8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶在順鉑誘導的急性腎損傷中的作用和機制

張明嬌 朱杰夫 吳雄飛

順鉑是目前腫瘤治療的重要藥物之一[1],腎毒性是其主要毒副作用[2],接受順鉑治療的腫瘤住院患者中,急性腎損傷(AKI)發生率可達20%[3]。研究發現,順鉑誘導的AKI與細胞對順鉑的攝取和排泄、細胞凋亡、血管損傷、氧化和內質網應激以及炎癥有關[4]。其中炎癥反應是順鉑誘導的AKI的關鍵機制之一,但其潛在具體機制尚未完全清楚。

8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)是雙鏈DNA中切除8-氧代鳥嘌呤(8-oxoG)并啟動堿基切除修復的主要DNA糖基化酶。Th5487作為一種有效的OGG1選擇性活性位點抑制劑,可防止OGG1與其DNA底物結合[5],降低OGG1在DNA損傷區域中的募集,暴露于氧化應激的細胞中的DNA雙鏈斷裂減少,并且能夠誘導基因組8-oxoG的積累[6]。Th5487在順鉑誘導的AKI中的作用及機制鮮有報道,本研究使用Th5487探究OGG1是否能通過環鳥苷酸-腺苷酸合成酶-干擾素基因刺激因子(cGAS-STING)信號調節順鉑引起的炎癥反應,減輕腎臟損傷。

材料和方法

實驗材料

實驗細胞系 小鼠腎近端小管上皮細胞系(BUMPT細胞)最初取自Wilfred Lieberthal博士(波士頓大學醫學院),受贈于中南大學湘雅醫學院。細胞采用含10% FBS、1%青鏈霉素的高葡萄糖DMEM培養基,在37 ℃、5% CO2和95%空氣中培育。

實驗動物 選取SPF級雄性C57BL/6小鼠48只,8～10周齡,體重22～25 g。小鼠購自武漢大學口腔醫院(實驗動物合格證號:SYXK(鄂)2019-0079)。本實驗經武漢大學人民醫院動物護理和使用委員會批準[批準文號WDRM動(福)第202110707號]。

藥品與試劑 Th5487(細胞5 μmol/L[7],動物30 mg/kg,Med Chem Express,HY-125276)、順鉑(細胞20 μmol/L,動物20 mg/kg)、胎牛血清(中國四季青公司),高糖培養基(Hyclone公司)。細胞計數(CCK-8)試劑盒、線粒體膜電位檢測(JC-1)試劑盒(C2006)、活性氧(ROS)檢測試劑盒(S0033S)、CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)(S0103)均購自中國碧云天生物,8-oxoG ELISA試劑盒(江萊生物,JL45397),TRIzol試劑、轉錄試劑盒、SYBR Green混合物購自中國翌圣生物。OGG1抗體(Novus Biologicals,NB100-106)、cGAS抗體(Abcam,ab252416)、STING抗體(Immunoway,YT5488)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體(Immunoway,YT4689)、GAPDH抗體(Proteintech,60004-1-IG),MPO抗體(Abcam,ab208670)。

儀器與設備 液氮研磨儀(德國Retsch),正置顯微鏡(奧林巴斯BX53),多功能成像酶標儀(PerkinElmer),熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX Connect),化學發光凝膠成像系統(Bio-Rad)。

實驗方法

細胞模型 檢測0～80 μmol/L不同順鉑濃度干預時的細胞活力,確定順鉑干預劑量為20 μmol/L。細胞分為4組:溶劑對照組、Th5487組、順鉑組和順鉑+Th5487組分別更換含溶劑、Th5487、順鉑、順鉑+Th5487的培養基培養6 h。

動物模型 24只小鼠隨機分為4組(n=6):順鉑處理0 h組、24 h組、48 h組和72 h組。分別在處死小鼠前72 h、48 h、24 h和0 h腹腔注射順鉑溶液。另取24只小鼠隨機分為4組(n=6),分別為生理鹽水對照組、Th5487組、順鉑組、順鉑+Th5487組,處死小鼠72 h前經腹腔給予含不同試劑的溶液(生理鹽水20 mg/kg)。

標本采集 戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉后,迅速從脊柱兩側打開,觀察腎臟情況并分離,切取部分腎組織置于10%多聚甲醛固定,其余組織放入-80 ℃備用。

線粒體膜電位(MMP)測量 按照說明制備JC-1染色工作液。染料與細胞在37 ℃,5% CO2環境中孵育30 min,洗滌后加入培養基,熒光顯微鏡下觀察。當MMP高時,形成JC-1聚集體,產生紅色熒光。當MMP低時,JC-1為單體,產生綠色熒光[8]。JC-1聚集體和JC-1單體的平均熒光強度分別量化,數據報告為單體/聚集體的平均熒光強度。

