模擬長期失重對白化與非白化大鼠眼部影響的比較*

危冬昱 穆玉雪 許馨月 蘇玉婷 李少衡,3 曹瑞丹 張作明 陳 濤

(1.空軍軍醫大學航空航天醫學系航空航天臨床醫學中心,西安 710032)(2.空軍軍醫大學西京醫院空勤科,西安 710032) (3.空軍軍醫大學西京醫院眼科,西安 710032)

1956年以來,我國的航天事業蓬勃發展,從順利發射自主研發的第一顆人造地球衛星“東方紅1號”到自主培養的航天員首次進入太空僅用了33年的時間。近期,我國航天員已經在空間站中開展了180 d的航天飛行。值得慶賀的同時也預示未來長期航天飛行工作將是航天員面對的重要任務。航天事業的快速發展給航天醫學帶來了嚴峻的挑戰。太空失重的環境中,由于全身體液的頭向轉移,機體各系統均受到不同程度的影響[1]。但由于現實條件限制,研究學者們廣泛采取地面尾吊大鼠模型模擬微重力環境下的機體改變[2-4]。良好的視覺功能是宇航員準確獲得外界信息并有效完成各項航天任務的重要保障。微重力暴露條件下眼部的改變一直是航天醫學的重要研究問題。在前期的實驗過程中,通過相應的眼部檢測技術,在原有尾吊大鼠模型的基礎上,建立了模擬長期失重所致眼損傷Sprague-Dawley(SD)大鼠疾病動物模型[5]。

SD大鼠屬于白化大鼠,其虹膜及視網膜色素上皮(retina pigment epithelium,RPE)細胞中均不含黑色素,因此在很多眼科疾病的研究中白化大鼠動物模型的應用嚴重受限。為了完善和補充前期建立的模擬長期微重力暴露所致眼部損傷疾病動物模型的構建方法,有必要在非白化大鼠中進行驗證。Brown-Norway大鼠(BN大鼠,非白化)其生命力強,繁殖率高,在實驗動物中運用廣泛[6]。因此,本實驗旨在BN大鼠上驗證已建立的模擬長期失重所致眼損傷動物模型構建方法,了解白化與非白化大鼠在模擬長期微重力暴露后眼部損傷是否存在差異,為該模型的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

正常雄性SD大鼠12只,體質量(170±10)g,購自空軍軍醫大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證【SCXK(陜)2019-001】;雄性BN大鼠12只,體質量(170±10)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證【SCXK(京)2016-0011】。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組:SD大鼠隨機分為正常對照組(Normal,NS組)與模型組(Model,MS組),每組6只。BN大鼠隨機分為正常對照組(Normal,NB組)與模型組(Model,MB組),每組6只。

1.2.2模擬長期失重:MS組與MB組大鼠均按已發表模型方法[5]進行造模,具體方法為:預飼養一周后,將大鼠置于大鼠固定器中,外露其尾部。尾部清潔后,依次用安息香酊和松香酊涂抹并晾干,增加尾部粘合力同時減少尾部損傷。待尾巴稍干后,準備長約20 cm的醫用膠帶將大鼠尾部吊起,使大鼠始終處于約30°頭低位,懸吊于特制的單籠中,時長為8周。懸吊期間大鼠前爪可自由活動,但后爪即使伸直也無法觸及籠的觸桿,大鼠可在籠中自由進食飲水,SD大鼠與BN大鼠實驗動物等級均為SPF級別,動物房內溫度控制在(23±1)℃,濕度控制在45%～55%,采用12 h/12 h晝夜間斷照明。8周造模結束后進行眼部視覺功能檢測,眼底照相,眼球取材并測量大鼠右下肢比目魚肌質量及體質重。

1.2.3視覺電生理檢測:提前12 h對大鼠進行暗適應,在標準暗室紅光環境下使用法國邁威視覺電生理檢查儀參照ISCEV國際標準進行視覺電生理檢測。具體操作步驟如下:常規麻醉(3 mL/kg 1%戊巴比妥鈉 + 50 μL 50%速眠新)及復方托比卡胺滴眼液散瞳后,將麻醉好的大鼠置于電生理操作臺上固定,滴入1～2滴鹽酸奧布卡因滴眼液進行眼球表面麻醉,隨后安放電極依次進行視網膜電圖(ERG)和視覺誘發電位(VEP)的檢測。ERG作用電極(Ag-Cl環狀電極)放于角膜上,參考電極(不銹鋼針狀電極)插入大鼠臉頰皮下,接地電極(不銹鋼針狀電極)插入大鼠尾部皮下。VEP記錄電極均為不銹鋼針狀電極,作用電極置于兩耳連線中心皮下,參考電極和接地電極位置同ERG。ERG結果分析時選用暗適應3.0反應b波幅值、明適應3.0反應b波幅值和OPs 反應的O2波幅值。VEP 反應分析 P2波峰時值和波幅值。

