基于TMT蛋白組學分析姜黃素對熱應激蛋雞肝臟抗氧化性能的影響

楊銘宣,劉夢杰,王晉,虞德兵

(南京農業大學動物科技學院,江蘇 南京 210095)

長期高溫和過度溫暖的環境會造成動物的應激反應,直接或間接影響動物各種生理狀態,進而影響動物生產性能[1-2]。熱應激會促進畜禽機體的產熱,從而導致凝血障礙、腦組織損傷、心血管系統功能障礙、內毒素血癥、代謝紊亂以及多系統器官衰竭等不良反應產生,對內分泌系統、神經-消化系統、免疫系統和泌尿生殖系統等都會造成影響[3]。研究發現熱應激會導致蛋雞的死亡率增加,飼料效率以及雞蛋的產量和質量下降[4]。之前有研究表明,高溫飼養的蛋雞與常溫飼養相比,活體重(LWG)和飼料轉化率(FCR)分別降低了14.6%和14.3%[5]。因此緩解蛋雞在飼養過程中的熱應激現象是養雞業亟待解決的重要問題之一。

在飼料中添加一些植物提取物,如蘆丁、白藜蘆醇和茶多酚等是蛋雞生產中常用的一種抗氧化應激方式。姜黃素(curcumin)是姜黃中的主要成分,姜黃素具有多種生物學特性,包括抗氧化、抗炎、抑制脂質過氧化、抗病毒、抗微生物、抗腫瘤和清除自由基等[6-7]。前人研究發現姜黃素可以抑制脂質過氧化并中和體內的ROS(超氧化物、過氧化氫、羥基自由基),對機體的氧化應激有一定的保護作用[8]。動物試驗證明,姜黃素可提高家禽免疫機能,同時還可以起到改善脂類代謝和腸道健康,提高生產性能等作用。胡忠澤等[9-10]研究發現,日糧中添加姜黃素能顯著提高肉雞的日增重和采食量,降低料重比,能顯著促進肉雞胸腺的生長發育和增加血清中免疫球蛋白的含量。近幾年,姜黃素被發現可以緩解肉雞養殖過程中的熱應激反應,但潛在的分子調控機制尚不清楚。

蛋白質組學(proteomics)技術是將蛋白質組作為研究對象,在疾病的早期診斷,預后和監測疾病的發展中起到至關重要的作用[11]。蛋白質作為生物學功能的效應物,其水平不僅取決于相應的mRNA水平,而且還取決于宿主的翻譯控制和調控。因此,蛋白質組學被當作解釋生物系統的最有力的數據集[12]。串聯質譜標記(tandem mass tags,TMT)的分析方法已經成為蛋白質定量的主流方法[13]。TMT是一種化學標記,可用于定量和鑒定蛋白質、肽、核酸和其他生物大分子[14]。TMT的化學結構雖然相同,但每個都包含在不同區域被取代的同位素。在片段化過程中獲得了生物分子序列信息,同時獲得了生物分子的數量,這使得TMT成為高通量表征外泌體蛋白的理想工具[15]。蛋白質組學現已成為研究整體蛋白質功能和信號通路的最重要方法之一[16]。近年來,蛋白質組學已被廣泛用于豬、奶牛、海洋動物以及肉雞的研究,也被用于評估牲畜適應熱應激的能力[17]。因此,本試驗旨在利用蛋白組學技術篩選與熱應激相關的肝臟分子標記物,進而為在蛋白質水平上解釋姜黃素對蛋雞熱應激的緩解作用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設計

試驗動物由江蘇省南京市南京盤滁機械化養雞場提供。選取180只280日齡體況基本一致的海蘭蛋雞隨機分成3組,每組4個重復,每個重復15只雞。對照組(Con)飼喂基礎飼糧,環境溫度為(24±2)℃;熱應激組(HS)是基于對照組的基礎上每天維持熱應激6 h以上,平均溫度為(34±2)℃;姜黃素組(HS+CUR)飼喂在基礎飼糧中添加姜黃素的試驗飼糧,環境溫度同熱應激組。

