齊墩果酸經腸道菌群抑制去卵巢小鼠骨丟失的作用機制

馬承紅，王姜儼，蘇丹丹，謝佑紅，唐琳，周天宇，董群偉，孫平

1.廣東藥科大學附屬第一醫院內分泌科，廣東 廣州 510062；

2.廣東藥科大學附屬第一醫院信息科，廣東 廣州 510062；

3.廣東藥科大學附屬第一醫院骨科，廣東 廣州 510062；

4.廣東省云浮市中醫院，廣東 云浮 527300

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)是一種因雌激素降低導致低骨量及骨折風險顯著增加為特點的代謝性骨病[1]。已證實，腸道菌群是造成PMO骨代謝異常的重要因素。雌激素缺乏會導致腸道中有益菌群定植減少，有害菌定植增加，從而引發一系列促進骨吸收的免疫炎癥反應[2-4]?！澳I藏精、主骨、生髓”是中醫經典理論之一。補腎中藥是治療PMO的常見中藥類型，其在影響腸道菌群防治骨質疏松中發揮了重要作用[5]。齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是補腎中藥女貞子、墨旱蓮等的主要活性成分之一，具有潛在的抗炎、抗氧化作用。研究表明其對骨質疏松癥的治療起到積極作用[6-10]。本研究以去卵巢(OVX)小鼠構建PMO模型，通過觀察OA干預后OVX小鼠骨量、炎性因子及腸道菌群的變化，進一步探討OA防治OVX小鼠骨量丟失的效果及其作用機制，以期為OA防治PMO提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑 19 只SPF 級11 周齡C57BL6/J雌性小鼠購于南方醫科大學實驗動物管理中心，動物許可證號：SYXK(粵)2017-0124。置于廣東藥科大學附屬第一醫院實驗動物中心SPF級環境中進行飼養：給予小鼠普通飼料，室溫(22±2)℃，相對濕度40%～65%，12 h 光照，12 h 黑暗，保持良好通風，定時紫外線消毒，自由進水和進食。OA 試劑購于上海麥克林生化科技有限公司(CAS 號508-02-1)；二甲基亞砜由天津市大茂化學試劑廠提供(批號00001)；水合氯醛由深圳希景生物提供(批號Lot.22S04X17)；0.9%氯化鈉溶液由四川科倫藥業股份有限公司提供(批號國字準號H20083400)；ELISA檢測試劑盒購于江蘇酶免實業有限公司(批號20211123M)。

1.2 實驗動物分組及造模 所有小鼠適應性喂養7 d 后隨機分為假手術組(SHAM 組，n=6)、OVX 組(n=6)和OA 組(n=7)。10%水合氯醛以4 μL/g 麻醉OVX組和OA組小鼠，取背部正中旁側1 cm切口進入腹腔，結扎雙側輸卵管并切除雙側卵巢。SHAM 組按上述方法進行手術，保留雙側卵巢，切除卵巢旁邊同卵巢等大的脂肪組織。OA組腹腔注射OA(10 mg/kg)[8]，SHAM 組和OVX 組腹腔注射等劑量生理鹽水。隔日1次，實驗期12周。實驗結束后，無菌環境下取小鼠糞便用于16S rRNA 基因測序；小鼠眼眶血行ELISA 檢測；左側股骨行Micro-CT測定。本研究中關于動物的處置和操作均符合廣東藥科大學附屬第一醫院動物實驗倫理要求。

1.3 左側股骨Micro-CT測定 將肌肉筋膜剔除干凈的小鼠左側股骨統一方向擺入西門子Inveon Micro-CT 儀，以管電壓80 kV、管電流500 μA 為掃描參數對其進行掃描，掃描儀自帶軟件分析所獲取的圖像信息。從股骨遠端生長板遠端0.5 mm 為起點，提取其上方80 層骨組織的圖像信息，對去除皮質骨的感興趣區域(region of interest，ROI)行三維重建并分析以下指標：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨表面積骨體積比值(bone surface/bone volume，BS/BV)、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)及骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.4 ELISA測定 采用摘眼球法收集小鼠血液，4℃、6 000 r/min離心10 min分離獲得血清。小鼠血清細胞因子的含量采取ELISA測定方法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。測量指標如下：β-膠原降解產物(β-collagen degradation products，β-CTX)、1 型原膠原氨基端前肽(procollagen type 1 N-prepeptide，P1NP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b，TRACP5b)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細胞介素-10 (interleukin-10，IL-10)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。

