水凝膠遞送堿性成纖維細胞生長因子對氧糖剝奪后NIH3T3細胞功能的影響

惠文婷, 宋潼潼, 黃 敏, 陳 霞

（1. 吉林大學基礎醫學院藥理學系，吉林 長春 130021； 2. 吉林大學基礎醫學院人體解剖學系，吉林 長春 130021）

心肌成纖維細胞被認為是心臟中細胞外基質（extracellular matrix， ECM）的主要生產者。心肌梗死后，靜止的成纖維細胞被激活，增殖、遷移并分化為病理性肌成纖維細胞表型，活化的肌成纖維細胞通過分泌ECM 蛋白形成纖維化組織且具有防止梗死心臟破裂的作用［1-2］。但ECM 蛋白在梗死區域過度沉積會導致組織僵硬并限制心臟的收縮和舒張功能［3-4］。心肌梗死后，成纖維細胞功能的高效調控成為研究的熱點。

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）家族由22 個成員組成，大部分FGF 通過自分泌或旁分泌信號在多個器官和身體發育過程中發揮作用［5-6］。在FGF 家族的成員中，堿性FGF（basic FGF，bFGF） 被認為是心肌收縮時分泌的血管生成因子，具有心臟保護作用［7］。研究［8-10］顯示：bFGF 在部分臨床試驗中對缺血性損傷有益。然而，bFGF 的半衰期較短，全身給藥的療效較差，目前主要致力于開發局部生長因子遞送系統，提高藥物療效。

生物材料可用于包封各類化合物，為保留化合物活性提供合適的微環境，在心臟再生方面顯示出巨大的潛力。生物材料具有獨特的生物活性和生物相容性，且較為穩定，這些特性使其具有應用于心臟修復和再生的可能［11］。水凝膠是一種具有三維網絡結構的聚合物生物材料，具有高結合親和力、低免疫原性、良好的生物相容性和導電性等優點，在藥物輸送領域具有非凡的潛力［12-13］?；谒z可為受傷區域提供結構支撐并可以提供控釋治療劑的特性，將bFGF 包封于水凝膠內并遞送至心肌梗死部位不僅可能改善bFGF 半衰期短和保留率低的缺點，還可能抑制心肌梗死后的過度纖維化，改善心肌不良重塑。

