2020～2022年度上海及其他省市臨床實驗室HPV6與HPV11型核酸檢測室間質量評價結果分析

徐 幸，王國飛，楊依綃，肖艷群，周 靖（上海市臨床檢驗中心分子生物學室，上海 200126）

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種小而無包膜的雙鏈DNA 病毒[1]。DNA 序列分析發現HPV 至少有200 多個基因型，不同型別的HPV 引起不同類型的細胞病理變化[2]。HPV 分為高危型(high risk，HR)、可能高危型和低危型(low risk，LR)[3]。女性外陰感染以LR-HPV 為主，如HPV6，HPV11 等[4]。HPV6，HPV11 感染多表現為尖銳濕疣（condyloma acuminata，CA）和復發性呼吸道乳頭瘤狀?。╮ecurrent respiratory papillomatosis，RRP）等[5-6]。CA 潛伏期一般在3 周～8 個月，常以亞臨床感染形式存在，傳染性強、復發率高，臨床治療較為棘手[7-9]。RRP 是良性腫瘤，發病率約為4/100 000 萬例兒童，具有復發性、多侵犯聲門、遠處轉移、惡變可能等特點[10-11]。HPV6，HPV11 型核酸檢測在臨床已廣泛開展，檢測方法包括質譜、基因分型和PCR 定量等，臨床更多采用基因分型和PCR 定量檢測[12]。目前，國內外缺乏關于實驗室HPV6，HPV11 檢測能力的研究，本研究自2020年起通過自行制備、驗證及評價HPV6，HPV11 室間質量評價（external quality assessment,EQA）樣本，開展EQA 活動，評估參評實驗室的檢測能力，幫助實驗室分析問題，提高檢測質量。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 參評實驗室：2020～2022年間參加EQA 活動的實驗室163 家，包括全國二、三級醫療機構和第三方獨立實驗室。

1.1.2 EQA 陽性樣本：收集具有典型CA 臨床表現，HPV6，11 型核酸結果陽性患者的宮頸分泌物（上海市第一婦嬰保健院提供），混合后用生理鹽水稀釋成Ct值在22 和30 左右的兩個濃度，0.5ml/支分裝。EQA 陰性樣本：將C-33A 細胞株（中科院）培養在DMEM（含10ml/dl 胎牛血清）培養液中，置37℃，5ml/dl CO2培養箱內，2 次/周傳代，第10 代時2 000r/min 離心，收集細胞，生理鹽水重懸后調整至104個/ml，0.5ml/支分裝。

1.2 儀器與試劑 CO2培養箱（德國Memmert 公司）；ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Centrifuge 5424R 高速離心機（德國Eppendorf 公司）；DMEM 培養液，胎牛血清（Gibco 公司）；0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液(上海生工）；HPV6/11 型檢測試劑盒（上海之江）。

1.3 方法

1.3.1 EQA 方案設計：EQA 活動一年兩次，樣本盤含5 份樣本，HPV6，11 高低濃度各1 支，陰性樣本1 支，隨機編號后冷鏈至實驗室。實驗室在樣本接收起1 周內，用常規檢測系統（儀器+試劑+方法）檢測并通過網絡系統上報。

1.3.2 EQA 樣本驗證與評價

1.3.2.1 PCR+膜雜交法：抽取樣本盤一份，用HPV 分型檢測試劑盒（凱普生物，PCR+膜雜交法）檢測。陽性：Biotion 對照和HPV 雜交點同時顯色，陽性點為清晰可見藍色原點。陰性：只有Biotion對照及內對照（IC）顯色。結果判讀見圖1。

圖1 PCR+膜雜交法結果判讀圖

1.3.2.2 實時熒光PCR 法(qPCR 法)：抽取樣本盤一份，用HPV6/11 型核酸測定試劑盒（上海之江）檢測。陰性質控Ct值：UNDET 或40，陽性質控：Ct值≤35。陽性：待測樣本Ct值≤38，擴增曲線呈典型S 型。陰性：非典型S 型。