1.5 腸道菌群16S 擴增子測序 收集小鼠糞便于無菌EP管中，-80℃條件下冷凍保存，糞菌樣本使用E.Z.N.A.?soil DNA ki (Omega Bio-tek Norcross，GA，U.S.)提取DNA，對符合條件的DNA 用PCR 儀(ABI GeneAmp?9700型)擴增16S rRNA基因中的V3-V4區域，每個樣本重復3次，最后置于4℃保存。引物為：上游引物338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')、下游引物806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。2%瓊脂糖凝膠回收同一樣本的PCR 產物混合物，并對其進行檢測和提純。純化后的PCR 產物用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit 進行建庫，Illumina 公司Miseq PE300平臺測序。

1.6 統計學方法 Micro-CT 和ELISA 數據采用R軟件分析，樣本符合正態分布和方差齊性時，組間比較采用單因素ANOVA 檢驗；否則，組間比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。腸道菌群數據于美吉生物云平臺上分析，Ace、Chao和Shannon 指數采用mothur軟件計算Alpha 多樣性；采用基于Bray-Curtis 距離矩陣算法的主坐標分析(PCoA 分析)檢驗樣本間微生物群落結構的差異性。組間微生物群落結構差異程度采用ANOSIM 非參數檢驗；Alpha 多樣性和菌群豐度的組間差異采用Wilxocon 秩和檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OA 對小鼠骨微結構及指標的影響 如圖1 所示，OVX 組骨小梁數量顯著減少，骨微結構受到破壞，OA 組骨小梁數量較OVX 組增加，骨微結構破壞減少。如圖2 所示，與SHAM 組相比，OVX組BMD、BV/TV 和Tb.N 明顯降低，Tb.Sp 明顯增高，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；BS/BV 和Tb.Th 變化不明顯，差異均無統計學意義(P＞0.05)。與OVX組相比，OA 組BMD 和BV/TV 明顯增高，Tb.Sp 明顯降低，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，Tb.N、BS/BV 和Tb.Th 變化不明顯，差異均無統計學意義(P＞0.05)。

圖1 左側股骨遠端三維重建圖Figure 1 Three-dimensional reconstruction of the left distal femur

圖2 骨微結構參數變化Figure 2 Variation in bone microstructural parameters

2.2 OA 對小鼠血清ELISA 指標的影響 如圖3所示，與SHAM 組相比，OVX 組促炎因子TNF-α、IL-6、骨吸收指標TRACP5b、β-CTX、骨形成指標P1NP 和LPS 明顯增高，抗炎因子IL-10 明顯降低，差異均具有統計學意義(P＜0.01)；與OVX組相比，OA組P1NP、TRACP5b、β-CTX、TNF-α、IL-6、和LPS明顯降低，IL-10 明顯增高，差異均具有統計學意義(P＜0.01或＜0.05)。

2.3 OA對小鼠腸道菌群的影響 由圖4A 可知，三組小鼠腸道菌群中共有的OTU為437個，其中24個為SHAM 組所特有，30 個為OVX 組所特有，10 個為OA 組所特有，OVX 組的OTU 數量最多，OA 組最少。本研究通過PCoA 分析可知，SHAM 組主要分布于右下象限，OVX組主要分布于右上象限，OA組主要分布于左下象限，且P=0.001，R 值為0.837，表明可明顯區別三組樣本(圖4B)。隨著測序深度加大，在OTU水平的Shannon指數不再增加，表明測序數據量合理，能夠反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息(圖4C)。由圖4D 可知，與SHAM 組相比，OVX 組Chao、Ace 和Shannon 指數變化不明顯，差異均無統計學意義(P＞0.05)；與OVX 組相比，OA 組Chao 和Ace 指數明顯降低，差異均具有統計學意義(P＜0.01)，Shannon 指數變化不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖4 各組腸道微生物組分析Figure 4 Analysis of the gut microbiome of each group

如圖5A 所示，腸道菌群在門水平的相對豐度排名前7 的菌群分別為擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、放線菌門(Actinobacteriota)、彎曲菌門(Campilobacterota)及變形菌門(Patescibacteria)。其中，OVX 組Actinobacteriota 豐度較SHAM 組明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.01)，OA 組Actinobacteriota 豐度較OVX 組明顯增高，差異具有統計學意義(P＜0.01)(圖5B)。腸道菌群在屬水平的相對豐度如圖6A所示。與SHAM組相比，Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002 和Enterorhabdus 豐度在OVX 組中明顯降低，Odoribacter 豐度明顯增高，差異均具有統計學意義(P＜0.01 或＜0.05)；與OVX 組相比，OA 組Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002和Enterorhabdus 豐度明顯增高，Odoribacter 豐度明顯降低，差異均具有統計學意義(P＜0.01或＜0.05)(圖6B)。