試驗蛋雞均保證自由采食和飲水,恒定光照時間為16 h,自然通風,每隔2 d清糞1次。參考本實驗室之前的研究,姜黃素的合適劑量為150 mg·kg-1[18]。

1.2 試驗方法

1.2.1 TMT標記從3組蛋雞中隨機選取9個樣本用于蛋白組學測定,稱取150 mg肝臟組織樣品,采用蛋白裂解試劑盒提取蛋白質并采用BCA試劑盒測定濃度。按蛋白、酶的質量比為20∶1加入胰酶,在 37 ℃環境溫度下酶解4 h。胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除鹽后真空冷凍干燥,以 0.5 mol·L-1TEAB溶解肽段,之后按照試劑盒說明書對肽段進行TMT標記,簡單操作如下：標記試劑解凍后用乙腈溶解,與肽段混合后室溫孵育2 h,標記后的肽段混合后除鹽,真空冷凍干燥。將標記過的各組肽段混合,進行HPLC分級肽段,對每組樣品進行液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)分析,LC-MS/MS的具體流程參考Biancotto等[19]的方法。二級質譜數據使用 Maxquant v1.5.2.8進行檢索,數據庫為Gallus gallus(共30 252條序列)。利用 InterProScan v.5.14-53.0對鑒定到的差異蛋白進行 GO 注釋,包括3個方面：生物學過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF);利用KEGG Mapper V2.5軟件對差異蛋白進行KEGG通路注釋;通過Wolfpsort v.0.2來分析差異蛋白亞細胞定位;利用Perl module v.1.31進行差異蛋白的功能富集分析[20-21]。

1.2.2 實時熒光定量PCR分析用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取肝臟組織總RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix Reagent試劑盒(TaKaRa,大連),通過逆轉錄合成cDNA。查閱NCBI數據庫,根據GenBank中收錄雞的相關基因mRNA序列,用Primer 5.0軟件設計引物,引物序列見表1。實驗結果剔除非正常值后取3個重復的平均CT值,通過內參基因β-actin校正后,用2-ΔΔCT法分析基因表達情況。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of the target genes

1.3 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 姜黃素對熱應激蛋雞肝臟抗氧化基因表達的影響

由圖1可見,熱應激極顯著抑制蛋雞肝臟中SOD1和GPX1的表達(P<0.01),顯著抑制CAT表達(P<0.05),而熱應激狀態下補充姜黃素后蛋雞肝臟中SOD1和CAT表達水平與熱應激組相比分別增加35.66%(P<0.01)和79.54%(P<0.05),GPX1表達水平是熱應激組的14.26倍(P<0.01)。結果表明熱應激誘導蛋雞肝臟抗氧化功能降低,而添加姜黃素可以緩解這一現象。

圖1 姜黃素對熱應激蛋雞肝臟 抗氧化基因表達的影響Fig.1 The effect of curcumin on the expression of antioxidant genes in the liver of heat-stressed laying hens Con：對照組Control group;HS：熱應激組Heat stress group;HS+CUR：姜黃素組Curcumin group. *P<0.05,**P<0.01. 下同The same as follows.

2.2 蛋雞肝臟蛋白鑒定的結果分析

采用TMT蛋白組學分析技術測定了蛋雞肝臟的蛋白質圖譜,通過質譜分析共得到313 208張二級譜圖,可利用有效譜圖數為66 217,譜圖利用率為21.1%。通過譜圖解析共鑒定到36 789條肽段,其中特異性肽段為 34 549。共檢測到5 039個蛋白,其中4 235個具有定量信息。為了更加深入揭示不同組肝臟的蛋白差異,分別定量比較了差異蛋白表達量,結果見表2。

表2 差異表達蛋白統計信息Table 2 Differentially expressed protein statistics

2.3 不同組別比較的GO二級分析

從圖2可知：在HS+CUR vs Con和HS+CUR vs HS中,差異表達蛋白參與的生物學過程(BP)主要有代謝過程(metabolic process)、單一生物過程(single-organism process)和細胞進程(cellular process)等GO條目;DEG在細胞組分(CC)中主要有細胞(cell)、細胞器(organelle)、膜(membrane)、大分子復合物(macromolecular complex)等GO條目;在分子功能(MF)中主要是催化活性(catalytic activity)和結合(binding)等GO條目。

圖2 GO二級注釋的分布圖Fig.2 Statistical distribution chart of GO category(2nd level)A. HS+CUR group vs Con group;B. HS+CUR group vs HS group.

