of supplementary feeding in cold season on milk composition and metabolites of Tibetan sheep ewes during lactation

ZHOU Li1,3, HOU Shengzhen1, GUI Linsheng1, LUO Zenghai2

(1. College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016; 2. Qinghai General Station of Animal Husbandry, Xining 810001; 3. School of Animal Science and Technology, Ningxia University, Yinchuan 750021)

Rapid milk analyzer and Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) was used to analyze the difference of milk components and metabolites between grazing and supplementary feeding conditions in Tibetan sheep ewes. 440 healthy Tibetan sheep ewes of 3 years old, similar parity and weight (43.85 kg±7.06 kg) were randomly divided into two groups, including natural grazing group (control group, CG) and grazing+supplementary feeding 0.25 kg·d-1concentrate group (test group, TG). The experimental period was 60 days (150-210 days after breeding). At the end of the experiment, the milk of 5 ewes in each group was collected to analyze their nutritional components and detect their metabolites. The results showed that:(1) Compared with control group, the milk yield, fat, protein, ash and non fat solids of Tibetan sheep ewes in test group were increased, and the milk yield and fat content was significantly different (<0.05). (2) There were 39 significantly different metabolites annotated in the milk of Tibetan sheep ewes in the two groups, of which the relative contents of 24 metabolites were significantly increased and the relative contents of 15 metabolites were significantly decreased. Combined with KEGG functional annotation analysis, it was found that regulation of lipolysis in adipocyte, serotonergic synapse, aldosterone synthesis and secretion, FCεFc epsilon RI signaling pathway, biosynthesis of unsaturated fatty acids, biosynthesis of phenylalanine, tyrosine and tryptophan were the most significant key metabolic pathways. Finally, arachidonic acid was screened Eicosapentaenoic acid and D-fructose-1-phosphate was significantly related to the differential metabolites. In conclusion, the quality and metabolites of milk of lactation Tibetan sheep ewes were improved by supplementary feeding during cold season, which provides a theoretical basis and technical support for the research and development of milk of sheep in the future.

Tibetan sheep; concentrate supplementary feeding; metabolome; milk quality; lactation period; fatty acid

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.021

2023-06-26 16:19:58

S826.83

A

1672-352X (2023)03-0450-07

2022-06-02

青海省科技廳項目（2022NK169）和青海省昆侖英才高端創新創業人才領軍人才項目（2020年）共同資助。

周 力，博士研究生。E-mail：472737885@qq.com

通信作者:桂林生，博士，副教授。E-mail：2369830773@qq.com 羅增海，教授。E-mail：597257700@qq.com

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.s.20230625.1521.042.html