本課題組前期研究［14］顯示：負載bFGF 的水凝膠可以調節氧糖剝奪 （oxygen glucose deprivation，OGD）條件下DC2.4 細胞炎癥因子的表達和分泌，可能改善心肌梗死后的免疫微環境。本研究探討在OGD 條件下，使用水凝膠載藥系統將bFGF 輸送至成纖維細胞中對成纖維細胞向肌成纖維細胞分化和相關蛋白表達的影響，并闡明負載bFGF 的水凝膠對OGD 條件下成纖維細胞氧化應激反應的改善作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器小鼠胚胎成纖維NIH3T3 細胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號ZQ0096。CCK-8 試劑（B34302）購自上海Bimake 生物科技有限公司，DMEM 高糖培養基（C11995500BT） 和 DMEM 無 糖 培 養 基（11966025） 購自美國賽默飛世爾科技有限公司，重組小鼠bFGF（PRP1011）購自武漢亞科因生物技術有限公司，明膠（10010328）購自上海國藥集團化學試劑有限公司，戊二醛（20200415）購自天津福晨化學試劑有限公司，高效放射免疫沉淀測定（radioimmune precipitation assay，RIPA） 組織/快速細胞裂解液（R0010）、 乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒（BC0685）、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 含量檢測試劑盒 （BC0025） 和 超 氧 化 物 歧 化 酶 SOD（superoxide dismutase，SOD） 活性檢測試劑盒（BC1075）購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗Ⅰ型膠原蛋白抗體（AF7001）、兔抗Ⅲ型膠原蛋白抗體（AF5475）和兔抗α - 平滑肌肌動蛋白（α-skeletal muscle actin，α-SMA）抗體（AF1032）購自美國Affinity公司，小鼠抗GAPDH（HC301-01）抗體和羊抗鼠免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG） H&L/辣根過氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 抗體（HS201） 購自北京全式金生物公司，羊 抗 兔 IgG H&L/HRP 抗 體（bs-40295G-HRP）購自北京博奧森生物技術有限公司，小鼠bFGF 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA） 試劑盒（LV30045）購自上海愛萌優寧生物技術有限公司。MCO-170AICUVL-PC CO2細胞培養箱購自日本Panasonic 公司，GC-C0626GC-C03 缺氧小室購自黑龍江Maworde 公司，D3024R 臺式高速冷凍型微量離心機購自北京大龍興創實驗儀器股份公司，Tanon-4200SF 顯影儀購自上海天能科技有限公司，Multiskan FC 型酶標儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 負載bFGF 明膠水凝膠制備制備10% 和20%的明膠水凝膠，使用超純水60 ℃水浴加熱，待明膠顆粒完全溶解并攪拌均勻后，將液體迅速轉入直徑2 mm 和厚度2 mm 的圓形模具中，4 ℃冷凝。凝固后的水凝膠貼片置于常溫下用戊二醛熏蒸24 h 和48 h 后，將凝膠于－56 ℃下真空冷凍干燥24 h。按參考文獻［1］的方法，通過檢測不同濃度水凝膠的溶脹率，確定20%濃度的水凝膠具有更好的溶脹性能，故選擇該濃度進行后續實驗。將含有1×10－5、1×10－4和1×10－3g·L－1bFGF 的磷酸鹽緩沖液（phosphated buffer saline，PBS）通過0.22 μm膜過濾，并在無菌條件下注入水凝膠貼片進行藥物吸附，約24 h完成吸附。將凝膠于－56 ℃下真空冷凍干燥24 h［15］。將20%明膠水凝膠和經戊二醛熏蒸后的20%明膠水凝膠分別浸入DMEM培養基中，并于6、12 和24 h 時收集浸出液。

1.3 CCK-8 法檢測NIH3T3 細胞活性取生長狀態良好的細胞制備細胞懸液，加入96 孔細胞培養板中，每孔100 μL。待細胞貼壁后，取對數生長期的NIH3T3 細胞進行實驗。實驗分為空白組、20%明膠組和20%明膠+戊二醛組?？瞻捉M細胞更換為不含血清的DMEM 高糖培養基，20%明膠組和20%明膠+戊二醛組分別更換對應的浸出液，繼續培養24 h。結束培養前 4 h，每孔加入10%培養體積的CCK-8 溶液共孵育，采用酶標儀于波長450 nm 處檢測吸光度（A）值，以A 值代表各組細胞活性。

1.4 細胞分組和造模小鼠胚胎成纖維NIH3T3細胞系培養于含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素DMEM 高糖培養基中，置于含5% CO2和95%空氣、37 ℃培養箱中過夜培養。待細胞生長至密度約80%時，將NIH3T3 細胞分為對照組、OGD 組和OGD+不同質量 bFGF 負載組（OGD+1 ng bFGF 組、OGD+10 ng bFGF 組和OGD+100 ng bFGF 組）進行處理。對照組細胞置于不含血清的DMEM 高糖培養基中；OGD 組造模方法參考文獻［16］，將細胞置于不含血清的DMEM 無糖培養基中，并于37 ℃、5% CO2和1% O2的低氧小室中培養4 h；OGD+不同質量bFGF 負載組置于Transwell 小室中，小室的上層為NIH3T3 細胞，細胞密度為每孔1×105mL－1，下層放入負載bFGF的水凝膠貼片，置于OGD 組相同條件下培養。