1.3.2.3 PCR 毛細電泳片段分析法：抽取樣本盤一份，用HPV 核酸檢測及基因分型試劑盒[PCR 毛細電泳片段分析法（海爾施基因）]檢測。有效樣本的結果中應出現pcDNA（峰高≥500RFU）和β-globin特異峰。因細胞量太少導致未出現β-globin 特異峰，但出現特異HPV 型別的峰時，仍為有效樣本。陽性對照峰高：750RFU～15600RFU。陽性：特異HPV型別的峰高≥300RFU。

1.3.2.4 均勻性評價：參照CNAS-GL003：2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》要求，從能力驗證樣品中隨機抽取HPV6，HPV11 高低濃度樣本各10 支，用試劑盒（上海之江）檢測，每支樣本重復檢測2 次。

1.3.2.5 穩定性評價：參照CNAS-GL003：2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》要求，選取同一批號HPV6，HPV11高低濃度、陰性樣本各6支，2～8℃保存7 天，在結果上報截止日前后3日內，用試劑盒（上海之江）檢測，每支樣本重復檢測1 次。

1.4 統計學分析 依據回報結果統計參評實驗室的得分，回報結果與預期相符計20 分，與預期不符計0 分，得分≥80 分EQA 成績合格，＜80 分不合格。采用Microsoft Excel 2016 軟件作為數據統計分析工具，計算實驗室的合格率、樣本總體符合率、假陽性率和假陰性率。

2 結果

2.1 EQA 樣本驗證與評價結果

2.1.1 PCR+ 膜雜交法：見圖2。結果依次為HPV6，HPV6，HPV11，HPV11，陰性，均符合預期靶值。

圖2 PCR+膜雜交法結果圖

2.1.2 qPCR 法：見圖3。結果均符合預期靶值。

圖3 qPCR 法擴增曲線圖

2.1.3 PCR 毛細電泳片段分析法：見圖4。結果依次為HPV6，HPV6，HPV11，HPV11，陰性，均符合預期靶值。

圖4 PCR 毛細電泳片段分析結果圖

2.1.4 EQA 樣本均勻性和穩定性評價：采用qPCR

法進行檢測，結果均符合預期靶值，見圖5，圖6。表明樣本具有良好的均勻性和穩定性，可滿足樣本發放和傳遞的要求。

圖5 均勻性評價qPCR 法擴增曲線圖

圖6 穩定性評價qPCR 法擴增曲線圖

2.2 參評實驗室結果回報 2020～2022年共計發出樣本盤163 份，收回有效報告140 份，有效回報率依次為90.91%(40/44)，80.95%(51/63)和87.50%（49/56）。參評實驗室使用最多的試劑品牌為湖南圣湘，其次為上海之江。實驗室最常用的方法為qPCR 法，占84.29%（118/140）,其次是雜交法10.71%（15/140）和電泳法5.00%（7/140）。

2.3 EQA 結果 實驗室總體合格率為96.43%（135/140），三年間合格率依次為92.5%(37/40)，98.04%(50/51)和97.96%（48/49）。樣本總體符合率97.86%（685/700），共15 個檢測錯誤，假陰性率1.86%(13/700)，假陽性率0.29%（2/700）。弱陽性10 個，占假陰性結果的76.92%（10/13）。預期靶值、符合率、假陽性率及假陰性率見表1。

表1 樣本靶值、符合率、假陽性率及假陰性率[%（n）]

3 討論

準確檢出HPV6，11 感染對診斷尖銳濕疣（CA）和復發性呼吸道乳頭瘤狀病(RRP)具有重要意義，隨著基因檢測的檢出限越來越低，檢測結果的準確度和可靠性也越來越受到挑戰。稀釋低濃度水平核酸樣品，擴增定量和傳感過程中引入的偏差都給最終結果帶來很大的不確定度[13]。