2.4 不同組別比較的KEGG通路富集分析

對差異表達蛋白進行KEGG 通路富集分析(圖3)發現：HS+CUR組和Con組比較過氧化物酶體(peroxisome)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、脂肪細胞因子信號通路(adipocytokine signaling pathway)、藥物代謝-細胞色素P450(drug metabolism-cytochrome P450)、甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)等通路被顯著富集(P<0.05);HS+CUR組和HS組比較氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、藥物代謝-其他酶(drug metabolism-other enzymes)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine,serine and threonine metabolism)、細胞黏附分子(CAM)、藥物代謝-細胞色素P450(drug metabolism-cytochrome P450)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)等通路被極顯著富集(P<0.01)。

圖3 差異表達蛋白在KEGG通路中富集分布氣泡圖Fig.3 KEGG pathway enrichment bubble plot of differentially expressed proteinsA. HS+CUR group vs Con group;B. HS+CUR group vs HS group.

2.5 差異顯著蛋白表達及其mRNA表達的比較分析

生物體中的基因組是遺傳信息的存儲,mRNA是基因表達的前提,蛋白質水平是基因功能的執行者。根據差異表達蛋白亞細胞不同的定位,選擇分布在細胞核、細胞質和細胞外的15種差異顯著表達蛋白質進行RT-qPCR分析,以驗證蛋白組結果的可靠性。結果如表3和圖4所示,15種蛋白質在基因水平上具有與蛋白組結果中相似的變化趨勢。

圖4 肝臟中基于TMT蛋白組學篩選的不同亞細胞定位差異表達顯著蛋白相關基因mRNA水平的表達變化Fig.4 Different sub-cellular positioning differences based on the TMT protein group expressed significant protein-related genes in the liver mRNA level in the liver A. 細胞核Nucleus;B. 細胞質Cytoplasm;C. 細胞外Extracellular. 將對照組中的數據設置為1.0,得到的數值是每組的

表3 蛋白組學分析挑選的差異表達顯著蛋白Table 3 Differential expression significant protein selected by proteome

3 討論與結論

動物擁有針對熱應激的生理機制,以保護不同細胞的功能。各器官對這種與熱應激相關損傷的反應和敏感度不同,而肝臟作為主要的代謝和產熱器官,是熱應激的主要靶器官,可控制長時間受熱應激影響的許多生理過程。研究已經證實熱應激可能誘發肝損傷[22]。在熱應激條件下,已經證明肝臟組織超微結構發生改變,肝細胞部分變性,壞死并伴有凋亡增加[23]。但目前尚不清楚熱應激如何在蛋白質水平上影響肝臟各種生理過程。在本研究中,我們發現與對照組相比,熱應激組蛋雞肝臟抗氧化指標SOD1、CAT和GPX1 mRNA的表達水平顯著降低,意味著(34±2)℃溫度下蛋雞發生了熱應激。姜黃素作為一種植物提取物,具有抗氧化、抗炎、抑制脂質過氧化等作用。在我們的研究中發現添加姜黃素顯著增加由熱應激引起的SOD1、CAT和GPX1的降低水平。據報道,姜黃素可以通過減少ROS的產生和脂質過氧化來維持線粒體功能,防止超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)的活性降低[24]。也有研究證明,姜黃素可以逆轉受熱應激的抗氧化活性表達的下調[25],這與本研究得到的結果一致。因此,姜黃素可以有效抑制由高溫引起的蛋雞熱應激。