1.5 Western blotting 法檢測各組細胞中α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平收集各組NIH3T3細胞，采用含蛋白酶抑制劑的RIPA 組織/細胞裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA 蛋白質測定試劑盒于4 ℃下測定蛋白濃度，加入適量5×Loading Buffer ，金屬浴中加熱變性 5 min，迅速置于冰上， －20 ℃保存。 SDS-PAGE 分離后轉移至PVDF 膜上， 5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，TBST緩沖液洗滌，4 ℃一抗孵育過夜。TBST 緩沖液洗滌，室溫二抗孵育1.5 h。采用ECL 化學發光系統檢測，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.6 試劑盒檢測各組細胞中MDA 水平和LDH 及SOD 活性按試劑盒說明書操作，采用酶標儀于波長450 nm、532 nm、560 nm 和600 nm 處測量各組細胞A 值，描制標準曲線，以波長450 nm 處A 值計算樣本濃度，計算各組細胞中LDH 活性；以450 nm 處A 值計算各組細胞中SOD 活性；以波長532 nm 和600 nm 處A 值的差值計算各組細胞中MDA 水平。

1.7 ELISA 法檢測bFGF 體外釋放率負載bFGF 的水凝膠置于PBS 緩沖液中，分別于4 h、12 h 和24 h 后收集浸出液，按照試劑盒說明書操作，采用ELISA 法檢測bFGF 體外釋放率。采用酶標儀于波長450 nm 處測定A 值。以標準品濃度為橫坐標，A 值為縱坐標，繪制標準曲線，計算bFGF 體外釋放率。bFGF 體外釋放率=各時間點bFGF 含量（ng）/bFGF 初始含量（ng）×100%。

1.8 統計學分析采用Graphpad Prism 9.0 統計軟件進行統計學分析。本研究中所有數據均已至少3 個獨立實驗。各組細胞活性，細胞中α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平，細胞中MDA 含量和LDH 及SOD 活性均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組NIH3T3 細胞活性與空白組比較，不同浸出時間20% 明膠組和20% 明膠+戊二醛組NIH3T3 細胞活性差異無統計學意義（P>0.05），證實本研究制備的水凝膠各成分具有一定的安全性。見表1。

表1 各組NIH3T3 細胞活性Tab. 1 Activities of NIH3T3 cells in various groups(n=6，±s）

表1 各組NIH3T3 細胞活性Tab. 1 Activities of NIH3T3 cells in various groups(n=6，±s）

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2.2 各組NIH3T3 細胞中α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平與對照組比較， OGD 組NIH3T3 細胞中α-SMA 蛋白表達水平升高（P<0.05），Ⅰ型膠原蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。與OGD 組比較，OGD+1 ng bFGF 組、OGD+10 ng bFGF 組和OGD+100 ng bFGF 組NIH3T3 細胞中α-SMA 蛋白表達水平均明顯降低（P<0.01），Ⅰ型膠原蛋白表達水平均明顯降低（P<0.05 或P<0.01），并呈劑量依賴性。各組NIH3T3 細胞中Ⅲ型膠原蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1、圖2 和表2。提示負載1 ng bFGF 的水凝膠可有效調控OGD 條件下成纖維細胞的轉化和膠原蛋白表達，因此使用負載1 ng bFGF 的水凝膠進行后續實驗。

圖1 Western blotting 法檢測各組NIH3T3 細胞中α-SMA 蛋白表達電泳圖Fig. 1 Electrophoregram of expression of α-SMA protein in NIH3T3 cells in various groups detected by Western blotting method

圖2 Western blotting 法檢測各組NIH3T3 細胞中Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of expressions of type Ⅰcollagen and type Ⅲ collagen proteins in NIH3T3 cells in various groups detected by Western blotting method

表2 各組NIH3T3 細胞中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達水平Tab. 2 Expression levels of α-SMA，type Ⅰ collagen,and type Ⅲ collagen proteins in NIH3T3 cells in various groups(n=3，±s）

表2 各組NIH3T3 細胞中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達水平Tab. 2 Expression levels of α-SMA，type Ⅰ collagen,and type Ⅲ collagen proteins in NIH3T3 cells in various groups(n=3，±s）

*P<0.05 ， **P<0.01 vs control group； △P<0.05， △△P<0.01 vs OGD group.