本研究通過組織EQA 活動，對實驗室檢測質量進行有效評估。報告顯示，錯誤集中在假陰性，造成的原因較為復雜，可總結以下幾點：①試劑儲存或運輸條件不當導致Tag DNA 聚合酶活性不足或喪失；②實驗人員操作不當：未充分混勻樣本和抽提液致核酸獲得率低；③離心機離心效果差導致未分離出目標DNA；④PCR 擴增儀溫控、燈源損壞或未正確設置擴增程序等導致擴增失??；⑤一次性耗材存在PCR 抑制劑。建議實驗室從以下幾個方面改進：①使用弱陽性樣本進行試劑質檢，增加弱陽性質控；②規范實驗操作,強化人員培訓,完善實驗室質量管理體系、保證合理分區[14]；③定期校準設備如離心機、金屬浴、移液器等；④使用蒸餾水浸泡沖洗、高壓滅菌后的一次性耗材，消除或部分消除外源性抑制劑的影響[15]。

值得關注的是，第3 輪EQA 活動中一家實驗室出現了2 個弱陽性樣本假陰性。實驗室使用試劑A（無內標，qPCR 法），陰陽性質控在控，儀器與試劑均在效期內。錯誤原因為實驗人員在抽提核酸時未離心EQA 樣本，直接向樣本管內加入核酸抽提劑，核酸產物未達試劑A 檢測下限（1×103copies/ml）。第5輪EQA 活動中，一家實驗室同樣出現了2 個弱陽性樣本假陰性，該實驗室使用試劑B（外源性內標，qPCR 法），陰陽性質控、內標結果均在控，該內標可監測因核酸提取及擴增過程中PCR抑制物、儀器及耗材的不良影響而造成的假陰性。需要注意的是，因外源性內標在反應中會與目的基因產生競爭性關系，對反應過程產生影響[16]，若靶標檢測結果為陰性，即使外源性內標結果正常也應警惕因提取或擴增效率不足所致的假陰性。第5 輪EQA 中，一家實驗室出現了1 個弱陽性樣本假陰性，該實驗室使用試劑C（內源性內標，PCR+膜雜交法），陰陽性質控在控，假陰性結果的內標信號未起線。在排除樣本保存不當、核酸降解等因素后，推測原因為不良的提取或擴增過程導致該孔擴增失敗。建議實驗室關注內標情況，若內標信號未起線，無論靶基因有無曲線，均提示實驗環節出現問題，實驗室應尋找原因，復檢樣本，防止發生檢測錯誤。

假陽性的原因可能是：①人員操作(如交叉污染)或實驗室污染(如氣溶膠)[17]；②PCR 儀的性能差異等質量問題造成非特異擴增。建議實驗室：①若存在核酸污染，第一時間查找污染源和污染原因，明確原因后采取有效的去污染措施[18]；②加強人員培訓，增加陰性質控數量并隨機擺放，對儀器進行清潔和去核酸，不同分區使用各自的清潔用具以防交叉污染，對使用后的實驗室清潔消毒[19]；③試劑配制、核酸提取、PCR 擴增等環節按要求分區操作；④檢測系統使用前進行方法學性能驗證；⑤因參評實驗室收到的樣本編號不同，不排除實驗室之間比對數據，上傳錯誤的實驗結果。

本研究使用的EQA 樣本為稀釋的臨床樣本與培養的細胞株制成，可最大程度模擬臨床樣本監督實驗室檢測質量。不足的是低濃度樣本Ct值在30左右，無法評估實驗室檢測更低濃度臨床樣本的能力。中心擬在2023年EQA 計劃中改進此不足，制備發放更低濃度的EQA 樣本，進一步幫助實驗室提高此方面的檢測質量。

綜上所述，大部分實驗室檢測HPV6，11 能力良好，個別實驗室弱陽性樣本的檢出能力有待提高。分析EQA 長期數據后發現，參加時間越久，實驗室檢測能力提高越明顯[20]。EQA 活動中出現錯誤的實驗室在下一次活動中均未再發生相同的錯誤，說明實驗室通過參加EQA 活動能夠發現檢測過程中的不足，在分析原因并做好糾正措施后，可有效提高檢測質量，為臨床治療及用藥提供有力的幫助。