ROS檢測 根據試劑盒說明書稀釋DCFH-DA到10 μmol/L,將稀釋后的DCFH-DA加入細胞培養板,37 ℃孵育20 min,洗滌后用酶標儀檢測熒光。

超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測 取適量組織樣品進行研磨,4 ℃離心,取上清作為待測樣品。根據說明配制WST-8/酶工作液和反應啟動工作液。在96孔板中依次加入待測樣品、SOD檢測緩沖液、WST-8/酶工作液,最后加入反應啟動工作液,混勻。37 ℃孵育30 min。根據450 nm處吸光度計算SOD活力。

8-oxoG含量檢測 按照ELISA試劑盒說明書處理腎臟,配制標準品,在96孔板加入樣品,37 ℃孵育2 h,棄去液體,甩干。加入檢測溶液A工作液,37 ℃孵育1 h,浸泡洗滌。加檢測溶液B工作液,37 ℃孵育1 h,洗滌。加入底物,37 ℃避光顯色25 min,終止反應,在450 nm波長處測量吸光度值,計算8-oxoG含量。

腎臟病理損傷評估 將腎組織固定在4%多聚甲醛溶液中24 h,清洗后在梯度乙醇中脫水,石蠟包埋并切成4 μm的切片。蘇木精-伊紅染料染色后在顯微鏡下觀察并拍攝。各組小鼠腎臟損傷情況評分:腎小管無損傷(0分);輕度0%～25%(1分);中度25%～50%(2分);重度50%～75%(3分);極重75%～100%(4分)[9]。

髓過氧化物酶(MPO)免疫組化染色 將石蠟切片在65℃脫蠟,100℃的檸檬酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)中抗原修復30 min。室溫下5% BSA封閉1 h后,切片與OGG1抗體(1∶100)和MPO抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜。與二抗室溫孵育1 h,加入DAB染色劑,蘇木精復染。封片后顯微鏡下觀察,使用《ImageJ》軟件量化陽性染色區域的平均吸光度。

實時定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA表達 提取腎皮質中總RNA,逆轉錄成cDNA。RT-qPCR程序設定為95 ℃預變性2 min,95 ℃變性20 s,60 ℃延伸30 s,共40個循環。用2-ΔΔCt法計算出目的基因的相對表達量。實驗獨立重復3次。引物序列如下:

OGG1 F:5′-AAACTTTTTCCGGAATCTGTGG-3′

R:5′-CTTAGATCCCTTTTTGCGCTTT-3′

cGAS F:5′-CAGGAAGGAACCGGACAAGCTAAAG-3′

R:5′-CCGACTCCCGTTTCTGCATTCTG-3′

STING F:5′-CCGAAGACTGTACATCCTCTTT-3′

R:5′-AGCATATCTCGGAATCGAATGT-3′

TNF-α F:5′-ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC-3′

R:5′-GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′

mtDNA F:5′-TTTTATCTGCATCTGAGTTTAATCCTGT-3′

R:5′-CCACTTCATCTTACCATTTATTATCGC-3′

結論:總而言之,對腸造口患者而言,其可能一生都無法像健康人一樣進行排便,因此,掌握造口自我護理技能對改善生活狀況、提高生活質量具有極為重要的意義。但由于造口護理具有繁瑣性與專業性,護理人員應主動對患者進行指導,幫助其盡快熟悉造口護理。與此同時,醫院應主動組織護理人員進行培養,提高其專業技能與知識素養,從而使得其在工作中能游刃有余地對患者進行系統而規范的指導。除此之外,護理人員還應主動為患者介紹相關社會支持機構,便于他們及時有效地獲取幫助,從而不斷提高腸造口患者的整體生活質量。

GAPDH F:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′

R:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′

Western Blot法檢測蛋白 提取總蛋白,測定蛋白濃度。用SDS-PAGE分離蛋白,5%脫脂奶粉封閉。封閉后分別與OGG1抗體(1∶1 000)、cGAS抗體(1∶1 000)、STING抗體(1∶1 000)、TNF-α抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶20 000)孵育,4 ℃過夜。室溫下與二抗溶液孵育1 h,清洗后顯影。使用ImageJ軟件對顯影的條帶進行灰度分析,并進行半定量。

統計學方法使用《GraphPad 8.0》軟件進行統計分析,數據以均數±標準差表示,方差齊時采用帶/不帶重復測量的單因素方差分析與Tukey檢驗,不滿足方差齊性時采用Friedman檢驗/Kruskal-Wallis檢驗與Dunnett-t檢驗來推斷多組間差異并進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

Th5487可減輕順鉑引起的腎臟損傷隨順鉑處理時間延長,小鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平逐漸升高(P<0.05)(圖1A)。隨著處理時間延長,光鏡下腎組織逐漸出現小管細胞脫落,管腔蛋白滲出,管型形成,腎小管擴張,小管細胞壞死,腎臟損傷不斷加重(P<0.05)(圖1B)。順鉑干預使小鼠腎臟中OGG1的mRNA水平和蛋白表達增加(P<0.05)(圖1C)。免疫組化結果也提示OGG1在順鉑干預后表達增加且在腎小球和腎小管上皮中都有分布(P<0.05)(圖1D)。Western Blot結果顯示順鉑增加了腎組織cGAS、STING及TNF-α蛋白表達(P<0.05)(圖1E)。RT-qPCR檢測各組小鼠腎皮質中基因表達,與對照組相比,cGAS、STING和TNF-α的mRNA水平在順鉑處理后有不同程度升高(P<0.05),而mtDNA的完整度變化不顯著(P>0.05)(圖1F)。