1.2.4眼底照相:ERG檢查結束后將大鼠置于升降臺上固定,用復方托比卡胺滴眼液散瞳,鹽酸奧布卡因滴眼液進行表面麻醉,擺好眼位,待瞳孔散大后(直徑4 mm)將醫用透明質酸鈉涂于測試眼角膜上,將小動物眼底成像系統(S-5000、CANADA)顯微鏡鏡頭對準瞳孔,選用白光模式,調整焦距,待成像清晰后進行拍照。每只大鼠雙眼均進行拍照。

1.2.5熒光素鈉眼底血管造影:常規眼底照相結束后,為進一步觀察BN 大鼠眼底血管有無異常改變,對BN大鼠進行熒光素鈉眼底照相,選用藍光模式,拍照方法同普通眼底照相,將10%濃度的熒光素鈉(0.1 mL/200 g)腹腔注射,于注射后1～2 min后采集眼底照片。每只大鼠雙眼均進行拍照。拍照完成后用0.9%氯化鈉溶液清洗雙眼,并用加替沙星凝膠點眼預防感染。

1.2.6視網膜切片HE染色:在活體實驗結束后,過量麻藥注射處死大鼠,取眼球,于冰上處理眼球周圍多余組織,在角膜上用細針扎一小孔,將眼球放于眼球固定液中固定,4°過夜,24 h后取出眼球,進行常規脫水并行石蠟包埋切片后完成HE染色。從視乳頭中心開始每間隔500 μm測量一次視網膜外核層厚度,直至距離視乳頭3 500 μm處。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 尾部懸吊對兩個品系大鼠體質量及比目魚肌質量的影響

如圖1所示,尾部懸吊前及懸吊8周后SD大鼠和BN大鼠的體質量與相應對照組相比無統計學差異(P>0.05),而兩個品系的模型組大鼠的比目魚肌質量與相應對照組相比明顯減輕(P<0.01),表明兩個品系的大鼠在尾部懸吊模擬失重8周后均出現了失重引起的骨骼肌的萎縮表現。

注:A.尾部懸吊前各組大鼠體質量;B.尾部懸吊8周后各組大鼠體質量;C.尾部懸吊8周后各組大鼠比目魚肌質量;**P<0.01。Note: A. Comparison of body mass between SD and BN rats before tail suspension; B. Comparison of body weight between SD and BN rats with tail suspension for 8 weeks; C. Soleus muscle mass in SD and BN rats with tail suspension for 8 weeks; **P<0.01.

2.2 尾部懸吊8周對兩個品系大鼠視覺功能的影響

如圖2,SD大鼠尾部懸吊8周后,視覺功能明顯下降,Ns與Ms組相比,暗適應3.0ERG反應b波幅值降低【(997.50±24.53)μVvs. (504.83±52.53)μV,P<0.01】、振蕩電位OPS反應O2波幅值降低【(195.00±17.25)μVvs. (70.90±8.56)μV,P<0.01】和明適應3.0ERG反應b波幅值降低【(161.50±7.94)μVvs.(80.67±2.72)μV,P<0.01】,VEP反應P2波幅值無明顯改變【(16.08±1.49) μVvs. (15.27±0.84)μV,P>0.05】,但是VEP反應P2波模型組峰時值明顯延長【(83.30±1.96)msvs. (113.83±4.07)ms,P<0.01】。而BN大鼠在尾部懸吊8周后,與相應對照組相比視覺功能無明顯改變,暗適應3.0ERG反應b波幅值、振蕩電位OPS反應O2幅值、明適應3.0ERG反應b波幅值、VEP反應P2幅值和VEP反應P2峰時值均無統計學差異(P>0.05)。

注:A.SD大鼠和BN大鼠ERG和VEP的典型波形圖;B.ERG暗適應3.0反應b波幅值統計結果;C.振蕩電位Ops反應O2波幅值統計結果;D.ERG明適應3.0反b波幅值統計結果;E.VEP反應P2波峰時值統計結果;F.VEP反應P2波幅值統計結果; **P<0.01。Note: A. Typical waveforms of ERG and VEP in SD and BN rats; B. Statistical results of the amplitude of b wave of dark-adapted 3.0 ERG;C. Statistical results of the amplitude of O2 wave of dark-adapted 3.0 oscillatory potentials; D. Statistical results of the amplitude of b wave of Light-adapted 3.0 ERG; E. Statistical results of the latency of P2 wave of VEP; F. Statistical results of the amplitude of P2 wave of VEP; **P<0.01.