為了進一步在蛋白水平上研究姜黃素對蛋雞熱應激緩解作用的分子機制,我們利用TMT蛋白組學技術在蛋雞肝臟組織中篩選得到與熱應激相關的差異表達蛋白,并進一步進行生物信息學分析。本研究挑選了不同亞細胞定位的15個表達顯著的差異蛋白進行RT-qPCR驗證,得到的基因水平結果與蛋白組學分析結果保持一致,證明蛋白組學結果的可靠性。

KEGG通路富集分析結果提示差異表達蛋白參與了PPAR信號通路和過氧化物酶體,過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1家族的3個主要成員(PPARGC-1α,PPARGC-1β和PRC),其在能量代謝調節、維持葡萄糖穩態和脂質代謝中發揮著關鍵作用,PPARGC-1β作為其成員的重要組成部分,是線粒體氧化能量代謝和抗氧化防御的主要調控因子[26]。研究發現其與多種生物學過程相關并且參與多種疾病的發生,諸如肝脂肪變性、糖尿病和心肌病等。PPARGC-1β基因是一種調控基因轉錄的共激活劑,對轉錄因子和核受體活動、脂肪氧化、糖酵解以及能量代謝等多種生物學過程具有調控作用[27]。本研究結果表明熱應激狀態下的蛋雞肝臟PPARGC-1β表達顯著降低,添加姜黃素可以促進PPARGC-1β的表達。

HSP通過調節細胞穩態并促進細胞存活而充當分子伴侶,HSP40(DnaJ)是HSP70在調節ATP水解中的伴侶[28]。本研究中,DnaJB1和HSP70蛋白差異表達水平顯著升高,補充姜黃素后DnaJB1和HSP70的表達水平與熱應激組相比顯著減少。檢測肝臟mRNA表達的結果顯示DnaJB1和HSP70的變化趨勢一致,DnaJB1的表達對HSP70具有依賴性。據報道,HSP70蛋白通過肝臟線粒體途徑增加,最終導致細胞凋亡[29]。本研究結果顯示熱應激組蛋雞肝臟的HSP70表達水平與對照組和姜黃素組相比均顯著升高,這與da Silva等[30]研究結果一致。本研究結果表明添加姜黃素可以調節HSP相關蛋白的表達,但其作用機制還有待進一步研究。

MAPK在信號傳導的信號程序中起多種功能作用,導致特定細胞類型的增殖、運動、溫度變化和存活以及各種生理過程[31]。有研究表明MAPK可以在熱應激下維持細胞的氧化還原穩態[32]。本研究差異蛋白分析結果顯示,姜黃素組與對照組和熱應激組相比,核因子κB激酶亞基β(IKBKB)的表達在飼喂姜黃素后顯著增加,其參與NF-κB和MAPK信號通路調節。參與MAPK信號通路調節的相關蛋白還包括Nik相關激酶(NRK),其表達水平與其他2組比較在姜黃素組顯著升高。這些結果都提示姜黃素緩解蛋雞肝臟氧化應激可能是通過參與MAPK和NF-κB信號通路來實現的。

脂質代謝是肝臟最重要的代謝過程之一,正常的脂質代謝與機體健康密切相關。肝臟中脂質代謝的失調可使肝脂肪變性,導致慢性脂肪性肝炎[33]。本研究結果表明,熱應激組與對照組相比載脂蛋白A-1(APOA1)表達水平顯著升高,飼喂姜黃素能緩解熱應激狀態下蛋雞肝臟載脂蛋白A-1的表達下調。載脂蛋白A-1是高密度脂蛋白的主要結構和功能蛋白成分,主要由肝細胞在肝臟中產生[34]。本研究證明了飼喂姜黃素可以有效保護熱應激對蛋雞肝臟脂質代謝的影響。

綜上,姜黃素可改變蛋雞肝臟熱應激和氧化應激相關蛋白的表達,本研究相關結果可為探索夏季蛋雞肝臟熱應激機制提供試驗基礎,下一步研究中可通過檢測蛋雞肝臟中上述幾種蛋白的表達水平變化,進一步敲除編碼這些蛋白的基因,以驗證其在熱應激及氧化應激過程中發揮的具體作用。