圖5 各組小鼠腸道菌群門水平上差異分析Figure 5 Difference of the gut microbiota of each group at the phylum level

圖6 各組小鼠腸道菌群屬水平差異分析Figure 6 Difference of the gut microbiota of each group at the genus level

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，腸道菌群不僅可以調節局部反應，還可以調節包括骨代謝在內的全身反應，影響宿主代謝、免疫反應和激素分泌[11]。腸道菌群紊亂會造成成骨細胞和破骨細胞之間的失衡，導致骨量減少、骨質疏松風險增加[12]。中醫藥在預防和治療PMO 中起著積極作用，OA通過抑制破骨細胞生成和刺激成骨細胞生成發揮骨保護作用[6-8]。然而目前尚無報道OA對OVX小鼠腸道菌群的影響。因此，本實驗觀察了OA干預OVX小鼠其骨量、炎性因子及腸道菌群的變化。

TRACP5b是骨吸收敏感指標，能反應破骨細胞活性[13]。β-CTX和P1NP 是目前國際公認的敏感性相對較好地反映骨吸收與骨形成的指標[14]。本研究與既往研究一致[8]，OA 可顯著增加OVX 小鼠股骨BMD 和BV/TV，顯著降低Tb.Sp 和血清TRACP5b、β-CTX 及P1NP含量，提示OA可增加OVX小鼠骨量，抑制骨吸收，促進骨形成，降低骨轉換，從而延緩骨丟失。

TNF-α可促進破骨細胞生成，間接激活骨吸收陷窩的形成，使破骨細胞骨吸收功能增強[15]。IL-6 能夠刺激破骨細胞活性，抑制成骨細胞活性，從而增加骨吸收，促進骨量流失，誘發骨質疏松[16]。IL-10 對破骨細胞生成有明顯的抑制作用[17]。LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，可促使炎性細胞因子產生，損害腸道屏障，導致腸道通透性增高[18-19]。本實驗發現，OA 能夠顯著降低OVX 小鼠血清IL-6、TNF-α和LPS水平，顯著升高IL-10水平，提示OA可降低OVX小鼠炎性反應，改善腸道通透性，發揮抗骨質疏松作用。

α多樣性指數(Chao、Ace、Shannon 指數)代表了小鼠腸道菌群整體上的組成差異，但不能代表細菌相對豐度的差異。因此，本團隊更深層次地探究了菌群在門和屬級別的差異。有研究發現，在門水平，Actinobacteriota 豐度與BMD 呈正相關[20-21]，與本實驗一致。OVX小鼠腸道菌群中Actinobacteriota豐度顯著升高，OA 干預可顯著降低Actinobacteriota 豐度。在屬水平，Odoribacter豐度與TNF-α呈顯著正相關[22]。Staphylococcus可產生具有抗菌活性的葡萄球菌素，該類物質具有潛在抗炎作用[23]。在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠潰瘍性結腸炎模型中，Coriobacteriaceae_UCG-002 豐度與血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平呈負相關，與IL-10 水平呈正相關[24]。已證實Enterorhabdus 豐度與促炎因子水平呈負相關，表明其在腸道穩態中起積極作用[25]。本實驗發現OVX 小鼠的Odoribacter豐度顯著增加，Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002 和Enterorhabdus 豐度顯著降低，表明Actinobacteriota、Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002和Enterorhabdus可能是防治骨質疏松的有益菌，而Odoribacter可能是促使骨質疏松發生的有害菌，OA干預可有效改善這種菌群結構，提示這可能是OA防治PMO的潛在作用靶點之一。

綜上所述，OA 能夠增加OVX 小鼠骨量、延緩骨丟失，其機制可能是通過改善腸道通透性、調節腸道菌群中Actinobacteriota、Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002、Enterorhabdus和Odoribacter豐度及結構、抑制炎性反應實現的。本實驗尚存在一定局限，即未驗證OA 通過炎性因子及Actinobacteriota、Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002、Enterorhabdus、Odoribacter 調控骨吸收的分子機制，需后續進一步研究證實。