2.3 尾部懸吊8周對兩品系大鼠眼底的影響

尾部懸吊8周時SD大鼠眼底未見明顯出血,視乳頭水腫等改變,模型組與對照組相比可見脈絡膜血流增多現象,尾部懸吊8周時BN大鼠眼底未見明顯視乳頭水腫、視網膜血管滲漏和脈絡膜血流增多現象(圖3)。

圖3 尾懸吊8周各組大鼠典型眼底圖像Fig.3 Typical fundus images of SD and BN rats in control group and model group after tail suspension for 8 weeks

2.4 尾部懸吊8周對兩個品系大鼠視網膜結構的影響

SD大鼠尾部懸吊8周后,大鼠視網膜外核層厚度與相應對照組相比明顯變薄(P<0.01),表現為視網膜退行性改變;而BN大鼠在尾部懸吊8周后,大鼠視網膜各層厚度與相應對照組相比無統計學差異(圖4)。

2.5 熒光素鈉眼底血管造影

尾部懸吊8周時,BN大鼠視網膜、脈絡膜血管未見滲漏等異常改變(圖5)。

圖5 尾部懸吊8 周BN大鼠熒光素鈉眼底血管造影Fig.5 FFA of BN rat after tail suspension for 8 weeks

3 討論

以往的研究[5]表明,SD大鼠在尾部懸吊模擬失重8周后可以出現以視網膜外核層變薄為特征的視網膜退行性改變。本實驗中也觀察到SD大鼠在尾部懸吊8周后視網膜的功能和結構均發生了退行性改變,再次證實了尾部懸吊模擬失重導致眼部損傷SD大鼠模型的有效性。但是,本實驗同時也觀察到BN大鼠在尾部懸吊模擬失重8周后,雖然骨骼肌已經出現了失重引起的萎縮效應(圖1),但是視網膜的結構(圖4,5)和功能(圖2)并未發生退行性改變。

SD大鼠與BN大鼠均屬于常用的封閉群實驗大鼠,這兩種品系大鼠眼部表型中最大的區別在于RPE細胞中是否含有黑色素。RPE細胞是位于視網膜光感受器底層的單層色素上皮細胞,RPE的主要功能是將營養物質和生長因子從脈絡膜毛細血管轉運至光感受器上,起到血眼屏障的作用,吞噬視網膜代謝終產物、消化光感受器外節膜盤并生成新的膜盤,從而保證光感受器的正常功能,促進損傷后的再生和修復[7-8]。RPE功能的異?？蓪е乱暰W膜色素變性、光感受細胞死亡,最終導致眼部疾病。RPE細胞中的黑色素對其周邊結構有重要的保護作用,它可吸納光感受細胞無法吸收的多余光,保護視網膜免受光產生的氧活性物質的影響。RPE中的黑色素顆粒在光照條件下對RPE和視網膜神經細胞都具有重要保護作用。同時,RPE黑色素參與眼內多種生理作用,參與視網膜和神經發育、抗光損傷等。有研究[8]表明,在同樣的光照條件下,電子顯微鏡顯示白化小鼠較非白化小鼠因缺少黑色素,視網膜外節和外核層明顯變薄,RPE結構異常,脈絡膜血管明顯萎縮。這些均說明RPE細胞中的黑色素顆粒在對抗眼內視網膜損傷過程中,發揮了重要的作用[9-10]。據此,推測兩個品系大鼠在尾部懸吊模擬失重后眼部不同的表現可能與RPE中的黑色素含量有關。

綜上所述,在利用尾部懸吊模擬失重所致眼部損傷研究時,宜選用白化大鼠進行造模,而不應選擇非白化的色素大鼠。本研究在以往建立的模擬長期失重所致眼損傷大鼠疾病動物模型的基礎上對構建方法進行必要的補充。此外,本研究也提示我們RPE中的黑色素可能是研究長期失重所致眼部損傷干預措施的重要靶點,為航天相關眼病的研究提供了新思路。