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2.3 各組NIH3T3 細胞中MDA 水平和LDH 及SOD 活性與對照組比較，OGD 組NIH3T3 細胞中MDA 水平和LDH 活性均升高（P<0.05），SOD 活性降低（P<0.05）。 與OGD 組比較，OGD+1 ng bFGF 組NIH3T3 細胞中MDA 水平和LDH 活性降低（P<0.05），SOD 活性升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組NIH3T3 細胞中MDA 水平和LDH 及SOD 活性Tab. 3 Levels of MDA and activities of LDH and SOD in NIH3T3 cells in various groups(n=3，±s）

表3 各組NIH3T3 細胞中MDA 水平和LDH 及SOD 活性Tab. 3 Levels of MDA and activities of LDH and SOD in NIH3T3 cells in various groups(n=3，±s）

*P<0.05 vs control group；△P<0.05 vs OGD group.

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2.4 負載bFGF 水凝膠體外釋放速率在4 h 內，約10% bFGF 由水凝膠中釋放；在12 h 內，約15% bFGF 由水凝膠中釋放；在24 h 內，約21%bFGF 由水凝膠中釋放。見圖3。

圖3 ELISA 法檢測負載bFGF 水凝膠體外釋放率Fig. 3 In vitro release rate of loaded bFGF hydrogel detected by ELISA method

3 討 論

水凝膠由于其高含水量、柔軟的機械性能、良好的生物相容性和與生物組織的物理相似性可作為藥物和細胞遞送載體廣泛應用于生物醫學領域［17］。其不僅可以作為功能性物質的傳遞平臺，還可以為受損的心室壁提供機械支持，提高心肌壁的順應性。研究［18］證實：水凝膠有益于心肌梗死修復。本研究結果顯示：水凝膠制備過程中使用明膠和戊二醛均對NIH3T3 細胞活性無明顯影響。

心肌梗死發生后，成纖維細胞分化為成熟的肌成纖維細胞。肌成纖維細胞通過分泌大量ECM 蛋白維持心室壁的完整性［19］。但心肌過度纖維化和心肌內肌成纖維細胞的持續存在可導致左心室硬度增加，抑制心臟收縮。此外，過量ECM 的存在可能會降低心肌細胞氧氣和營養可用性，可致使細胞死亡，從而導致不良的心臟重塑［20-21］。

成纖維細胞中Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白是ECM 的主要成分，其中Ⅰ型膠原蛋白提供具有拉伸強度的粗纖維，Ⅲ型膠原蛋白提供具有彈性的細纖維，Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的不平衡沉積會導致心肌僵硬［22-23］。本研究結果顯示：負載bFGF 的水凝膠抑制OGD 條件下成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞過程中標志蛋白α-SMA 的表達，并下調成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白的表達，提示該載藥系統可能對心肌梗死的心肌纖維化具有一定的調控作用。

缺血性心臟病常伴有線粒體能量代謝受損和氧化應激［24］。LDH 在細胞氧化還原過程中具有重要作用，氧化應激會使細胞中LDH 活性明顯升高［25］；MDA 是脂質與氧自由基反應形成的產物，其水平代表脂質過氧化的程度；SOD 是一種生物體內清除超氧陰離子自由基重要的抗氧化酶，可以保護細胞免受氧自由基的損害。以上指標均為評估心肌梗死后氧化應激反應和細胞損傷的常用指標［26］。本研究結果顯示：負載bFGF 的水凝膠可以明顯改善OGD 條件下NIH3T3 細胞的氧化應激反應，可降低細胞上清中LDH 活性和MDA 水平，升高細胞中SOD 活性，對細胞具有保護作用。

綜上所述，基于水凝膠載藥系統在24 h 內可持續釋放bFGF，對細胞發揮長效的保護作用，可在臨床中避免多次手術干預，對患者的侵入性較小，進而可能增強bFGF 的治療效果。