圖1 各組小鼠腎功能、HE染色、免疫組化和OGG1及炎癥因子表達

Th5487可抑制順鉑誘導的cGAS-STING信號軸單純Th5487與對照組SCr、BUN水平無明顯差別,與順鉑組相比,Th5487組抑制OGG1后小鼠SCr、BUN水平顯著下降(P<0.05)(圖2A)。光鏡下可加入Th5487后腎臟損傷有所減輕,小鼠腎臟損傷評分較順鉑組降低(P<0.05)(圖2B)。MPO免疫組化結果顯示,與對照組相比,順鉑組腎組織炎性浸潤明顯增加,Th5487減輕了炎細胞浸潤程度(圖2C)。BUMPT細胞和小鼠腎臟的Western Blot結果都顯示,單純Th5487對cGAS、STING、TNF-α的水平無影響(P>0.05)。與順鉑組比較,加入Th5487后cGAS、STING、TNF-α蛋白的表達受到抑制(P<0.05)(圖2D、E)。提示Th5487降低了BUMPT細胞和小鼠腎臟中炎癥調節因子的表達。

圖2 Th5487對順鉑介導的小鼠腎功能、炎細胞浸潤及小鼠和細胞中炎癥相關蛋白的影響

Th5487對順鉑誘導的線粒體功能和組織損傷的影響使用JC-1試劑盒檢測細胞MMP變化,順鉑干預后細胞內呈現出明顯綠色熒光(P<0.05),與順鉑組相比,加入Th5487使BUMPT細胞中紅光增強,綠光減弱,線粒體膜電位下降明顯緩解(P<0.05)(圖3A),表明順鉑使BUMPT細胞MMP發生去極化,而Th5487能減輕BUMPT細胞內MMP的去極化水平。順鉑處理后BUMPT細胞中ROS生成也顯著增加(P<0.05),Th5487抑制了順鉑誘導的細胞內ROS水平上升(P<0.05)(圖3B)。利用CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒檢測腎組織勻漿中SOD活力,與對照組相比,順鉑組SOD活力明顯受抑制,加入Th5487后,SOD抑制程度減輕(P<0.05)(圖3C)。ELISA結果顯示,與對照組相比,順鉑組的8-oxoG含量更高,加入Th5487后,8-oxoG明顯減少(P<0.05)(圖3D)。

圖3 Th5487對順鉑介導的小鼠腎近曲小管細胞中MMP、ROS和腎組織中SOD及8-oxoG的影響

討 論

有研究表明,cGAS-STING信號在順鉑處理的小鼠腎臟中激活,STING敲除或抑制劑能改善順鉑誘導的腎損傷和促炎因子的產生[17-18]。cGAS-STING信號通過增強核苷酸切除修復途徑[19]和細胞中的線粒體DNA(mtDNA)釋放[20]誘導。逃離應激線粒體的mtDNA通過激活cGAS-STING途徑引起炎癥[21]。既往研究表明,OGG1小分子抑制劑SU0268誘導mtDNA-cGAS-STING-IFN-β軸,從而減少細菌負荷并阻止疾病進展[22]。在有皮膚表現的系統性紅斑狼瘡(SLE)患者中,OGG1-/-的SLE小鼠模型表現出cGAS依賴的IFN-β表達[23]。在本實驗中,順鉑誘導AKI小鼠腎組織中cGAS-STING信號通路激活,最終損傷小鼠腎臟結構與功能。Th5487的使用減少了小鼠腎臟腎小管上皮細胞中cGAS、STING、TNF-α蛋白表達,抑制了cGAS-STING信號誘導的炎癥反應。

線粒體功能障礙和細胞內ROS積累誘導的氧化應激是順鉑誘導的AKI的標志,不受控制的線粒體損傷和ROS積累將激活隨后的細胞炎癥和細胞死亡。本研究發現,在順鉑處理后BUMPT細胞MMP去極化,ROS積累增加。Th5487使MMP去極化減弱,ROS積累減少。進一步檢測發現,Th5487能減輕順鉑引起的腎組織勻漿中SOD活力下降,緩解順鉑誘導的組織氧化損傷。Th5487還能降低組織8-oxoG含量。研究提示,OGG1可能通過促進cGAS-STING信號加重順鉑誘導的AKI中的炎癥反應,但其具體機制仍需要進一步探索。

目前,順鉑腎毒性的緩解或預防可通過短時間、低容量補液、補充鎂或甘露醇誘導強制利尿來實現[24]。然而,現有的治療常伴隨患者的過度利尿和隨后的脫水,迫切需要安全有效的靶點預防順鉑腎毒性。OGG1調節cGAS-STING信號影響順鉑誘導的AKI中的炎癥反應,這為腫瘤病人使用鉑類化合物治療時減少腎毒性帶來了另一種可能。